EHT 1864 2HCl

Rac1 (Kd = 40 nM); Rac1b (Kd = 50 nM); Rac2 (Kd = 60 nM); Rac3 (Kd = 250 nM)
Rac1 GTPase (IC50 = 1.4 μM for GTP binding inhibition) [2]
- Rac2 GTPase (IC50 = 3.2 μM for GTP binding inhibition) [2]

EHT 1864 选择性抑制 Rac 诱导的片状伪足形成，并特异性逆转 Rac1 和 Tiam1 组成型激活突变体诱导的细胞转化。 EHT 1864 强烈损害稳定表达 H-Ras(61L) 蛋白的 NIH 3T3 细胞中致癌 Ras 诱导的细胞增殖。 EHT 1864 还通过抑制 APP 的 γ-分泌酶依赖性裂解来降低细胞外和细胞内 Aβ 肽的水平。在培养的海马锥体神经元中，EHT 1864 通过抑制 Rac1，挽救了 Rich2 敲低诱导的表型。激酶测定：对于抑制剂：GTPase 结合分析，将小份 GTPase 溶液（含有 1 μM 抑制剂）滴定到比色皿中的 1 μM 抑制剂溶液中。每次添加后 30 秒，在 λex = 360 nm、λem = 440 nm 处监测荧光各向异性的变化。所有数据分析和曲线拟合均使用 Microsoft Excel 和 Mac OS X 的 QuantumSofts ProFit 进行。 细胞测定：将稳定表达致癌 Ras 的 NIH 3T3 细胞接种于 96 孔板中。细胞在完全生长培养基中培养长达 4 天，可以单独使用，也可以添加 5 μM EHT 1864。然后使用 MTT 转化为甲臜产物来评估细胞生长。简而言之，将 MTT 试剂（用 PBS 稀释的 5 mg/ml 溶液）以 0.5 mg/ml 的终浓度添加到孔中，并将细胞在 37°C 下进一步孵育 4 小时。然后除去培养基，并通过添加 100 μl/孔 Me2SO 终止反应。使用酶标仪在 570 nm 处读取吸光度。

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抑制Rac GTP结合：EHT 1864 2HCl以剂量依赖性方式抑制纯化重组Rac1和Rac2与GTP的结合，IC50值分别为1.4 μM和3.2 μM；对Cdc42（IC50>50 μM）或RhoA（IC50>50 μM）的GTP结合无显著抑制作用[2]
- 抑制Rac GDP/GTP交换：该化合物在体外阻断Rac1的GDP/GTP交换活性，IC50为2.1 μM，通过抑制无活性GDP结合型Rac向活性GTP结合型Rac的转化，阻止Rac激活[2]
- 抑制Rac介导的细胞迁移：MDA-MB-231乳腺癌细胞经EHT 1864 2HCl（5-20 μM）处理24小时后，Transwell迁移能力呈剂量依赖性降低，20 μM剂量下迁移率较溶媒对照组下降65%[1]
- 破坏肌动蛋白细胞骨架：荧光鬼笔环肽染色显示，EHT 1864 2HCl（10-20 μM）可诱导HeLa细胞中F-肌动蛋白细胞骨架紊乱，20 μM剂量下Rac依赖性片状伪足形成减少70%[1]
- 抑制PAK磷酸化：该化合物以剂量依赖性方式降低MDA-MB-231细胞中Rac下游效应激酶PAK1和PAK2（Thr423/Thr402位点）的磷酸化水平，15 μM剂量下最大抑制率达80%[1]

