CTEP (RO4956371)

mGlu5 receptor (IC50 = 2.2 nM)
Metabotropic glutamate receptor 5 (mGlu5) (Ki = 0.41 nM; IC50 = 3.2 nM in calcium mobilization assay) [1]

在稳定表达人 mGlu5 的 HEK293 细胞中，CTEP (RO 4956371) 抑制君子氨酸诱导的 Ca2+ 动员，IC50 为 11.4 nM，并抑制 [3H]IP 积聚，IC50 为 6.4 nM。在稳定表达人 mGlu5 的 HEK293 细胞中，CTEP (RO 4956371) 可抑制人 mGlu5 的组成活性大约 50%，IC50 为 40.1 nM[1]。

---

CTEP（RO4956371）对mGlu5表现出强效且选择性的抑制作用。在表达人mGlu5的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中，它以IC50 = 3.2 nM抑制谷氨酸诱导的钙动员。在浓度高达10 μM时，对其他mGlu受体亚型（mGlu1-4、6-8）或离子型谷氨酸受体（NMDA、AMPA、红藻氨酸受体）无显著亲和力[1]
在野生型小鼠的原代皮质神经元培养物中，CTEP（RO4956371）以浓度依赖方式抑制mGlu5介导的磷脂酶C激活和细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化，在100 nM时达到最大抑制效果[1]
在脆性X综合征（FXS）小鼠的海马切片中，CTEP（RO4956371）（1 μM）可逆转过度的I组mGlu受体依赖性长时程抑制（LTD），这是FXS的关键突触缺陷[2]

在接受焦虑治疗的小鼠中，CTEP (RO 4956371) 在 0.1 mg/kg 和 0.3 mg/kg 剂量下显着有效。在 Vogel 冲突饮酒测试中，CTEP (RO 4956371) 在较低剂量下没有影响，但在 0.3 和 1.0 mg/kg 时显着延长饮酒时间。小鼠中基于血浆和全脑匀浆中总药物浓度的 B/P 比为 2.6，而 CTEP (RO 4956371)（口服）的半衰期为 18 小时。将 CTEP (RO 4956371) 以生理盐水/吐温载体中的微悬浮液形式单次口服剂量 4.5 和 8.7 mg/kg 给予成年 C57BL/6 小鼠后，CTEP (RO 4956371) 被迅速吸收，并在约 30 分钟内达到接近最大暴露量。成年小鼠以每 48 小时口服 2 mg/kg 的剂量长期服用两个月，其脑部暴露的最低 CTEP (RO 4956371) 为 240 ng/g。 CTEP (RO 4956371) 在 mGlu5 表达已知的小鼠大脑区域中完全取代 [3H]ABP688，在全脑匀浆中评估时，导致平均化合物浓度为 77.5 ng/g 的剂量可以实现 50% 的取代[1]。在小鼠中，使用 CTEP（RO 4956371；2 mg/kg，po bid）每 48 小时可实现连续 mGlu5 占据。 Fmr1 敲除小鼠的海马长期抑郁加剧、蛋白质合成过多和听源性癫痫发作可通过 CTEP (RO 4956371)（2 mg/kg，口服）治疗得到纠正[2]。

---

在成年脆性X综合征（FXS）小鼠（Fmr1基因敲除小鼠）中，口服CTEP（RO4956371）（10 mg/kg，每日一次，持续4周）可纠正多种行为异常。它改善了社交互动缺陷（增加与陌生小鼠的互动时间），减少了重复性梳理行为，并在Morris水迷宫测试中增强了学习记忆能力（缩短逃避潜伏期，增加在目标象限的停留时间）[2]
在大鼠中，口服CTEP（RO4956371）（3、10、30 mg/kg）可剂量依赖性抑制mGlu5激动剂CHPG诱导的自发活动亢进，ED50为8.7 mg/kg[1]
在小鼠中，CTEP（RO4956371）（10 mg/kg，口服）可逆转东莨菪碱诱导的记忆障碍（新物体识别测试），将辨别指数提升至野生型对照组水平[1]

