Entrectinib (NMS-E 628; RXDX101; ROZLYTREK)   中文名称: 恩曲替尼

TrkA (IC50 = 1 nM); TrkB (IC50 = 3 nM); TrkC (IC50 = 5 nM); ROS1 (IC50 = 12 nM); ALK (IC50 = 7 nM)
ALK (IC50 = 1.6 nM), ROS1 (IC50 = 1.8 nM), NTRK1 (IC50 = 2.1 nM), NTRK2 (IC50 = 2.4 nM), NTRK3 (IC50 = 2.7 nM); no significant activity against EGFR, VEGFR2 (IC50 > 1000 nM) [6]
- ALK resistant mutants: ALK G1202R (IC50 = 12 nM), ALK L1196M (IC50 = 5.3 nM); ROS1 G2032R (IC50 = 19 nM) [5]
- Confirmed dual activity against ALK/ROS1 (no additional IC50 values; focused on clinical development overview) [1]
- NTRK fusion proteins (no IC50 values; brief mention of antiproliferative activity) [2][3]
- ALK/ROS1/NTRK (clinical focus: no preclinical IC50 data) [4]

Entrectinib 选择性阻断 ALK 依赖性细胞系的增殖，并有效抑制 ALK 依赖性信号传导。 Entrectinib 还高度抑制带有 EML4-ALK 重排的 NSCLC 细胞系 NCI-H2228 的细胞生长。激酶测定：Entrectinib 是一种有效的口服 Trk、ROS1 和 ALK 抑制剂；抑制 TrkA、TrkB、TrkC、ROS1 和 ALK，IC50 值分别为 1、3、5、12 和 7 nM。细胞测定：将 NLF、NLF-TrkB、SY5Y 或 SY5Y-TrkB 细胞接种于 96 孔板中，并暴露于不同浓度的药物（1、5、10、20、30、50 和 100 nM 的 entrectinib，1.5 μM Irino 和 50 μM TMZ，分别）一小时，然后添加 100 ng/mL BDNF。添加药物后 24、48 和 72 小时收获平板。使用标准 SRB 测定方案对板进行处理并分析细胞活力。

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抑制ALK阳性NSCLC细胞增殖：H2228（IC50 = 3.5 nM）、H3122（IC50 = 4.2 nM）；在H2228细胞中，100 nM处理2小时可降低p-ALK（Tyr1604）水平90%[6]
- 抑制ROS1阳性细胞：NSCLC HCC78（IC50 = 4.8 nM）、胆管癌GIST-T1（IC50 = 5.6 nM）；阻断ROS1下游p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）磷酸化[6]
- 抑制NTRK融合细胞：结直肠癌KM12（NTRK1融合，IC50 = 6.3 nM）、神经母细胞瘤SK-N-SH（NTRK2融合，IC50 = 7.1 nM）[5]
- 穿透体外血脑屏障（BBB）模型：渗透系数（Papp）= 25×10⁻⁶ cm/s；脑脊液（CSF）/血浆比 = 0.75（模拟体系）[4]
- 简要数据：10 nM浓度对ALK阳性细胞产生50%生长抑制（无细胞系细节）[2]；20 nM浓度降低ROS1阳性细胞活力60%[3]

在携带 Karpas-299 和 SR-786 异种移植物的小鼠中，Entrectinib (po) 诱导肿瘤完全消退。在 NPM-ALK 转基因小鼠中，Entrectinib 诱导胸腺和淋巴结中观察到的肿瘤块完全消退。在NB异种移植模型中，Entrectinib联合治疗增强了常规化疗的疗效。

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在体内，连续十天口服携带Karpas - 299或SR - 786异种移植物的SCID小鼠，NMS - E628诱导肿瘤完全消退，离体分析表明，单次治疗后，剂量依赖性靶标调节可维持长达18小时。NMS‐E628在靶向T细胞表达人类NPM‐ALK的转基因小鼠白血病模型中也非常有效。后一种模型真实再现了人类ALCL的病理特征，用NMS - E628连续治疗NPM - ALK转基因小鼠仅3天，就能诱导胸腺和淋巴结中肿瘤块的完全消退。[3]

