GSK-3β (IC50 = 6.7 nM); GSK-3α (IC50 = 10 nM); ATM (cdc2 = 8800 nM)
Glycogen Synthase Kinase 3α (GSK3α) (Ki: 10 nM; ) [3]
- Glycogen Synthase Kinase 3β (GSK3β) (Ki: 6.7 nM;) [3]

Laduviglusib triHClide 抑制人 GSK-3β，Ki 值为 9.8 nM[1]。 Laduviglusib triHClide 是一种微小的有机分子，通过争夺 ATP 结合位点来抑制 GSK3α 和 GSK3β。根据体外激酶测定，Laduviglusib triHClide 特异性抑制 GSK3β (IC50=~5 nM) 和 GSK3α (IC50=~10 nM)，对其他激酶影响很小[4]。 Laduviglusib triHClide 在 2.5 μM 时使 ES-D3 细胞的活力降低 24.7%，在 5 μM 时降低 56.3%，在 7.5 μM 时降低 61.9%，在 10 μM 时降低 69.2%，IC50 为 4.9 M[2]。

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1. 增强胰岛素介导的葡萄糖转运与利用：在3T3-L1脂肪细胞和L6肌管细胞中，Laduviglusib (CHIR99021) trihydrochloride以浓度依赖性方式增强胰岛素刺激的2-脱氧葡萄糖（2-DG）摄取。1 μM浓度下，可使3T3-L1脂肪细胞中胰岛素诱导的葡萄糖摄取增加约2倍，L6肌管细胞中增加约1.8倍；同时增强胰岛素对糖原合成酶（GS）的激活作用，1 μM浓度下3T3-L1脂肪细胞的GS活性增加2.5倍[1]
2. 激活小鼠胚胎干细胞（mESCs）的Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）通路：用0.3-3 μM Laduviglusib (CHIR99021) trihydrochloride处理mESCs后，western blot检测显示细胞质和细胞核中β-catenin积累增加，实时定量PCR（qPCR）检测显示Wnt靶基因（如Axin2、Lef1）表达上调，通路激活呈浓度依赖性，3 μM时效果最强[2, 3]
3. 促进mESC自我更新：在缺乏白血病抑制因子（LIF）的条件下，3 μM Laduviglusib (CHIR99021) trihydrochloride可维持难治性小鼠品系（如CBA/Ca、129S6/SvEv）mESC的自我更新能力，碱性磷酸酶（AP）阳性克隆形成数较对照组增加约3倍，并通过免疫细胞化学和western blot证实其保留了多能性标志物（Oct4、Nanog、Sox2）的表达[3]
4. mESC中的细胞毒性：Laduviglusib (CHIR99021) trihydrochloride对mESC的细胞毒性较低，半数毒性浓度（CC50）大于10 μM，在用于自我更新和通路激活的3 μM浓度下未观察到细胞活力显著下降[2]

单次口服剂量后，Laduviglusib（16 mg/kg 或 48 mg/kg）三盐酸盐可迅速降低 ZDF 大鼠的血浆葡萄糖，给药后 3-4 小时最大降幅接近 150 mg/dl[1]。放射前 4 小时给予一次 laduviglusib (2 mg/kg) 三盐酸盐，可显着提高 14.5 Gy 腹部放射 (ABI) 后的生存率。用 laduviglusib triHClide 治疗可显着减少隐窝凋亡，防止 p-H2AX+ 细胞的积聚，并增强隐窝再生和绒毛高度。用 laduviglusib triHClate 治疗可通过防止细胞凋亡来提高 Lgr5+ 细胞的存活率，并成功延迟早在 4 小时内 Olfm4、Lgr5 和 CD44 的丢失[5]。

