GSK-3β (IC50 = 6.7 nM); GSK-3α (IC50 = 10 nM); cdc2 (IC50 = 8800 nM)
Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK3), including both GSK3α and GSK3β isoforms. For GSK3β, the IC₅₀ value was reported to be 6.7 nM [3]

与其最接近的同源物 CDC2 和 ERK2 以及其他蛋白激酶相比，CHIR-99021 对 GSK-3 的选择性高出 500 倍以上。 CHIR-99021 仅对 23 种非激酶具有适度的抑制作用，并且与 22 种具有药理学意义的受体仅具有微弱的结合。在表达胰岛素受体的 CHO-IR 细胞中，CHIR-99021 会激活糖原合酶 (GS)，EC50 为 0.763 μM[1]。

---

在分化的3T3-L1脂肪细胞中，用拉杜维鲁昔布（Laduviglusib, CHIR99021）（浓度1 μM，处理24小时）处理后，Wnt信号通路的关键下游效应因子β-连环蛋白（β-catenin）出现积累。这种积累伴随着脂肪细胞特异性基因表达的显著抑制，包括编码过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）的基因（二者均为脂肪生成的关键调控因子）。此外，该药物还抑制了成熟脂肪细胞标志物脂肪酸合酶（FAS）和脂肪细胞脂肪酸结合蛋白（aP2）的表达 [4]
- 在来自难培养品系（如CBA/Ca和129S6/SvEvTac）的小鼠胚胎干细胞（mESCs）中，在拉杜维鲁昔布（Laduviglusib, CHIR99021）（浓度3 μM）存在的条件下培养，细胞能维持未分化状态。免疫荧光染色和实时定量聚合酶链反应（qPCR）检测结果显示，细胞中多能性标志物（Oct4、Nanog和Sox2）的表达持续存在，证实了这一结论。此外，克隆形成实验表明该药物可促进mESCs的自我更新：与对照组相比，拉杜维鲁昔布（Laduviglusib, CHIR99021）处理组的碱性磷酸酶（AP，未分化ESCs标志物）阳性克隆数显著增加 [3]
- 用浓度范围为0.1 μM至10 μM的拉杜维鲁昔布（Laduviglusib, CHIR99021）处理mESCs 48小时后，通过TOPFlash报告基因实验（用于检测Wnt通路激活的工具）发现，该药物可激活Wnt/β-连环蛋白通路。在浓度为3 μM时，荧光素酶活性约为溶剂对照组的5倍。然而，该药物也表现出剂量依赖性的细胞毒性：当浓度≥5 μM时，mESCs的存活率（通过MTT实验评估）较对照组下降超过30% [2]

在 2 型糖尿病啮齿动物模型中，口服 30 mg/kg CHIR-99021 可改善葡萄糖代谢。口服给药后三到四个小时，血浆葡萄糖最大程度降低（大约 150 mg/dl），血浆胰岛素水平保持在或低于控制水平。在 ZDF 大鼠中，在口服葡萄糖挑战前每小时口服 16 或 48 mg/kg 剂量的 CHIR-99021 可显着改善葡萄糖耐量，在 16 mg/kg 和 48 mg/kg 剂量下血浆葡萄糖水平分别下降 14% 和 33%分别为 mg/kg 剂量。较高剂量的 CHIR-99021 还可减轻口服葡萄糖激发前的高血糖[1]。