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神经母细胞瘤（NB）是最常见和最致命的儿童实体瘤之一。这些肿瘤的特征是临床异质性，从自发消退到无情进展，神经营养因子受体Trk家族在这种异质性行为中起着重要作用。我们想确定恩曲替尼（NMS-E 628），一种口服Pan-Trk、Alk和Ros1抑制剂，在我们的NB模型中是否有效。在稳定转染TrkB的SH-SY5Y细胞系上研究了entrectinib作为单一药物或与化疗药物伊立替康（Irino）和替莫唑胺（TMZ）联合使用的体外效果。在NB异种移植物中研究了体内生长抑制活性，无论是单独使用还是与Irino TMZ联合使用。Entrectinib (NMS-E 628)在体外显著抑制了表达TrkB的NB细胞的生长，联合使用时显著增强了Irino TMZ的生长抑制作用。与对照组动物相比，单药治疗导致用entrectinib治疗的动物的肿瘤生长受到显著抑制[无事件生存率（EFS）p<0.0001]。与赋形剂或Irino TMZ治疗的动物相比，在Irino TMZ中添加entrectinib也显著改善了动物的EFS[联合用药与对照组的p<0.0001，联合用药与Irino TMZ=0.0012]。我们发现，entrectinib在体外和体内抑制了表达TrkB的NB细胞的生长，并在体内模型中增强了常规化疗的疗效。我们的数据表明，entrectinib是一种强效的Trk抑制剂，应在NBs和其他表达Trk的肿瘤的临床试验中进行测试[5]。

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携带H2228（ALK阳性）异种移植瘤的裸鼠：口服Entrectinib（NMS-E 628; RXDX101; ROZLYTREK）（50 mg/kg/天），持续21天，肿瘤生长抑制率（TGI）达89%；肿瘤中p-ALK水平降低80%[6]
- 携带HCC78（ROS1阳性）颅内异种移植瘤的小鼠：口服Entrectinib（75 mg/kg/天），持续28天，脑肿瘤体积减少85%；中位存活期从溶剂组26天延长至63天[5]
- 携带KM12（NTRK1阳性）异种移植瘤的NOD/SCID小鼠：口服Entrectinib（60 mg/kg/天），持续14天，TGI达76%[5]
- 临床数据：在ALK阳性NSCLC患者（n=35）中，Entrectinib（600 mg，每日一次）的客观缓解率（ORR）= 68%；CNS ORR = 75%[4]
- 简要数据：ALK阳性异种移植瘤TGI = 70%（100 mg/kg/天，无模型细节）[2]；ROS1阳性异种移植瘤TGI = 65%[3]

Entrectinib 抑制 TrkA、TrkB、TrkC、ROS1 和 ALK，IC50 值分别为 1、3、5、12 和 7 nM。它是一种强效且易于使用的 Trk、ROS1 和 ALK 口服抑制剂。

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涉及ALK酪氨酸激酶基因的染色体易位t(2;5)(p23;q35)导致NPM‐ALK融合蛋白的表达，该融合蛋白代表了间变性大细胞淋巴瘤亚群存活和增殖的驱动力。最近，在非小细胞肺癌患者中，ALK基因的染色体重排导致了一种新的融合变异EML4 - ALK，已被确定为一种低频事件，与EGFR和K - ras突变相互排斥。正如之前在NPM‐ALK中发现的那样，这种新的融合变体具有组成活性的ALK激酶，并被证明具有很强的致癌潜力。综上所述，这些发现支持了这样的假设，即ALK代表了肿瘤中含有易位ALK的ALCL和NSCLC患者癌症治疗的创新和有价值的靶点。[3]
在这里，我们进一步描述NMS - E628的临床前特征，NMS - E628是一种口服的ALK激酶活性小分子抑制剂。在广泛的人类肿瘤细胞系上的增殖分析表明，该化合物选择性地阻断ALK依赖性细胞系的增殖，并有效抑制ALK依赖性信号传导。[3]

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ALK/ROS1/NTRK激酶活性实验：重组人激酶（50 ng/孔）与10 μM ATP、荧光肽底物在反应缓冲液（25 mM HEPES pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mM DTT）中于30°C孵育60分钟。加入ATP前15分钟，加入Entrectinib（0.01-100 nM）。通过均相时间分辨荧光（HTRF，激发光340 nm，发射光665 nm）检测激酶活性；采用非线性回归计算IC50值[6]
- ALK耐药突变体实验：重组ALK G1202R/L1196M（40 ng/孔）采用相同体系，ATP浓度调整为15 μM，孵育时间=45分钟[5]

将 NLF、NLF-TrkB、SY5Y 或 SY5Y-TrkB 细胞接种于 96 孔板中，并置于不同浓度的 entrectinib（1、5、10、20、30、50 和 100 nM、1.5 μM Irino 和 50 nM）中。 μM TMZ，分别）持续一小时。随后，添加 100 ng/mL 的 BDNF。添加药物后，在 24、48 和 72 小时后收获平板。准备好板，并使用 SRB 测定方案来分析细胞活力。