对于所有滤过性放射性配体结合试验，表达目标受体或受体组合的膜制剂在放射性配体结合缓冲液（15 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 5 mM KCl， 1.25 mM CaCl2和1.25 mM MgCl2, pH 7.4）中重悬，膜悬液与适当浓度的放射性配体和未标记药物混合在96孔板中，总量为200 μL，在适当温度下孵育60分钟。在孵育结束时，将膜过滤到Whatman unfilter上，用0.1%聚乙烯亚胺在ish缓冲液（50 mM tris - hcl, pH 7.4）中预孵育，用Filtermate 196收集机洗涤，并用冰冷的tris缓冲液洗涤三次。每孔加入45 μL MicroScint 40，振荡20 min后，在Topcount微孔板闪烁计数器上定量过滤上捕获的放射性。在中试实验中确定每个检测的膜浓度和孵育时间。[1]

---

mGlu5放射性配体结合实验：从表达人mGlu5的CHO细胞制备膜匀浆，将匀浆与固定浓度的[3H]-MPEP（选择性mGlu5拮抗剂）和不同浓度的CTEP（RO4956371）在25°C孵育60分钟。通过玻璃纤维滤膜快速过滤分离结合态和游离态配体，用冰浴缓冲液洗涤滤膜后，通过闪烁计数器测定放射性强度，基于竞争结合曲线计算Ki值[1]
钙动员实验：将CHO-hmGlu5细胞接种到96孔板中培养至汇合，用钙敏感荧光染料负载细胞37°C孵育60分钟。加入不同浓度的CTEP（RO4956371）孵育30分钟，用谷氨酸（100 μM）刺激，通过酶标仪实时记录荧光强度变化，计算抑制50%谷氨酸诱导钙反应的浓度（IC50）[1]

皮质神经元培养与ERK磷酸化检测：从胚胎18天小鼠分离皮质神经元，接种到多聚-D-赖氨酸包被的培养板中，用神经基底培养基培养7-10天。用CTEP（RO4956371）（0.1-100 nM）处理神经元30分钟，再用quisqualate（I组mGlu受体激动剂）刺激5分钟。裂解细胞后，通过SDS-PAGE分离蛋白并转移至膜上，用磷酸化ERK（p-ERK）和总ERK抗体进行探针杂交，化学发光法检测免疫反应性，密度法量化条带强度[1]
海马切片LTD实验：从成年FXS小鼠制备300 μm厚的海马切片，在人工脑脊液（ACSF）中32°C孵育1小时。在低频刺激（1 Hz，15分钟）诱导LTD前30分钟，向ACSF中加入CTEP（RO4956371）（1 μM）。LTD诱导后记录60分钟的场兴奋性突触后电位（fEPSPs），评估突触可塑性的恢复情况[2]

将 CTEP 溶于 0.9% NaCl (w/v) 和 0.3% Tween 80 (v/v) 溶液中；1 mg/kg；灌胃给药。雄性 Sprague-Dawley 大鼠。药物处理：CTEP 配制成溶于载体（0.9% NaCl，0.3% Tween-80）的微混悬液。慢性给药方案为每 48 小时一次，口服 (po) 给药，剂量为 2 mg/kg，灌胃体积为 10 ml/kg。对于 P30 之前的动物，急性给药（用于 LTD 和 AGS 实验）采用皮下注射 [2]