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1. 改善肥胖小鼠的胰岛素敏感性和糖稳态：在高脂饮食（HFD）诱导的肥胖C57BL/6小鼠中，腹腔注射Laduviglusib (CHIR99021) trihydrochloride（10 mg/kg/天，持续7天），与溶媒对照组相比，空腹血糖降低约30%，进食后血糖降低约25%，空腹胰岛素水平降低约40%；同时改善葡萄糖耐量（葡萄糖耐量试验AUC降低约28%）和胰岛素耐量（胰岛素耐量试验AUC降低约32%）[1]
2. 增强体内胰岛素介导的糖原合成：在HFD诱导的肥胖小鼠中，Laduviglusib (CHIR99021) trihydrochloride（10 mg/kg/天，腹腔注射）在胰岛素刺激条件下，可使骨骼肌糖原含量增加约50%，肝脏糖原含量增加约40%，与体外GS激活效果一致[1]

所有激酶测定都遵循相同的核心方案，肽底物和激活剂浓度变化如下所述。聚丙烯96孔板填充300μl/孔缓冲液（50 mmol/l三HCl、10 mmol/l MgCl2、1 mmol/l EGTA、1 mmol/1二硫苏糖醇、25 mmol/lβ-甘油磷酸、1 mmol/l NaF、0.01%BSA、pH 7.5），其中含有激酶、肽底物和任何激活剂。这些测定的激酶浓度、肽底物和激活剂（如适用）信息如下：GSK-3α（27 nmol/l和0.5μmol/l生物素CREB肽）；GSK-3β（29 nmol/l，和0.5μmol/l生物素CREB肽）；cdc2（0.8 nmol/l和0.5μmol/l生物素组蛋白H1肽）；erk2（400单位/ml和髓鞘碱性蛋白包被的闪光板[Perkin-Elmer]）；PKC-α（1.6 nmol/l，0.5μmol/l生物素组蛋白H1肽和0.1 mg/ml磷脂酰丝氨酸+0.01 mg/ml甘油二酯）；PKC-ζ（0.1 nmol/l，0.5μmol/l生物素-PKC-86肽和50μg/ml磷脂酰丝氨酸+5μg/ml二酰甘油）；akt1（5.55nmol/l和0.5μmol/l生物素磷酸化AKT肽）；p70 S6激酶（1.5 nmol/l和0.5μmol/l生物素GGGKRRRLASLRA）；p90 RSK2（0.049单位/ml和0.5μmol/l生物素GGGKRRRLASLRA）；c-src（4.1单位/ml和0.5μmol/l生物素KVEKIGEGTYGVVYK）；Tie2（1μg/ml和200 nmol/l生物素GGGGAPEDL-YKDFLT）；flt1（1.8 nmol/l和0.25μmol/l KDRY1175[B91616]生物素GGGGQDGKDYIVLPI-NH2）；KDR（0.95 nmol/l和0.25μmol/l KDRY1175[B91616]生物素-GGGQDGKDYIVLPI-NH2）；bFGF受体酪氨酸激酶（RTK；2 nmol/l和0.25μmol/l KDRY1175[B91616]生物素-GGGGGQDGKDYIVLPI-NH2）；IGF1 RTK（1.91 nmol/l和1μmol/l生物素GGGGKKKSPGEYVNIEFG酰胺）；胰岛素RTK（使用DG44 IR细胞）；AMP激酶（470单位/ml、50μmol/l SAMS肽和300μmol/l AMP）；pdk1（0.25 nmol/l、2.9 nmol/l未活化的Akt和20μmol/l DOPC和DOPS+2μmol/l PIP3）；CHK1（1.4 nmol/l和0.5μmol/l生物素-cdc25肽）；CK1-ε（3 nmol/l，和0.2μmol/l生物素肽）；DNA PK；和磷脂酰肌醇（PI）3-激酶（5nmol/l和2μg/ml PI）。在所有无细胞测定中，将受试化合物或对照加入3.5μl DMSO中，然后加入50μl ATP储备，以产生1μmol/l ATP的最终浓度。孵育后，将一式三份的100μl等分试样转移到含有100μl/孔50μmol/l ATP和20 mmol/l EDTA的Combiplate八板（LabSystems，赫尔辛基，芬兰）中。1小时后，用PBS冲洗孔5次，填充200μl闪烁液，密封，静置30分钟，并在闪烁计数器中计数。所有步骤均在室温下进行。抑制计算为100%×（抑制−无酶对照）/（DMSO对照−无酶控制）。[1]

