GSK-3β (IC50 = 6.7 nM); GSK-3α (IC50 = 10 nM); cdc2 (IC50 = 8800 nM)
GSK-3α (IC50 = 10 nM); GSK-3β (IC50 = 6.7 nM)

CHIR-99021 对 GSK-3 的选择性比其最接近的同源物 CDC2 和 ERK2 以及其他蛋白激酶高 500 倍以上。CHIR-99021 对 23 种非激酶的抑制作用较弱，且与 22 种具有药理学意义的受体结合较弱。在表达胰岛素受体的 CHO-IR 细胞中，CHIR-99021 可激活糖原合成酶 (GS)，其 EC50 为 0.763 μM[1]。

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Laduviglusib 是一种强效且选择性的 GSK-3α/β 抑制剂，其 IC50 分别为 10 nM 和 6.7 nM。它对 GSK-3 的选择性比其最接近的同源物 CDC2 和 ERK2 以及其他蛋白激酶高 500 倍以上。 CHIR-99021 对 23 种非激酶的抑制作用较弱，且与 22 种具有药理学意义的受体结合也较弱。在表达胰岛素受体的 CHO-IR 细胞中，CHIR-99021 可激活糖原合成酶 (GS)，其 EC50 值为 0.763 μM。

在2型糖尿病啮齿动物模型中，口服30 mg/kg的CHIR-99021可改善葡萄糖代谢。口服给药后3至4小时，血浆葡萄糖水平达到最大降幅（约150 mg/dl），且血浆胰岛素水平维持在对照水平或以下。在ZDF大鼠中，口服葡萄糖耐量试验前1小时分别以16或48 mg/kg的剂量口服CHIR-99021，可显著改善葡萄糖耐量，血浆葡萄糖水平分别在16 mg/kg和48 mg/kg剂量下下降14%和33%。较高剂量的CHIR-99021还可减轻口服葡萄糖耐量试验前的血糖升高[1]。口服给药后3至4小时，血浆葡萄糖水平达到最大降幅（约150 mg/dL），血浆胰岛素水平维持在对照水平或以下。在ZDF大鼠中，口服给予CHIR-99021，剂量分别为16 mg/kg和48 mg/kg，在进行口服葡萄糖耐量试验前1小时给药，可显著改善葡萄糖耐量，血浆葡萄糖水平分别下降14%和33%。较高剂量还能减轻口服葡萄糖耐量试验前的血糖升高。

所有激酶活性测定均遵循相同的核心方案，但肽底物和激活剂的浓度有所不同，具体如下所述。将300 μl/孔的缓冲液（50 mmol/l Tris-HCl、10 mmol/l MgCl2、1 mmol/l EGTA、1 mmol/l 二硫苏糖醇、25 mmol/l β-甘油磷酸钠、1 mmol/l NaF、0.01% BSA，pH 7.5）加入聚丙烯96孔板中，该缓冲液包含激酶、肽底物和任何激活剂。这些测定中激酶浓度、肽底物和激活剂（如适用）的信息如下：GSK-3α（27 nmol/l，以及0.5 μmol/l生物素标记的CREB肽）；GSK-3β（29 nmol/l，以及0.5 μmol/l生物素标记的CREB肽）。 cdc2（0.8 nmol/l，以及 0.5 μmol/l 生物素标记的组蛋白 H1 肽）；erk2（400 单位/ml，以及髓鞘碱性蛋白包被的 Flash Plate [Perkin-Elmer]）；PKC-α（1.6 nmol/l，0.5 μmol/l 生物素标记的组蛋白 H1 肽，以及 0.1 mg/ml 磷脂酰丝氨酸 + 0.01 mg/ml 二酰甘油）；PKC-ζ（0.1 nmol/l，0.5 μmol/l 生物素标记的 PKC-86 肽，以及 50 μg/ml 磷脂酰丝氨酸 + 5 μg/ml 二酰甘油）；akt1（5.55 nmol/l，以及 0.5 μmol/l 生物素标记的磷酸化 AKT 肽）； p70 S6 激酶（1.5 nmol/l，以及 0.5 μmol/l 生物素-GGGKRRRLASLRA）；p90 RSK2（0.049 单位/ml，以及 0.5 μmol/l 生物素-GGGKRRRLASLRA）；c-src（4.1 单位/ml，以及 0.5 μmol/l 生物素-KVEKIGEGTYGVVYK）；Tie2（1 μg/ml，以及 200 nmol/l 生物素-GGGGAPEDLYKDFLT）；flt1（1.8 nmol/l，以及 0.25 μmol/l KDRY1175 [B91616] 生物素-GGGGQDGKDYIVLPI-NH2）； KDR（0.95 nmol/l 和 0.25 μmol/l KDRY1175 [B91616] 生物素-GGGGQDGKDYIVLPI-NH2）；bFGF 受体酪氨酸激酶（RTK；2 nmol/l 和 0.25 μmol/l KDRY1175 [B91616] 生物素-GGGGQDGKDYIVLPI-NH2）；IGF1 RTK（1.91 nmol/l 和 1 μmol/l 生物素-GGGGKKKSPGEYVNIEFG-酰胺）；胰岛素 RTK（使用 DG44 IR 细胞）；AMP 激酶（470 单位/ml，50 μmol/l SAMS 肽和 300 μmol/l AMP）； pdk1（0.25 nmol/l、2.9 nmol/l 未活化 Akt、20 μmol/l DOPC 和 DOPS + 2 μmol/l PIP3）；CHK1（1.4 nmol/l 和 0.5 μmol/l 生物素标记的 cdc25 肽）；CK1-ε（3 nmol/l 和 0.2 μmol/l 生物素标记的肽）；DNA PK；以及磷脂酰肌醇 (PI) 3-激酶（5 nmol/l 和 2 μg/ml PI）。在所有无细胞实验中，将测试化合物或对照品溶于 3.5 μl DMSO 中，随后加入 50 μl ATP 储备液，使 ATP 的最终浓度为 1 μmol/l。孵育后，取100 μl样品分装成三份，转移至含有100 μl/孔50 μmol/l ATP和20 mmol/l EDTA的Combiplate八孔板（LabSystems，芬兰赫尔辛基）。1小时后，用PBS缓冲液洗涤孔板5次，加入200 μl闪烁液，密封，静置30分钟，然后用闪烁计数器计数。所有步骤均在室温下进行。抑制率计算公式为：100% × (抑制组 − 无酶对照组)/(DMSO 对照组 − 无酶对照组)。[1]