所有激酶测定都遵循相同的核心方案，肽底物和激活剂浓度变化如下所述。聚丙烯96孔板填充300μl/孔缓冲液（50 mmol/l三HCl、10 mmol/l MgCl2、1 mmol/l EGTA、1 mmol/1二硫苏糖醇、25 mmol/lβ-甘油磷酸、1 mmol/l NaF、0.01%BSA、pH 7.5），其中含有激酶、肽底物和任何激活剂。这些测定的激酶浓度、肽底物和激活剂（如适用）信息如下：GSK-3α（27 nmol/l和0.5μmol/l生物素CREB肽）；GSK-3β（29 nmol/l，和0.5μmol/l生物素CREB肽）；cdc2（0.8 nmol/l和0.5μmol/l生物素组蛋白H1肽）；erk2（400单位/ml和髓鞘碱性蛋白包被的闪光板[Perkin-Elmer]）；PKC-α（1.6 nmol/l，0.5μmol/l生物素组蛋白H1肽和0.1 mg/ml磷脂酰丝氨酸+0.01 mg/ml甘油二酯）；PKC-ζ（0.1 nmol/l，0.5μmol/l生物素-PKC-86肽和50μg/ml磷脂酰丝氨酸+5μg/ml二酰甘油）；akt1（5.55nmol/l和0.5μmol/l生物素磷酸化AKT肽）；p70 S6激酶（1.5 nmol/l和0.5μmol/l生物素GGGKRRRLASLRA）；p90 RSK2（0.049单位/ml和0.5μmol/l生物素GGGKRRRLASLRA）；c-src（4.1单位/ml和0.5μmol/l生物素KVEKIGEGTYGVVYK）；Tie2（1μg/ml和200 nmol/l生物素GGGGAPEDL-YKDFLT）；flt1（1.8 nmol/l和0.25μmol/l KDRY1175[B91616]生物素GGGGQDGKDYIVLPI-NH2）；KDR（0.95 nmol/l和0.25μmol/l KDRY1175[B91616]生物素-GGGQDGKDYIVLPI-NH2）；bFGF受体酪氨酸激酶（RTK；2 nmol/l和0.25μmol/l KDRY1175[B91616]生物素-GGGGGQDGKDYIVLPI-NH2）；IGF1 RTK（1.91 nmol/l和1μmol/l生物素GGGGKKKSPGEYVNIEFG酰胺）；胰岛素RTK（使用DG44 IR细胞）；AMP激酶（470单位/ml、50μmol/l SAMS肽和300μmol/l AMP）；pdk1（0.25 nmol/l、2.9 nmol/l未活化的Akt和20μmol/l DOPC和DOPS+2μmol/l PIP3）；CHK1（1.4 nmol/l和0.5μmol/l生物素-cdc25肽）；CK1-ε（3 nmol/l，和0.2μmol/l生物素肽）；DNA PK；和磷脂酰肌醇（PI）3-激酶（5nmol/l和2μg/ml PI）。在所有无细胞测定中，将受试化合物或对照加入3.5μl DMSO中，然后加入50μl ATP储备，以产生1μmol/l ATP的最终浓度。孵育后，将一式三份的100μl等分试样转移到含有100μl/孔50μmol/l ATP和20 mmol/l EDTA的Combiplate八板（LabSystems，赫尔辛基，芬兰）中。1小时后，用PBS冲洗孔5次，填充200μl闪烁液，密封，静置30分钟，并在闪烁计数器中计数。所有步骤均在室温下进行。抑制计算为100%×（抑制−无酶对照）/（DMSO对照−无酶控制）。[1]

---

GSK3β激酶活性检测：将重组人GSK3β与合成肽底物（序列：YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQpSEDEEE）在含有ATP（终浓度10 μM）、氯化镁（MgCl₂）和不同浓度拉杜维鲁昔布（Laduviglusib, CHIR99021）（0.1 nM至100 nM）的反应缓冲液中孵育。反应在30°C下进行60分钟，随后加入含乙二胺四乙酸（EDTA）的终止缓冲液终止反应。采用时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）实验检测磷酸化底物的量：使用标记供体荧光团的磷酸化丝氨酸特异性一抗和标记受体荧光团的二抗，根据TR-FRET信号强度生成的剂量-反应曲线计算拉杜维鲁昔布（Laduviglusib, CHIR99021）对GSK3β的IC₅₀值 [3]