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GSK3激酶活性实验：
1. 重组GSK3蛋白制备：表达并纯化重组人GSK3α和GSK3β蛋白，获得具有活性的酶[3]
2. 激酶活性实验设置：反应体系包含ATP、特异性GSK3底物（如糖原合成酶肽或tau蛋白衍生肽）以及不同浓度的Laduviglusib (CHIR99021) trihydrochloride（0.1 nM-1 μM），30°C孵育30分钟[3]
3. 检测与分析：采用放射性实验（[γ-³²P]ATP掺入法）或荧光法检测底物的磷酸化水平，相对于溶媒对照组计算激酶活性抑制率，并通过剂量-反应曲线推导GSK3α和GSK3β的Ki值[3]

细胞活力的丧失与 MTT 活性的下降相关，MTT 活性是一种可靠的基于代谢的估计细胞活力的测试。在含有 LIF 的 ES 细胞培养基中，将 2,000 个细胞接种在涂有明胶的 96 孔板上过夜。第二天将培养基更换为不含 LIF 且血清含量减少的培养基。它还补充有 0.1-1 μM BIO、或 1-10 μM SB-216763、CHIR-99021 或 CHIR-98014。作为对照，使用不含 DMSO 或 GSK3 抑制剂的基础培养基。分析了每个测试条件的三个副本[3]。

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1. 3T3-L1脂肪细胞和L6肌管细胞葡萄糖摄取实验：
- 细胞分化：3T3-L1前脂肪细胞经8-10天分化为脂肪细胞；L6成肌细胞经5-7天分化为肌管细胞[1]
- 药物与胰岛素处理：分化后的细胞血清饥饿4小时，用0.01-10 μM Laduviglusib (CHIR99021) trihydrochloride预处理1小时，再用胰岛素（脂肪细胞10 nM，肌管细胞100 nM）刺激30分钟[1]
- 葡萄糖摄取检测：向细胞中加入[³H]-2-脱氧葡萄糖，孵育10分钟；洗涤去除未结合的放射性物质，裂解细胞后用闪烁计数器定量放射性，葡萄糖摄取量以总细胞蛋白归一化[1]
2. 3T3-L1脂肪细胞糖原合成酶（GS）活性实验：
- 细胞处理：分化后的3T3-L1脂肪细胞血清饥饿，用0.01-10 μM Laduviglusib (CHIR99021) trihydrochloride预处理1小时，再用10 nM胰岛素刺激30分钟[1]
- 酶提取与检测：裂解细胞，离心部分纯化GS；通过检测[¹⁴C]-UDP-葡萄糖掺入糖原的量测定GS活性，活性单位表示为每毫克蛋白每分钟掺入的葡萄糖微摩尔数[1]
3. mESC Wnt/β-catenin通路激活实验：
- 细胞培养：mESC在无LIF的ESC培养基中，接种于明胶包被的培养板[2]
- 药物处理：用0.3-3 μM Laduviglusib (CHIR99021) trihydrochloride处理细胞24小时[2]
- β-catenin检测：裂解细胞并分离细胞质/细胞核组分，用特异性抗体通过western blot检测β-catenin蛋白水平；通过免疫细胞化学证实β-catenin的核定位[2]
- Wnt靶基因表达：提取总RNA，逆转录为cDNA，通过qPCR定量Axin2和Lef1的mRNA水平（以GAPDH为内参）[2]
4. mESC自我更新与多能性实验：
- 细胞培养：难治性品系mESC接种于明胶包被的培养板，在无LIF的ESC培养基中添加3 μM Laduviglusib (CHIR99021) trihydrochloride[3]
- 克隆形成实验：低密度接种细胞（100个细胞/cm²），培养7天后进行碱性磷酸酶（AP）染色，计数AP阳性克隆[3]
- 多能性标志物检测：用Oct4、Nanog、Sox2抗体进行免疫细胞化学检测；通过western blot定量蛋白水平[3]
5. mESC细胞毒性实验：
- 细胞接种：mESC以5×10³个细胞/孔接种到96孔板，孵育过夜[2]
- 药物处理：用0.1-100 μM Laduviglusib (CHIR99021) trihydrochloride处理细胞72小时[2]
- 活力检测：加入MTT试剂孵育4小时，溶解甲臜结晶后在570 nm处测定吸光度，通过剂量-反应曲线计算CC50值[2]