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激酶活性测定遵循核心方案，使用聚丙烯 96 孔板，每孔加入 300 μl 缓冲液（50 mmol/l Tris-HCl、10 mmol/l MgCl₂、1 mmol/l EGTA、1 mmol/l 二硫苏糖醇、25 mmol/l β-甘油磷酸钠、1 mmol/l NaF、0.01% BSA，pH 7.5），其中包含激酶、肽底物和任何激活剂。GSK-3α 的浓度为 27 nmol/l，肽底物的浓度为 0.5 μmol/l。IC₅₀ 值由剂量反应曲线确定。

表达人胰岛素受体的CHO-IR细胞在含10%胎牛血清且不含次黄嘌呤的Hamm's F12培养基中培养至80%汇合度。用胰蛋白酶消化细胞后，以每孔1×10⁶个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2 ml不含胎牛血清的培养基。24小时后，将培养基更换为1 ml含GSK-3抑制剂或对照（最终DMSO浓度<0.1%）的无血清培养基，于37℃孵育30分钟。裂解细胞，并在4℃/14000g下离心15分钟。利用Thomas等人开发的滤纸法，计算GS活性比值，即在有无5 mmol/L葡萄糖-6-磷酸存在下GS活性的差值。在表达胰岛素受体的CHO-IR细胞中评估细胞效力，结果表明CHIR-99021能以0.763 μM的EC50激活糖原合成酶（GS）。通过测定该化合物抑制GSK-3激活GS的能力来评估其细胞活性。在相关细胞类型中评估其对糖原合成和胰岛素信号传导的影响。

本品配制成 20 mM 柠檬酸盐缓冲的 15% Captisol 溶液或 0.5% 羧甲基纤维素细悬浮液。
雌性 db/db 小鼠或患有 2 型糖尿病的雄性 ZDF 大鼠

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在包括 ZDF 大鼠在内的 2 型糖尿病啮齿动物模型中评估体内疗效。CHIR-99021 以 16、30 或 48 mg/kg 的剂量口服给药。进行口服葡萄糖耐量试验以评估葡萄糖代谢的改善情况。在给药后不同时间点测量血浆葡萄糖和胰岛素水平。

CHIR-99021的二盐酸盐易溶于水，便于体外和体内应用。临床前研究表明，该化合物具有良好的口服生物利用度。在多种动物模型中，已对其吸收、分布、代谢和排泄等药代动力学参数进行了详细表征。CHIR-99021广泛应用于生物医学研究，以探索GSK-3的作用。

由于拉杜维格鲁西布主要用作研究工具，因此其全面的毒理学数据有限。该化合物已在2型糖尿病动物模型中进行了评估，剂量最高达48 mg/kg。操作过程中应遵守标准的实验室安全预防措施。该化合物不适用于人类治疗，也未进行正式的毒理学研究。

[1]. Diabetes. 2003 Mar;52(3):588-95. [2]. PLoS One.2013;8(3):e58501.

