rNPY Y1 receptor (Ki = 1.1 nM); hNPFF2 (Ki = 79 nM); rNPFF (Ki = 108 nM)

在本研究中，研究人员发现在NPY家族的几个配体中，青蛙PP、GR231118和BIBP3226能够竞争CHO细胞和大鼠脊髓背中表达的特异性NPFF结合。有趣的是,明显的选择性NPY Y1 / Y4配体的亲和力GR231118 NPFF2受体(Ki = 50 - 70 nM)与NPY的良好亲和力Y2 (Ki = 63海里)和日元(Ki = 100海里)受体(帕克et al ., 1998和表1)。此外,明显的亲和力(Ki大约100海里)的选择性NPY Y1受体拮抗剂BIBP3226NPFF2远远大于那些报道NPY受体Y2, Y4和Y5受体(Schober et al ., 1998;Dumont等人，2000c和表1)。此外，我们观察到fPP及其截断类似物fPP28-36对NPFF受体的亲和力相对较高（Ki=1.5 - 7 nM）。这可能是由于在肽的c端存在arg - fe -酰胺残基，而不是在所有哺乳动物胰腺多肽以及NPY和PYY中常见的arg - tyr -酰胺残基。据我们所知，文献中没有关于fPP对NPY受体亚型亲和力的数据。有趣的是，研究人员观察到BIBP3226和fPP对CHO细胞中表达的hNPFF2受体和大鼠脊髓受体(怀疑是NPFF2受体亚型；Bonini et al., 2000)，比HEK 293细胞中表达的人类和大鼠NPFF2受体要好10倍（Bonini et al., 2000）。这种明显的差异还有待解释。[1]
在转染hNPFF2受体的细胞中，通过环AMP积累实验研究fPP、GR231118和BIBP3226的功能特性。有趣的是，fPP和GR231118表现出激动作用。虽然GR231118的效力比NPY Y4受体低500 - 1000倍(Parker et al., 1998；Schober et al., 1998)，与描述的Y2和Y5 NPY受体的范围顺序相同（Parker et al., 1998）。另一方面，Y1拮抗剂BIBP32266在10 μM范围内本身无活性，能够以浓度依赖性的方式拮抗NPFF （10 nM）诱导的福斯可林刺激的环状AMP产生的抑制。因此，BIBP3226是第一个被报道的NPFF2受体拮抗剂，因此可以被认为是开发更有效的NPFF2受体亚型拮抗剂的先导化合物。［１］

在较大剂量下，BIBP3226（0.5、5 μg；icv；雄性 Wistar 大鼠）具有抗焦虑样作用 [1]。

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研究了新型非多肽神经肽yy1受体拮抗剂BIBP3226 N2-（二苯基乙酰基）- n-[（4-羟基苯基）-甲基]- d -精氨酸酰胺对大鼠高架+迷宫探索行为的影响。BIBP3226（0.5和5微克，i.c.v）在高剂量下诱导了类似焦虑的作用。这种作用被地西泮（0.5 mg/kg）拮抗。BIBP3226的焦虑样作用与一般运动活动的降低无关。这些发现支持神经肽yy1受体亚型参与焦虑调节的假设。[2]

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本研究的目的是研究BIBP3226对探索性行为的影响，并验证体内神经肽yy1受体阻断会导致焦虑症状出现的假设。 从拉脱维亚Grindex购买的雄性Wistar大鼠（270-350 g）在标准实验室条件下饲养，并植入针对侧脑室的慢性注射管。术后1周开始行为学实验。BIBP3226在试验前20分钟静脉注射，30分钟注射地西泮0.5 mg/kg。加迷宫和开放场地试验设计与其他地方（Harro et al., 1990）描述的一样，但在迷宫的张开臂上增加了1厘米的壁架。 如表1所示，BIBP3226在5 μg剂量下产生了类似焦虑的作用，而较低剂量则无效。在第二个实验中，我们发现地西泮（0.5 mg/kg）的剂量本身对探索性参数没有影响，因为单次治疗完全阻断了神经肽yy1受体拮抗剂的焦虑样作用。在加迷宫测试后，大鼠立即进行了4分钟的开放场测试。由于所有治疗组的整体运动活动相似（数据未显示），BIBP3226的焦虑谱及其与地西泮的拮抗作用不能解释为由于神经毒性作用而导致的一般运动活动的变化。在第二次实验中，i.p.注射在i.c.v.注射之前，动物的整体活性更高。这种探索行为的增加可能发生在动物在测试前被处理或暴露于其他刺激时（Hogg, 1996）