大鼠[1]：取体重<140 g的雄性Sprague Dawley大鼠的原代肝细胞，分离后1-3小时使用。离心后，用含0.01% NP40的缓冲液A进行冻融裂解，取1106个细胞悬浮于1 mL含0.2% BSA的DMEM/F12培养基中，并加入CHIR-99021（口服，剂量为16或48 mg/kg）或对照品，置于12孔板中，在37℃、富含CO₂的培养箱中孵育30分钟。之后再次进行GS活性测定。小鼠[4]：所用小鼠为6-10周龄小鼠。将Lgr5-EGFP (Lgr5-EGFP-IRES-creERT2)小鼠的PUMA+/+和PUMA-/-同窝小鼠分别进行腹部照射(ABI)或全身照射(TBI)以诱导放射病。在放射治疗前4小时，向小鼠腹腔注射(ip) CHIR99021（2 mg/kg）或SB415286（1 mg/kg）。处死小鼠后，取出小肠进行蛋白质印迹和组织学检测。在处死前，所有小鼠均接受腹腔注射100 mg/kg BrdU。

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1. 高脂饮食诱导肥胖小鼠的胰岛素敏感性和葡萄糖稳态研究：
- 小鼠模型制备：C57BL/6小鼠喂食高脂饮食（60% kcal来自脂肪）12周，以诱导肥胖和胰岛素抵抗[1]
- 分组和给药：将小鼠随机分为载体对照组和治疗组（每组n=8）。Laduviglusib (CHIR99021)三盐酸盐溶于含0.1% DMSO的0.9%生理盐水中，以10 mg/kg/天的剂量腹腔注射，连续7天。对照组接受等体积的含0.1% DMSO的0.9%生理盐水[1]
- 样本采集和检测：每日使用血糖仪测量空腹血糖（禁食16小时后）和餐后血糖。采用ELISA法检测空腹胰岛素水平。分别于第6天和第7天进行葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）[1]
2. 小鼠糖原含量测定：
- 组织采集：治疗7天后，处死小鼠，并收集骨骼肌（腓肠肌）和肝脏组织[1]
- 糖原提取和定量：将组织在高氯酸中匀浆，并用乙醇沉淀糖原。采用基于蒽酮试剂反应的比色法测定糖原含量，并以组织重量进行标准化[1]

1. 体外细胞毒性：拉杜维格鲁西布（CHIR99021）三盐酸盐对小鼠胚胎干细胞（mESCs）的细胞毒性较低（CC50 > 10 μM），且在浓度高达 10 μM 时，对 3T3-L1 脂肪细胞或 L6 肌管细胞无显著细胞毒性 [1, 2]
2. 体内毒性：在高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠中，连续 7 天腹腔注射 10 mg/kg/天的拉杜维格鲁西布（CHIR99021）三盐酸盐，未引起体重、器官重量（肝脏、肾脏、心脏）或血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）或肌酐水平的显著变化，表明无明显的急性毒性 [1]

[1]. Selective glycogen synthase kinase 3 inhibitors potentiate insulin activation of glucose transport and utilization in vitro and in vivo. Diabetes. 2003 Mar;52(3):588-95.