胰岛素抵抗在2型糖尿病的发生发展中起着核心作用，但胰岛素作用的具体缺陷仍有待阐明。糖原合成酶激酶3 (GSK-3) 负调控胰岛素信号传导的多个方面，已有研究报道糖尿病啮齿动物和人类骨骼肌中GSK-3水平升高。目前，关于高选择性GSK-3抑制剂在胰岛素抵抗条件下对胰岛素作用的调控信息有限。本研究描述了一类新型取代氨基嘧啶衍生物，该类化合物能有效抑制人GSK-3（K_i < 10 nmol/L），并且对其他20种蛋白激酶的选择性至少高500倍。这些低分子量化合物在浓度约为100 nmol/L时，即可激活转染胰岛素受体的培养CHO细胞和从Sprague-Dawley大鼠分离的原代肝细胞中的糖原合成酶；在从瘦型Zucker大鼠和ZDF大鼠分离的I型骨骼肌中，浓度为500 nmol/L的GSK-3抑制剂能够增强胰岛素抵抗的ZDF大鼠I型骨骼肌中胰岛素刺激的葡萄糖转运，但对胰岛素敏感的瘦型Zucker大鼠没有影响。单次口服或皮下注射这些抑制剂（30-48 mg/kg）可迅速降低ZDF大鼠和db/db小鼠在口服或静脉注射葡萄糖后的血糖水平，并改善葡萄糖利用率，且不会引起低血糖或显著升高胰岛素水平。总的来说，我们的结果表明，这些选择性GSK-3抑制剂可能作为治疗2型糖尿病胰岛素抵抗的急性有效治疗药物。[1]

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我们已鉴定出Wnt10b是脂肪生成的重要抑制剂，必须抑制Wnt10b才能在体外诱导前脂肪细胞分化。本文证明，糖原合成酶激酶3的特异性抑制剂CHIR 99021能够模拟前脂肪细胞中的Wnt信号通路。CHIR 99021可稳定胞质游离β-catenin，并通过阻断CCAAT/增强子结合蛋白α和过氧化物酶体增殖物激活受体γ的诱导来抑制脂肪生成。在脂肪生成的最初3天内，用CHIR 99021处理3T3-L1细胞，在任何24小时的时间范围内，前脂肪细胞的分化均受到抑制。与此抑制时间一致，分化诱导后Wnt10b mRNA的表达受到抑制，6小时后下降50%，36小时后完全抑制。在用于诱导分化的试剂中，用甲基异丁基黄嘌呤或cAMP处理3T3-L1细胞足以抑制Wnt10b mRNA的表达。 Wnt10b对脂肪生成的抑制作用可能由Wnt受体Frizzled 1、2和/或5以及辅助受体LDL受体相关蛋白5和6介导。这些受体与Wnt10b一样，在脂肪前体细胞和基质血管细胞中高表达。最后，我们证实，通过表达分泌型Frizzled相关蛋白来破坏细胞外Wnt信号通路会导致脂肪细胞的自发转化。[2] 近期研究进展表明，糖尿病患者β细胞功能和数量的再生是可能的。对于目前血糖控制不佳的糖尿病治疗，再生疗法可能是一种替代治疗选择。本文报道，小分子抑制剂或RNA干扰可以抑制GSK3活性，从而刺激INS-1E大鼠胰岛肿瘤细胞的复制。特异性强效的GSK3抑制剂还能降低高浓度葡萄糖和饱和脂肪酸棕榈酸酯对INS-1E细胞的毒性作用。此外，用结构多样的GSK3小分子抑制剂处理分离的大鼠胰岛，可使β细胞的复制率比对照组提高2-3倍。我们认为GSK3是β细胞复制和存活的调节因子。此外，我们的研究结果表明，特异性GSK3抑制剂可能在β细胞再生治疗中具有实际应用价值。[3]

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Laduviglusib (CHIR-99021) 是一种广泛用于研究GSK-3在多种细胞过程中功能的药理学工具，这些过程包括糖原代谢、细胞周期调控和胚胎干细胞自我更新。CHIR-99021通过抑制GSK-3促进胚胎干细胞的自我更新。该化合物具有极高的选择性（对 CDC2 和 ERK2 的选择性高出 500 倍以上），使其成为 GSK-3 研究的首选抑制剂。文献中广泛引用了该化合物在 Wnt/β-catenin 信号通路和干细胞生物学中的作用。

C22H20CL4N8

538.26

538.053

C, 49.09; H, 3.75; Cl, 26.34; N, 20.82

2109414-84-6

252917-06-9;1782235-14-6 (3HCl);2109414-84-6 (2HCl);1797989-42-4 (HCl);

91826519

Solid powder

115

5

7

7

34

645

0

OOMHEMQQCHEWDS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H18Cl2N8.2ClH/c1-13-10-29-21(31-13)17-12-30-22(32-20(17)16-4-3-15(23)8-18(16)24)27-7-6-26-19-5-2-14(9-25)11-28-19;;/h2-5,8,10-12H,6-7H2,1H3,(H,26,28)(H,29,31)(H,27,30,32);2*1H

6-((2-((4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-yl)amino)ethyl)amino)nicotinonitrile dihydrochloride

2109414-84-6; UNII-X6BE5J2G31; Laduviglusib dihydrochloride; CHIR-99021 dihydrochloride; CHIR-911 dihydrochloride;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

Typically soluble in DMSO (e.g. > 10 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。