将转染后的HEK 293细胞保存在添加10%胎牛血清和两性霉素b的Dulbecco改良Eagle培养基中。所有NPY结合试验均按先前描述进行（Dumont等，2000年a）。[1]
表达人NPFF2受体的重组CHO细胞在含7%胎牛血清和G418 400 μg ml−1的Ham’s F12培养基中生长。为了制备膜，细胞在磷酸盐缓冲盐水中收获，在- 70°C冷冻，并在波特Elvehjem组织研磨机中用50 mM Tris-HCl， pH 7.4均质。4℃下1000×g离心15 min丢弃核球，4℃下100,000×g上清离心30 min收集膜组分。NPFF受体特异性放射配体[125I]-EYF （[125I]-EYWSLAAPQRF-NH2）的结合(2000 Ci摩尔；gouardires et al., 2001)对表达CHO细胞的hNPFF2受体的膜（2 μg）进行快速过滤测定（gouardires et al., 2001）。在大鼠（雄性Sprague-Dawley， 350 g）脊髓切片中，NPFF受体的结合与gouard等人（2001）的描述完全一致。[1]
细胞内环AMP的测定基本上按照Mollereau等人，1999年所述进行。简单地说，将20万个重组细胞在Ham’s F12培养基中，在37℃、5% CO2、0.6 μCi [3H]-腺嘌呤（26 Ci/ mol Amersham）中孵育1 h。在含有0.1 mM磷酸二酯酶抑制剂IBMX和Ro-20 1724的情况下，在200 μl HEPES缓冲的Krebs-Ringer盐水中，37°C下，用2 μM Forskolin刺激循环AMP产生10分钟。待测配体以所需浓度同时加入。加入20 μl HCl 2.2 N停止反应，在酸性氧化铝柱上分离胞内[3H]环AMP。[1]

动物/疾病模型：雄性Wistar大鼠270-350克[1]
剂量：0.5、5微克
给药途径：脑室内注射
实验结果：5微克剂量可引起焦虑样效应，而较低剂量无效。

[1]. Agonist and antagonist activities on human NPFF(2) receptors of the NPY ligands GR231118 and BIBP3226. Br J Pharmacol. 2001 May;133(1):1-4.

[2]. Anxiogenic-like effect of the neuropeptide Y Y1 receptor antagonist BIBP3226: antagonism with diazepam. Eur J Pharmacol. 1996 Dec 19;317(2-3):R3-4.

研究结果支持内源性神经肽Y可通过激活神经肽Y Y1受体来减轻新异恐惧/焦虑的假设。苯二氮卓类药物地西泮是一种临床有效的抗焦虑药物，它能拮抗BIBP3226的致焦虑样作用。这表明神经肽Y能神经传递可能与GABA能系统密切相关。从神经解剖学角度来看，这种相互作用可能涉及皮层区域，因为许多对神经肽Y具有免疫反应性的皮层神经元也含有GABA（Hendry等人，1984）。有研究提出，当动物暴露于新环境时，神经元会在高频放电期间释放神经肽Y（Lundberg等人，1986）。神经肽Y本身或其他作用于神经肽Y Y1受体的内源性配体可能对适应新环境和正常探索行为的表达至关重要。因此，使用BIBP3226阻断神经肽Y Y1受体可能干扰了适应过程并导致焦虑的表达。
总之，这些结果证实了神经肽Y Y1受体参与调节大鼠的探索行为和（或）焦虑。BIBP3226似乎是一种研究神经肽Y Y1受体在情绪过程中作用的有用化合物。[2]