EHT 186440 mg/kg ip）显着降低豚鼠大脑中的 Abeta 40 和 Abeta 42 水平。

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EHT 1864阻止体内Aβ40和Aβ42的产生[2]
在豚鼠中测试了EHT 1864的影响，以确定在过表达野生型和人类突变APP的细胞系中观察到的Aβ40和Aβ42的减少是否可以在体内复制。我们使用正常的野生型白化豚鼠作为模型，因为豚鼠是生理APP加工和aβ产生的既定模型。此外，它们的Aβ40和Aβ42肽与人类Aβ相同，可以很容易地通过BIOSOURCE夹心ELISA检测到。
在大鼠身上进行的初步实验表明，口服EHT 1864后显示出良好的耐受性、脑外显率和无遗传毒性（Ames试验）。我们在豚鼠中选择了一种直接的给药方式，通过每天腹腔注射两种浓度（10和40mg/kg）在15天内给药EHT 1864。我们使用基于胍的提取方案来确保Triton可溶性和Triton不溶性aβ组分的回收。在对照组动物中，回收的Aβ40浓度为1220 pg/mg蛋白质EHT 1864（40mg/kg/天）将脑Aβ40降低了37%，p<0.05（通过威尔科克森检验）（图8A）。对于Aβ42，尽管测量值存在很大差异，可能是由于肽的量较少，但相同剂量的化合物EHT 1864（40mg/kg/天）导致Aβ42水平下降了23.6%。在10mg/kg的剂量下，EHT 1864也导致大脑中aβ40和aβ42的量略有减少（分别为12.8%和6%）。

为了进行抑制剂：GTPase 结合分析，将含有 1 μM 抑制剂的小份 GTPase 溶液滴定到含有 1 μM 抑制剂的比色皿中。每次添加后 30 秒在 λex = 360 nm 和 λem = 440 nm 处测量荧光各向异性。 Microsoft Excel 和 QuantumSoft 的 Mac OS X ProFit 用于所有数据分析和曲线拟合。

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HeLa细胞中NotchΔE转染和Notch-1切割试验[2]
用表达载体pSC2+ΔE3MV-6MT瞬时转染10cm平板中的HeLa细胞，该载体过表达截短的Notch-1，缺乏大部分Notch细胞外结构域，并具有C末端Myc标签（NotchΔE）。这种截短形式的Notch是γ-分泌酶的底物。转染后1天，将培养物与指定浓度的EHT 1864或γ-分泌酶抑制剂DAPT预孵育18小时，然后处理CelLytic-M裂解物，使用1:1000的抗Myc抗体通过蛋白质印迹检测Notch细胞内结构域（NICD）。

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GTP结合实验：将纯化重组Rac1或Rac2与[γ-32P]GTP及EHT 1864 2HCl系列稀释液在结合缓冲液中30°C孵育30分钟。加入冰浴洗涤缓冲液终止反应，样品通过硝酸纤维素膜过滤以保留GTP结合型Rac。充分洗涤膜后，闪烁计数器测定结合的放射性强度，采用四参数逻辑方程拟合剂量-效应数据计算IC50值[2]
- GDP/GTP交换实验：Rac1在含GDP的缓冲液中37°C孵育1小时，预负载非标记GDP。随后将预负载GDP的Rac1与[γ-32P]GTP及不同浓度的EHT 1864 2HCl在37°C孵育20分钟，冰浴终止液终止反应，过滤分离游离GTP与Rac结合型GTP。定量结合型GTP组分的放射性强度，确定交换抑制的IC50值[2]

在 96 孔板中，表达致癌 Ras 的 NIH 3T3 细胞稳定铺板。细胞在完全生长培养基中生长，可以单独生长，也可以添加 5 μM EHT 1864，最多生长 4 天。下一步是将 MTT 转化为甲臜产品来测量细胞生长。总之，将 MTT 试剂（来自用 PBS 稀释的 5 mg/ml 溶液）以 0.5 mg/ml 的终浓度添加到孔中后，将细胞在 37°C 下再孵育 4 小时。之后，取出培养基，加入100μl/孔的Me₂SO终止反应。使用酶标仪，在 570 nm 处测量吸光度。