---

电生理学 [2]
Fmr1 KO 和野生型同窝对照小鼠分别接受 CTEP 或载体的急性（皮下注射，安乐死前 24 小时）或慢性（每 48 小时一次，持续 4-5 周）给药。在冰冷的解剖缓冲液（成分为：87 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH₂PO₄、25 mM NaHCO₃、0.5 mM CaCl₂、7 mM MgCl₂、75 mM 蔗糖、10 mM 葡萄糖、1.3 mM 抗坏血酸）中制备厚度为 350 µm 的海马横切片，并去除 CA3 区。切片在 32℃ 的人工脑脊液（ACSF，成分为：124 mM NaCl、5 mM KCl、1.23 mM NaH₂PO₄、26 mM NaHCO₃、10 mM 葡萄糖、1 mM MgCl₂、2 mM CaCl₂）中恢复 3 小时后进行记录。在刺激 Schaffer 侧支后，记录 CA1 放射层细胞外场电位。在20分钟的基线期内，每30秒测量一次诱发反应（初始斜率），然后施加50 µM DHPG（(RS)-3,5-二羟基苯基甘氨酸）5分钟以诱导LTD。基线漂移超过5%的实验在20分钟内被排除。切片的最大瞬时抑制（MTD）定义为DHPG施加后每个切片内抑制最显著的时间点。急性实验使用P25-P30小鼠，慢性实验使用P58-P65小鼠。为了清晰地呈现结果，每两个时间点（一分钟）取平均值，并作为一个点表示。

---

听源性癫痫[2]
在C57BL/6J和FVB遗传背景下，对Fmr1 KO和WT动物的听源性癫痫易感性进行了测试。 C57BL/6J 小鼠在出生后第 18 天 (P18) 至第 22 天 (P22) 之间进行测试，FVB 小鼠在出生后第 30 天 (P30) 至第 60 天 (P60) 之间进行测试。所有动物在测试前 4 小时接受载体或 CTEP（2 mg/kg，FVB 小鼠口服，C57BL/6J 小鼠皮下注射）。动物在行为测试箱中适应 1 分钟后，暴露于由个人警报器（改装的个人警报器，Radioshack 49-1010 型，由直流转换器供电）发出的 120 dB 声音。记录 2 分钟内的癫痫发作次数，或直至动物达到 AGS 终点之一（癫痫持续状态、呼吸停止、死亡）。

---

CTEP 药理学特性表征 [2]
采用 Lindemann 等人 (2011) 描述的 HPLC/MS 联用方法测定经处理动物血浆或脑组织中 CTEP 的浓度。采用[3H]-ABP688评估体内mGlu5受体占有率，方法如Lindemann等人(2011)所述。使用GastroPlus软件6.1版，结合Emax模型（用于占有率估计），模拟慢性给药期间的血浆浓度和受体占有率。采用拟合单次给药数据的模型模拟多次给药的血浆药代动力学，并验证其与慢性研究期间的稀疏浓度测量值相符。占有率模型使用的参数根据体内结合研究中测得的血浆浓度和占有率估计得出（Emax = 92%，EC50 = 12.1 ng/ml）。代谢标记[2]代谢标记基本按照Osterweil等人(Osterweil等人，2010)所述进行。简而言之，从4周龄动物中制备500 µm厚的海马切片，并在32.5°C下于人工脑脊液（ACSF，成分为124 mM NaCl、3 mM KCl、1.25 mM NaH₂PO₄、26 mM NaHCO₃、1.0 mM MgCl₂、2.0 mM CaCl₂和10 mM葡萄糖，并用95% O₂和5% CO₂饱和）中孵育。经过3.5小时的恢复期后，加入终浓度为25 µM的放线菌素D和终浓度为10 µM的CTEP或溶剂对照，继续孵育30分钟。随后，向浴液中加入终浓度为9.5 µM（11 µCi/ml）的[³⁵S]标记氨基酸混合物（Express蛋白标记混合物）。将切片孵育 30 分钟后，将切片转移到冰冷的 ACSF 中，以停止放射性氨基酸的掺入。将切片在蛋白裂解缓冲液（10 mM HEPES pH 7.4、2 mM EDTA、2 mM EGTA、1% TX100 和蛋白酶抑制剂）中匀浆，并用三氯乙酸沉淀匀浆液中的蛋白质以去除未结合的氨基酸。采用液体闪烁计数法测定结合的放射性，并进行猝灭校正，然后根据蛋白质浓度和反应介质的比放射性进行标准化。