表达人胰岛素受体的 CHO-IR 细胞在含有 10% 胎牛血清且不含次黄嘌呤的 Hamm's F12 培养基中生长至 80% 汇合。在 2 ml 不含胎牛血清的培养基中，将胰蛋白酶处理的细胞以每孔 1×106 个细胞的密度接种到 6 孔板中。 24 小时后，将培养基更换为 1 ml 含有 GSK-3 抑制剂或对照（DMSO 最终浓度 <0.1%）的无血清培养基，37°C 培养 30 分钟。裂解细胞并离心 15 分钟。 4°C/14000g。使用 Thomas 等人开发的滤纸测定法，将 GS 活性比计算为存在和不存在 5 mmol/l 6-磷酸葡萄糖时 GS 活性之间的差异。

---

3T3-L1细胞脂肪分化实验：将3T3-L1前脂肪细胞以2×10⁴个/孔的密度接种于6孔板，用含10%胎牛血清（FBS）的达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）培养至汇合。汇合后第2天（第0天），向培养基中加入含胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）的分化混合物诱导分化。第2天，将培养基更换为含10% FBS和胰岛素的DMEM。从第2天起，每2天用拉杜维鲁昔布（Laduviglusib, CHIR99021）（1 μM）或溶剂对照处理细胞，直至第8天。第8天，收集细胞：用TRIzol试剂提取RNA，通过qPCR分析基因表达；或用RIPA缓冲液提取蛋白质，通过Western blot检测β-连环蛋白水平。qPCR中，使用针对PPARγ、C/EBPα、FAS和aP2的特异性引物，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因；Western blot中，使用抗β-连环蛋白一抗和辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，以β-肌动蛋白（β-actin）作为上样对照 [4]
- mESC自我更新与多能性实验：将难培养品系的mESCs接种于经丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层上，培养基为含15% FBS、白血病抑制因子（LIF）、青霉素-链霉素和β-巯基乙醇的DMEM。用拉杜维鲁昔布（Laduviglusib, CHIR99021）（3 μM）或溶剂对照处理细胞，每日更换培养基。培养7天后，用4%多聚甲醛固定细胞，使用AP染色试剂盒进行碱性磷酸酶（AP）染色，以识别未分化克隆，在光学显微镜下计数AP阳性克隆数。免疫荧光染色时，固定后的细胞在4°C下与抗Oct4、Nanog和Sox2的一抗孵育过夜，随后在室温下与荧光标记的二抗孵育1小时，通过荧光显微镜观察染色细胞。qPCR分析时，用RNA提取试剂盒提取mESCs总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA，使用针对Oct4、Nanog和Sox2的特异性引物进行qPCR，以GAPDH作为参考基因 [3]
- mESC中Wnt通路激活与细胞毒性实验：使用转染试剂将TOPFlash报告质粒（含TCF/LEF结合位点，位于荧光素酶基因上游）和海肾荧光素酶质粒（内参对照）转染至mESCs。转染24小时后，用不同浓度的拉杜维鲁昔布（Laduviglusib, CHIR99021）（0.1 μM至10 μM）或溶剂对照处理细胞48小时。采用双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性，将萤火虫荧光素酶活性归一化为海肾荧光素酶活性。细胞毒性评估时，将mESCs以5×10³个/孔的密度接种于96孔板，用相同浓度的拉杜维鲁昔布（Laduviglusib, CHIR99021）处理48小时。向每孔加入MTT试剂，37°C孵育4小时后，用二甲基亚砜（DMSO）溶解形成的甲臜结晶，在酶标仪上测定570 nm处的吸光度，以药物处理孔吸光度占对照孔吸光度的百分比计算细胞存活率 [2]

雌性db/db小鼠；雄性ZDF大鼠
8-48 mg/kg
口服给药[1]