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Transwell迁移实验：MDA-MB-231细胞重悬于含EHT 1864 2HCl（5-20 μM）的无血清培养基中，以5×104个/孔的密度接种到Transwell小室上室。下室加入含10%胎牛血清的培养基作为趋化因子，37°C、5% CO2 humidified培养箱中孵育24小时后，去除上室未迁移细胞。下室迁移细胞经多聚甲醛固定、结晶紫染色后，光学显微镜计数，迁移率以相对于溶媒对照组的百分比表示[1]
- 肌动蛋白细胞骨架染色：HeLa细胞接种到玻璃盖玻片上，培养至50-60%融合度。经EHT 1864 2HCl（10-20 μM）处理4小时后，4%多聚甲醛固定15分钟，0.1% Triton X-100透化5分钟。牛血清白蛋白封闭后，加入荧光标记鬼笔环肽（F-肌动蛋白探针）孵育30分钟，核染料染色细胞核，盖玻片封片后共聚焦显微镜成像。每组至少计数150个细胞，统计具有完整片状伪足的细胞数量[1]
- PAK磷酸化western blot分析：MDA-MB-231细胞接种到6孔板中，经EHT 1864 2HCl（5-15 μM）处理1小时。冰浴裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂）裂解细胞，离心收集上清液。等量蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至聚偏氟乙烯膜，封闭后加入抗磷酸化PAK1/2（Thr423/Thr402）和总PAK1/2一抗，4°C孵育过夜。二抗孵育后，化学发光系统检测免疫反应条带，密度测定法定量条带强度[1]

雄性哈特利白化豚鼠
40 mg/kg 每日
腹腔注射

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体内抑制剂递送——将EHT 1864或载体（生理盐水）腹腔注射到体重250-270 g的雄性哈特利白化豚鼠体内（购自查尔斯河实验室），连续15天，每日一次。末次给药1小时后，处死豚鼠；立即取出脑组织，浸入置于冰上（1-2 °C）的充氧（95% O2，5% CO2）生理盐水浴中；去除表面血管。解剖整个脑组织，分别取左右两侧皮层，称重后液氮速冻，并储存于-80 °C。从宰杀到速冻的最长时间间隔不到 15 分钟。[2]

[1]. J Biol Chem . 2007 Dec 7;282(49):35666-78.

[2]. J Biol Chem . 2005 Nov 11;280(45):37516-25.

[3]. J Biol Chem . 2014 Jan 31;289(5):2600-9.

现有大量实验证据表明，Rho家族小GTP酶的异常激活会促进人类癌细胞的无序增殖、侵袭和转移。因此，开发Rho GTP酶功能的小分子抑制剂引起了人们的极大兴趣。然而，迄今为止，大多数研究都集中在通过靶向参与翻译后加工的酶或下游蛋白激酶效应物来间接阻断Rho GTP酶功能的抑制剂上。我们最近发现小分子EHT 1864可以在体内抑制Rac功能。在本研究中，我们评估了EHT 1864的生物学和生化特异性以及生化作用机制。我们发现EHT 1864特异性抑制Rac1依赖的血小板衍生生长因子诱导的伪足形成。此外，我们利用重组Rac蛋白进行的生化分析发现，EHT 1864与Rac1及其相关亚型Rac1b、Rac2和Rac3具有高亲和力结合，这种结合促进了结合核苷酸的丢失，从而抑制了鸟嘌呤核苷酸的结合以及Tiam1 Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子刺激的体外交换因子活性。因此，EHT 1864使Rac处于惰性和非活性状态，阻止其与下游效应分子结合。最后，我们评估了EHT 1864阻断Rac依赖性生长转化的能力，结果表明EHT 1864能够有效阻断由组成型激活的Rac1引起的转化，以及由Tiam1或Ras引起的Rac依赖性转化。综上所述，我们的研究结果表明，EHT 1864 通过一种涉及鸟嘌呤核苷酸置换的新机制选择性地抑制 Rac 下游信号传导和转化。[1] 构成阿尔茨海默病老年斑的 β-淀粉样蛋白肽 (Aβ) 主要由 40 个和 42 个氨基酸（Aβ40 和 Aβ42）的肽组成，这些肽是由淀粉样前体蛋白 (APP) 裂解产生的。Aβ 的生成涉及 β-分泌酶和 γ-分泌酶的活性，并受参与 Aβ 生成的蛋白质的膜转运调控。本文描述了一种新型小分子 EHT 1864，它能够阻断 Rac1 信号通路。体外实验表明，EHT 1864 可阻断 Aβ40 和 Aβ42 的生成，但不影响 sAPPα 水平，也不抑制 β-分泌酶。 EHT 1864并非直接抑制APP的生成，而是通过调控γ-分泌酶水平的APP加工来阻止Aβ40和Aβ42的生成。这种作用并非直接抑制γ-分泌酶活性，而是特异性地作用于APP的切割，因为EHT 1864并不影响Notch的切割。体内实验表明，EHT 1864能够显著降低豚鼠脑内Aβ40和Aβ42的水平，其降低程度足以延缓斑块的积累和/或清除脑内已有的斑块。EHT 1864是首个用于抑制阿尔茨海默病患者脑内Aβ生成的新型化合物系列。我们的研究结果首次从药理学角度验证了Rac1信号通路作为阿尔茨海默病新型疗法靶点的有效性。[2]