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在本研究中，我们发现，在几种NPY家族配体中，蛙PP、GR231118和BIBP3226能够竞争性地结合CHO细胞以及大鼠背脊髓中表达的特异性NPFF。有趣的是，选择性NPY Y1/Y4配体GR231118对NPFF2受体的表观亲和力（Ki=50-70 nM）与其已知的对NPY Y2（Ki=63 nM）和Y5（Ki=100 nM）受体的亲和力相当（Parker等人，1998；表1）。此外，选择性NPY Y1受体拮抗剂BIBP3226对NPFF2受体的表观亲和力（Ki约为100 nM）远高于已报道的对NPY Y2、Y4和Y5受体的亲和力（Schober等人，1998；Dumont等人，2000c；表1）。此外，我们观察到fPP及其截短类似物fPP28-36对NPFF受体具有相对较高的亲和力（Ki=1.5 – 7 nM）。这可能是由于肽链C端存在Arg-Phe-酰胺残基，而非所有哺乳动物胰多肽以及NPY和PYY中常见的Arg-Tyr-酰胺残基。据我们所知，文献中尚无关于fPP对NPY受体亚型亲和力的数据。有趣的是，我们观察到BIBP3226和fPP对CHO细胞中表达的hNPFF2受体以及大鼠脊髓受体（推测为NPFF2受体亚型；Bonini等人，2000）的亲和力比报道的HEK 293细胞中表达的人和大鼠NPFF2受体的亲和力高10倍（Bonini等人，2000）。这种明显的差异仍有待解释。
接下来，我们基于hNPFF2受体转染细胞中的环磷酸腺苷（cAMP）积累测定，研究了fPP、GR231118和BIBP3226的功能特性。有趣的是，fPP和GR231118均表现出激动活性。尽管GR231118的效力比NPY Y4受体的效力低500-1000倍（Parker等人，1998；Schober等人，1998），但与NPY Y2和Y5受体的效力处于同一数量级（Parker等人，1998）。另一方面，Y1拮抗剂BIBP3226本身在浓度高达10 μM时无活性，但能够以浓度依赖的方式拮抗NPFF（10 nM）诱导的福斯克林刺激的环磷酸腺苷（cAMP）生成的抑制作用。因此，BIBP3226是首个报道的NPFF2受体拮抗剂，因此可被视为开发更有效的NPFF2受体亚型拮抗剂的先导化合物。
我们的数据表明，NPFF受体不仅在序列同源性上与NPY（尤其是Y1和Y4）受体相关，而且在结合亲和力和功能特性上也存在关联。这两个受体家族可能都保留了一个祖先结合口袋，该口袋已进化为Arg-Phe-酰胺或Arg-Tyr-酰胺相互作用。这一假设应通过详细的诱变和构效关系研究进行验证。
已知NPY激动剂可刺激食欲（Dumont等人，2000c）。相比之下，关于NPFF对摄食行为影响的唯一报道描述了其可减少大鼠的食物摄入量（Murase等人，1996）。同样，GR231118 虽然作为 NPY Y4 激动剂发挥作用，但研究发现它能降低大鼠的食物摄入量（Schober 等，1998）。这种效应是否是由于与 NPFF 受体亚型相互作用所致，需要在未来的研究中加以探讨。
总之，我们的研究结果描述了首个 NPFF 受体拮抗剂（BIBP3226），并提示在使用 BIBP3226 和 GR231118 这两种化合物研究 NPY 受体时，它们之间可能存在与 NPFF 受体的交叉反应。

473.56674

473.243

159013-54-4

BIBP3226 TFA;1068148-47-9

5311023

Typically exists as solid at room temperature

4.561

140.33

5

4

11

35

658

1

N=C(N)NCCC[C@H](C(NCC1=CC=C(O)C=C1)=O)NC(C(C2=CC=CC=C2)C3=CC=CC=C3)=O

KUWBXRGRMQZCSS-HSZRJFAPSA-N

InChI=1S/C27H31N5O3/c28-27(29)30-17-7-12-23(25(34)31-18-19-13-15-22(33)16-14-19)32-26(35)24(20-8-3-1-4-9-20)21-10-5-2-6-11-21/h1-6,8-11,13-16,23-24,33H,7,12,17-18H2,(H,31,34)(H,32,35)(H4,28,29,30)/t23-/m1/s1

(2R)-5-(diaminomethylideneamino)-2-[(2,2-diphenylacetyl)amino]-N-[(4-hydroxyphenyl)methyl]pentanamide

BIBP3226; BIBP 3226; 159013-54-4; BIBP-3226; (2R)-5-(diaminomethylideneamino)-2-[(2,2-diphenylacetyl)amino]-N-[(4-hydroxyphenyl)methyl]pentanamide; CHEMBL332347; MFCD00938562; (2R)-5-(diaminomethylideneamino)-2-[[2,2-di(phenyl)acetyl]amino]-N-[(4-hydroxyphenyl)methyl]pentanamide;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。