---

---

mGlu5激动剂诱导的大鼠运动亢进试验：将雄性大鼠随机分为对照组和治疗组。CTEP (RO4956371)悬浮于0.5%甲基纤维素中，并以3、10或30 mg/kg的剂量口服给药。一小时后，大鼠腹腔注射CHPG (100 mg/kg)。使用自动活动监测仪测量运动活性。 60分钟，记录总运动距离和站立次数[1]
脆性X综合征小鼠模型研究：将8-10周龄的成年Fmr1基因敲除小鼠随机分为载体组和治疗组。CTEP (RO4956371)溶于0.5%甲基纤维素溶液中，每日一次口服10 mg/kg，持续4周。载体组给予等体积的0.5%甲基纤维素溶液。在治疗的最后一周进行行为学测试（社交互动测试、重复梳理行为测试、莫里斯水迷宫测试）。行为学测试结束后，处死小鼠，收集脑组织（海马、皮层）进行突触功能分析[2]
东莨菪碱处理小鼠的新物体识别实验：雄性小鼠在实验前1小时预先口服CTEP (RO4956371)（1、3、10 mg/kg）或载体。腹腔注射东莨菪碱（1 mg/kg）。30 分钟后，小鼠进入训练阶段（暴露于两个相同的物体 10 分钟）。24 小时后，进行测试阶段（一个熟悉物体和一个新物体，持续 10 分钟），并计算辨别指数，公式为（新物体暴露时间 - 熟悉物体暴露时间）/（总探索时间）[1]

口服吸收：CTEP (RO4956371)具有较高的口服生物利用度，大鼠口服给药后约为73%，小鼠约为85%[1]
分布：CTEP广泛分布于组织中，大鼠的分布容积(Vdss)约为2.1 L/kg，小鼠约为1.8 L/kg。CTEP脑渗透性极佳，大鼠脑/血浆浓度比约为1.2，小鼠约为1.5[1]
代谢：CTEP主要在肝脏通过细胞色素P450 3A4 (CYP3A4)和CYP2C19代谢，生成无活性代谢物[1]
排泄：CTEP在大鼠体内的消除半衰期(t1/2)约为6.2小时，在小鼠体内约为4.1小时。约 65% 的剂量经粪便排出，25% 经尿液排出，不足 5% 以原药形式排出 [1]
血浆蛋白结合率：CTEP (RO4956371) 在大鼠和人体中均具有较高的血浆蛋白结合率 (>99%) [1]

在大鼠和小鼠中进行的急性毒性研究表明，口服剂量高达 300 mg/kg 时，未观察到死亡或明显的毒性。在大鼠中进行的亚慢性毒性研究（28 天），口服剂量分别为 10、30 和 100 mg/kg/天，结果显示体重、食物摄入量或血液学/生化指标（肝功能、肾功能、电解质）均无显著变化[1]。对受试动物的主要器官（肝脏、肾脏、大脑、心脏）进行组织病理学检查，未观察到肝毒性或肾毒性的证据[1]。在对 FXS 小鼠进行 4 周的长期（10 mg/kg/天）治疗中，CTEP (RO4956371) 未引起行为异常、体重减轻或器官损伤[2]。

[1]. CTEP: a novel, potent, long-acting, and orally bioavailable metabotropic glutamate receptor 5 inhibitor. J Pharmacol Exp Ther. 2011 Nov;339(2):474-86.

[2]. Chronic pharmacological mGlu5 inhibition corrects fragile X in adult mice. Neuron. 2012 Apr 12;74(1):49-56.