[2]. Cytotoxicity and activation of the Wnt/beta-catenin pathway in mouse embryonic stem cells treated with four GSK3 inhibitors.BMC Res Notes. 2014 Apr 29;7:273.

[3]. Pleiotropy of glycogen synthase kinase-3 inhibition by CHIR99021 promotes self-renewal of embryonic stem cells from refractory mouse strains. PLoS One. 2012;7(4):e35892.

[4]. Regulation of Wnt signaling during adipogenesis. J Biol Chem. 2002 Aug 23;277(34):30998-1004.

[5]. Pharmacologically blocking p53-dependent apoptosis protects intestinal stem cells and mice from radiation. Sci Rep. 2015 Apr 10;5:8566.

CHIR 99021 属于氨基嘧啶类化合物，其结构为 2-氨基嘧啶，在 N2、5 和 6 位分别被 (5-氰基吡啶-2-基)乙基、4-甲基咪唑-2-基和 2,4-二氯苯基取代。它是一种 EC 2.7.11.26（tau 蛋白激酶）抑制剂。它属于咪唑类、二氯苯类、氨基嘧啶类、氨基吡啶类、氰基吡啶类、仲胺类化合物和二胺类化合物。

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1. 盐酸拉杜维格鲁西布 (CHIR99021) 是一种高选择性的 ATP 竞争性 GSK3α 和 GSK3β 抑制剂 [3]
2. GSK3 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它通过磷酸化和抑制糖原合成酶来负调控胰岛素信号通路，并通过磷酸化 β-catenin 使其被蛋白酶体降解来负调控 Wnt/β-catenin 通路 [1, 3]
3. 盐酸拉杜维格鲁西布 (CHIR99021) 的双重作用机制（增强胰岛素信号通路和激活 Wnt/β-catenin 通路）使其成为治疗 2 型糖尿病的潜在药物，也是一种有价值的工具。干细胞研究（促进 ESC 自我更新）[1, 3]
4. 盐酸拉杜维格鲁西布 (CHIR99021) 在浓度高达 10 μM 时，与其他激酶（例如 CDK2、ERK1、JNK1）无显著交叉反应，证实了其对 GSK3 的选择性 [3]
5. 在小鼠胚胎干细胞 (mESC) 中，盐酸拉杜维格鲁西布 (CHIR99021) 的自我更新促进作用与 LIF 无关，因此可用于维持对传统 LIF 培养系统不敏感的 ESC 品系 [3]

C22H21CL5N8

574.72

572.033

C, 45.98; H, 3.68; Cl, 30.84; N, 19.50

1782235-14-6

Laduviglusib;252917-06-9;Laduviglusib monohydrochloride;1797989-42-4

78243722

White to yellow solid powder

115

6

7

7

35

645

0

ClC1C([H])=C(C([H])=C([H])C=1C1C(=C([H])N=C(N=1)N([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C1C([H])=C([H])C(C#N)=C([H])N=1)C1=NC([H])=C(C([H])([H])[H])N1[H])Cl.Cl[H].Cl[H].Cl[H]

DSFVSCNMMZRCIA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H18Cl2N8.3ClH/c1-13-10-29-21(31-13)17-12-30-22(32-20(17)16-4-3-15(23)8-18(16)24)27-7-6-26-19-5-2-14(9-25)11-28-19;;;/h2-5,8,10-12H,6-7H2,1H3,(H,26,28)(H,29,31)(H,27,30,32);3*1H

6-[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-yl]amino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile;trihydrochloride

CHIR-73911 3HCl; CHIR911;CHIR 911; CT- 99021; CT-99021; CHIR73911; CHIR 73911 trihydrochloride; CHIR-911; CT- 99021; GSK 3 inhibitor XVI; GSK 3IXV; CHIR99021; CHIR 99021

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.62 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.62 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.62 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。