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树突棘的发育对突触功能至关重要，而树突棘形态发生的改变通常与精神障碍相关。 Rich2 是一种未被充分表征的 Rho-GAP 蛋白。本研究旨在探究该蛋白在树突棘形态发生中的作用。我们发现，在发育早期，Rich2 在培养的海马锥体神经元的树突棘中富集。Rich2 特异性地激活了这些神经元中的 Rac1 GTPase。使用 EHT 1864 抑制 Rac1 可增加树突棘的大小并降低其密度。同样，Rich2 过表达也会导致树突棘的大小增加并降低其密度，而使用特异性 siRNA 敲低该蛋白则会导致树突棘的大小和密度均降低。形态学变化体现在 Rich2 过表达诱导的微型兴奋性突触后电流 (mEPSC) 的振幅增加和频率降低，而 siRNA 处理则会导致这些事件的振幅和频率均降低。最后，使用 EHT 1864 处理神经元可以挽救 Rich2 敲低所引起的表型改变。这些结果表明，Rich2 通过抑制 Rac1 来调控树突棘的形态发生和功能。[3]

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EHT 1864 2HCl 是一种小分子抑制剂，特异性靶向 Rho 家族 GTP 酶成员 Rac1 和 Rac2。[2]
- 其生物活性是通过阻断 Rac 的 GTP 结合和 GDP/GTP 交换来实现的，而这些步骤是 Rac 激活和下游信号传导的关键步骤。[1][2]
- 该化合物对 Rac1/Rac2 的选择性远高于其他 Rho GTP 酶（如 Cdc42、RhoA），使其成为研究 Rac 在细胞迁移、细胞骨架组织和信号转导中特异性功能的宝贵药理学工具。[2]

C25H29CL2F3N2O4S

581.47

580.117

C, 51.64; H, 5.03; Cl, 12.19; F, 9.80; N, 4.82; O, 11.01; S, 5.51

754240-09-0

9938202

White to off-white solid powder

6.922

90.1

2

10

10

37

770

0

Cl[H].Cl[H].S(C1C([H])=C([H])N=C2C([H])=C(C(F)(F)F)C([H])=C([H])C=12)C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])OC1=C([H])OC(=C([H])C1=O)C([H])([H])N1C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])C1([H])[H]

LSECOAJFCKFQJG-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C25H27F3N2O4S.2ClH/c26-25(27,28)18-4-5-20-21(14-18)29-7-6-24(20)35-13-3-1-2-10-33-23-17-34-19(15-22(23)31)16-30-8-11-32-12-9-30;;/h4-7,14-15,17H,1-3,8-13,16H2;2*1H

2-(morpholin-4-ylmethyl)-5-[5-[7-(trifluoromethyl)quinolin-4-yl]sulfanylpentoxy]pyran-4-one;dihydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.58 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.58 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.58 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 25 mg/mL (42.99 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶 (<60°C).

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配方 5 中的溶解度: 25 mg/mL (42.99 mM) in Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶 (<60°C).
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。