---

从体重<140 g的雄性Sprague Dawley大鼠中分离原代肝细胞，并在分离后1-3小时内使用。将1×10⁶个细胞分装于1 mL含0.2% BSA的DMEM/F12培养基中，并加入CHIR 99021（口服剂量为16或48 mg/kg）或对照品，置于12孔板中，在低速摇床上于37°C、富含CO₂的条件下孵育30分钟。离心收集细胞，并用含0.01% NP40的缓冲液A进行冻融裂解；再次进行GS测定。小鼠[4] 使用6-10周龄的小鼠。在C57BL/6背景（F10）下，PUMA+/+和PUMA-/-同窝小鼠以及Lgr5-EGFP（Lgr5-EGFP-IRES-creERT2）小鼠分别接受全身照射（TBI）或腹部照射（ABI）。小鼠在照射前4小时腹腔注射（ip）2 mg/kg CHIR99021，或在照射前28小时和4小时腹腔注射1 mg/kg SB415286。处死小鼠，收集小肠进行组织学分析和蛋白质印迹分析。所有小鼠在处死前均腹腔注射100 mg/kg BrdU[2]。

在小鼠胚胎干细胞 (mESCs) 中，Laduviglusib (CHIR99021) 表现出剂量依赖性细胞毒性。处理 48 小时后，浓度为 5 μM 和 10 μM 的 Laduviglusib 分别导致细胞活力（通过 MTT 法评估）较溶剂对照组降低了 32% 和 58%。浓度 ≤ 3 μM 时未观察到明显的细胞毒性 [2]

[1]. Selective glycogen synthase kinase 3 inhibitors potentiate activation of glucose transport and utilization in vitro and in vivo. Diabetes. 2003 Mar;52(3):588-95.

[2]. Cytotoxicity and activation of the Wnt/beta-catenin pathway in mouse embryonic stem cells treated with four GSK3 inhibitors.BMC Res Notes. 2014 Apr 29;7:273.

[3]. Pleiotropy of glycogen synthase kinase-3 inhibition by CHIR99021 promotes self-renewal of embryonic stem cells from refractory mouse strains. PLoS One. 2012;7(4):e35892.

[4]. Regulation of Wnt signaling during adipogenesis. J Biol Chem. 2002 Aug 23;277(34):30998-1004.

[5]. Pharmacologically blocking p53-dependent apoptosis protects intestinal stem cells and mice from radiation. Sci Rep. 2015 Apr 10;5:8566.

CHIR 99021 属于氨基嘧啶类化合物，其结构为 2-氨基嘧啶，在 N2、5 和 6 位分别被 (5-氰基吡啶-2-基)乙基、4-甲基咪唑-2-基和 2,4-二氯苯基取代。它是一种 EC 2.7.11.26（tau 蛋白激酶）抑制剂。CHIR 99021 属于咪唑类、二氯苯类、氨基嘧啶类、氨基吡啶类、氰基吡啶类、仲胺类化合物和二胺类化合物。

---

背景：抑制糖原合成酶激酶-3 (GSK-3) 可提高从不同品系小鼠和大鼠中分离胚胎干细胞 (ES 细胞) 的效率，并显著促进 ES 细胞的自我更新能力。据报道，β-catenin 通过 TCF 依赖性和非依赖性途径参与维持 ES 细胞的自我更新。但不同物种和品系来源的胚胎干细胞系之间的内在差异尚未得到充分阐明。本文旨在解析CHIR99021抑制难治性小鼠品系来源的胚胎干细胞中GSK-3的机制。方法/主要发现：我们发现，GSK-3特异性抑制剂CHIR99021通过稳定β-catenin和c-Myc蛋白水平，促进难治性C57BL/6 (B6)和BALB/c小鼠品系来源的胚胎干细胞的自我更新。稳定的β-catenin通过两种机制促进胚胎干细胞的自我更新。首先，β-catenin转位至细胞核，以一种不依赖于淋巴增强因子/T细胞因子的方式维持干细胞的多能性。其次，β-catenin与定位于细胞膜的E-cadherin结合，从而确保胚胎干细胞保持紧凑的球形形态，这是胚胎干细胞的标志性特征。此外，c-Myc蛋白水平升高并未显著促进CH介导的ES细胞自我更新。相反，c-Myc的作用依赖于其转化活性，并且可以被N-Myc替代，但不能被L-Myc替代。β-catenin和c-Myc对B6和BALB/c小鼠来源的ES细胞具有相似的作用。结论/意义：我们的数据表明，CH通过调控多个信号通路，抑制GSK-3，从而促进具有非容许遗传背景的小鼠ES细胞的自我更新。这些发现有助于提高通常不具备容许性的小鼠品系作为研究工具的可用性。[3]