代谢型谷氨酸受体5 (mGlu5) 是一种谷氨酸激活的CG类蛋白偶联受体，广泛表达于中枢神经系统，并作为多种疾病（包括抑郁症、帕金森病和脆性X综合征）的药物靶点进行临床研究。本文介绍了一种新型高效、选择性强且口服生物利用度高的mGlu5负变构调节剂——2-氯-4-((2,5-二甲基-1-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1H-咪唑-4-基)乙炔基)吡啶 (CTEP)。CTEP与mGlu5的亲和力低至纳摩尔级，并且在针对包括所有已知mGlu受体在内的103个靶点的测试中显示出超过1000倍的选择性。 CTEP 能以 2.6 的脑/血浆比穿透脑组织，并在小鼠体内从表达 mGlu5 的脑区置换示踪剂 [(3)H]3-(6-甲基-吡啶-2-基乙炔基)-环己-2-烯酮-O-甲基肟 (ABP688)，其平均 ED(50) 相当于脑组织中药物浓度为 77.5 ng/g。这种新型 mGlu5 抑制剂在小鼠应激诱导高热模型和大鼠 Vogel 冲突饮水试验中均表现出活性，最小有效剂量分别为 0.1 mg/kg 和 0.3 mg/kg，表明其体内效力比 2-甲基-6-(苯乙炔基)吡啶 (MPEP) 和苯巴胺高 30 至 100 倍。 CTEP是首个报道的mGlu5抑制剂，其半衰期长达约18小时，且口服生物利用度高，因此在成年和新生动物中，每48小时给药一次即可实现持续的受体阻断，从而进行长期治疗。CTEP能够覆盖广泛的年龄范围，使其能够用于长期治疗，从而有助于探索mGlu5抑制剂在需要长期受体抑制的适应症中的全部治疗潜力。[1]

---

脆性X综合征（FXS）是最常见的遗传性智力障碍。既往研究表明mGlu5参与了该疾病的发病机制，但一个关键的未解之谜是，药理学抑制mGlu5是否能够逆转哺乳动物中已建立的FXS表型。本研究利用新型、高效且选择性的mGlu5抑制剂CTEP，在Fmr1基因敲除小鼠中探讨了这一问题。急性CTEP治疗可纠正海马长期抑制、蛋白质合成和听源性癫痫发作的异常。长期治疗将mGlu5受体占有率控制在81%±4%的范围内，可以改善认知缺陷、听觉过敏、异常树突棘密度、ERK和mTOR信号通路过度激活，并部分纠正睾丸肥大。这项研究表明，在FXS表型出现后，从青年时期开始进行药物干预，可以实现表型的全面矫正。这些发现如何转化为正在进行的针对脆性X综合征（FXS）患者的mGlu5抑制剂临床研究，令人非常感兴趣。[2]

---

CTEP (RO4956371)是一种新型、高效、长效且口服生物利用度高的选择性mGlu5抑制剂。[1]
其作用机制涉及与mGlu5的变构位点竞争性结合，从而阻断谷氨酸诱导的受体激活及其下游信号通路（PLC-IP3-Ca2+和ERK-MAPK）。[1]
基于其在FXS动物模型中纠正突触和行为缺陷的临床前疗效，CTEP有望成为治疗神经发育障碍（尤其是脆性X综合征）的候选药物。[2]
与其他mGlu5抑制剂相比，CTEP (RO4956371)具有半衰期更长、口服生物利用度更高、脑渗透性更好等优势，支持每日一次口服给药。 [1]

C19H13CLF3N3O

391.77

391.07

C, 58.25; H, 3.34; Cl, 9.05; F, 14.55; N, 10.73; O, 4.08

871362-31-1

11646823

Light yellow to yellow solid powder

4.835

39.94

0

6

4

27

568

0

GOHCTCOGYKAJLZ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H13ClF3N3O/c1-12-17(8-3-14-9-10-24-18(20)11-14)25-13(2)26(12)15-4-6-16(7-5-15)27-19(21,22)23/h4-7,9-11H,1-2H3

2-chloro-4-[2-[2,5-dimethyl-1-[4-(trifluoromethoxy)phenyl]imidazol-4-yl]ethynyl]pyridine

RO-4956371; CTEP; RO4956371; 871362-31-1; 2-chloro-4-((2,5-dimethyl-1-(4-(trifluoromethoxy)phenyl)-1H-imidazol-4-yl)ethynyl)pyridine; mGluR5 inhibitor; CTEP (RO4956371); 2-chloro-4-[2-[2,5-dimethyl-1-[4-(trifluoromethoxy)phenyl]imidazol-4-yl]ethynyl]pyridine; E3BWG5775S; CHEMBL3410223; RO 4956371;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.38 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (6.38 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.38 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

配方 4 中的溶解度: 30% propylene glycol, 5% Tween 80, 65% D5W: 6 mg/mL

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。