---

Laduviglusib (CHIR99021)主要通过抑制GSK3发挥作用，从而导致β-catenin的稳定和积累。积累的β-catenin易位至细胞核，与T细胞因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）转录因子结合，从而激活Wnt靶基因的表达。该机制对于维持小鼠胚胎干细胞（mESCs）的自我更新和抑制脂肪生成至关重要[2],[3],[4]。在脂肪生成过程中，Laduviglusib（CHIR99021）对GSK3的抑制作用会通过抑制关键脂肪生成转录因子（PPARγ和C/EBPα）及其下游脂肪细胞标志物的表达，从而干扰前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的正常分化过程。这表明，像Laduviglusib (CHIR99021)这样的GSK3抑制剂可能在调节脂肪组织发育及相关代谢紊乱方面具有潜在应用价值[4]。对于来自难治性品系的小鼠胚胎干细胞（mESCs），这些细胞通常自我更新能力低，且在标准培养条件下容易分化，Laduviglusib (CHIR99021)（3 μM）能有效维持其多能性并促进自我更新。这一特性使得该药物成为体外培养和操作来自遗传多样性小鼠品系的mESCs的宝贵工具，这对于涉及疾病遗传模型的研究至关重要[3]。

C22H18CL2N8

465.34

464.103

C, 56.78; H, 3.90; Cl, 15.24; N, 24.08

252917-06-9

252917-06-9;1782235-14-6 (3HCl);2109414-84-6 (2HCl);1797989-42-4 (HCl);

9956119

Off-white to light brown solid powder

1.5±0.1 g/cm3

784.1±70.0 °C at 760 mmHg

428.0±35.7 °C

0.0±2.7 mmHg at 25°C

1.700

3.98

115.2

3

7

7

32

645

0

ClC1C([H])=C(C([H])=C([H])C=1C1C(=C([H])N=C(N=1)N([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C1C([H])=C([H])C(C#N)=C([H])N=1)C1=NC([H])=C(C([H])([H])[H])N1[H])Cl

AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H18Cl2N8/c1-13-10-29-21(31-13)17-12-30-22(32-20(17)16-4-3-15(23)8-18(16)24)27-7-6-26-19-5-2-14(9-25)11-28-19/h2-5,8,10-12H,6-7H2,1H3,(H,26,28)(H,29,31)(H,27,30,32)

6-[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-yl]amino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.47 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.47 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ~3.5 mg/mL (7 mM) in 4%DMSO+30%PEG 300+ddH2O, 澄清溶液
配方 4 中的溶解度: ~5 mg/mL (10.7 mM) in 0.5% CMC-Na/saline water, 悬浮液
配方 5 中的溶解度: ≥ 2.1 mg/mL (4.5 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + + 45% Saline, 澄清溶液
例如，要配制1 mL工作液，可取100 μL 21 mg/mL DMSO储备液，加入tO+400 μL PEG300，混匀（澄清液）； 然后向上述溶液中加入50 μL Tween 80，混匀（澄清溶液）； 最后，向上述溶液中加入450 μL生理盐水，混匀（澄清溶液）。
Preparation of saline: Dissolve 0.9 g of sodium chloride in 100 mL ddH ₂ O to obtain a 澄清溶液。
配方 6 中的溶解度: ≥ 2.1 mg/mL (4.5 mM) in 10% DMSO + 90% Corn oil, 澄清溶液
例如，要配制1 mL工作液，可取100 μL 21 mg/mL DMSO储备液，加入900 μL玉米油中，混匀（澄清溶液）。

---

配方 7 中的溶解度: 5 mg/mL (10.74 mM) in 0.5% CMC-Na/saline water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 8 中的溶解度: 5 mg/mL (10.74 mM) in 20% SBE-β-CD adjusted to pH 4-4.5 with 1 N acetic (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。