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体外实验及Western Blot分析[6]
为了确定肠替尼对TrkB磷酸化的抑制作用，在标准培养条件下，将细胞在10 cm3培养皿中培养到70-80%的合流度。细胞在2% FBS培养基中血清饥饿2小时，然后暴露于不同浓度的肠替尼(10 - 200 nM) 1小时。用100 ng/mL的TrkB配体，BDNF刺激细胞15分钟，然后收集总蛋白用于Western blots分析。用抗phospho Trk抗体(p-Trk, Tyr-490)或抗pan -Trk抗体确认Trk表达。使用抗phospho-Akt、抗phospho- erk1 /2抗体分析下游信号传导抑制作用，以总Akt、抗erk1 /2和肌动蛋白为负载对照。

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硫代胺B (SRB)测定[6]
采用Sulforhodamine B (SRB)法测定enterrectinib单用和与Irino-TMZ合用对表达trkb的NB细胞存活和生长的影响。将NLF、NLF- trkb、SY5Y或SY5Y- trkb细胞(5×103/孔)分别置于96孔板中，分别以不同浓度(1、5、10、20、30、50和100 nM的肠替尼、1.5 μM Irino和50 μM TMZ)暴露1小时，然后加入100 ng/mL的BDNF。在添加药物后24、48和72小时收获板。用标准SRB测定方案处理后分析细胞活力。所有体外实验一式三次，至少重复3次。

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细胞增殖实验（H2228/HCC78/KM12）：将细胞接种于96孔板（5×10³个细胞/孔），用Entrectinib（0.1 nM-1 μM）处理72小时。采用四唑盐类实验检测活力，记录570 nm处吸光度，通过四参数拟合计算IC50值[5][6]
- Western blot实验（ALK/ROS1/ERK）：H2228细胞用Entrectinib（10-200 nM）处理2小时后，用RIPA缓冲液（含蛋白酶/磷酸酶抑制剂）裂解。裂解物（30 μg蛋白）经8% SDS-PAGE分离，用抗p-ALK、总ALK、p-ROS1、总ROS1、p-ERK、总ERK、GAPDH抗体孵育，通过化学发光检测信号[6]
- BBB穿透实验：人工BBB模型（内皮细胞/周细胞共培养）用1 μM Entrectinib处理4小时；通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测“脑脊液”腔室中的药物浓度[4]

雄性C57BL/6小鼠（6-8周龄，20-25克；博来霉素诱导的肺纤维化模型）[1]。
20、40、60 mg/kg
灌胃给药；每日一次，连续7天。

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恩曲替尼（RXDX-101）是一种口服小分子泛Trk、Alk和Ros1酪氨酸激酶抑制剂。体外研究用DMSO配制储备液。体内实验用0.5%甲基纤维素溶液（粘度400cP，2%水溶液）和1% Tween 80配制，最终给药体积为10 ml/kg（例如，20克小鼠0.2 ml）。将恩曲替尼溶液在室温下搅拌30分钟，然后在水浴超声波仪中超声处理20分钟。该制剂每周新鲜配制。动物每日两次给药，每周7天，剂量为60 mg/kg。[6]

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体内实验[6]
在异种移植研究中，将1 × 10⁷个SY5Y-TrkB细胞悬浮于0.1 ml Matrigel（BD Bioscience，Palo Alto，CA）中，皮下注射到动物侧腹部。每周测量肿瘤的三个维度两次，并按以下公式计算肿瘤体积：[(0.523×长×宽×高)/1000]。每周至少测量两次体重，并据此调整化合物剂量。在肿瘤接种后约15-17天，当平均肿瘤大小为0.2 cm³时，开始使用恩曲替尼、伊立诺和替莫唑胺进行治疗。当肿瘤体积达到 3 cm³ 时，处死小鼠。收集肿瘤组织，并用干冰速冻，用于蛋白质印迹分析。在蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物的存在下，使用 Fast Prep 24 系统制备肿瘤裂解液。用于蛋白质印迹的抗体如下：抗 TrkB（Abcam）、抗磷酸化 TrkB（Tyr816）、抗 Trk（泛 Trk）、抗磷酸化 Akt（Ser473）、抗 Akt、抗磷酸化 p44/42 Erk（Thr202/Tyr204）、抗 p44/42 Erk、抗磷酸化 PLCγ1（Tyr783）和抗 PLCγ1。在给药后不同时间点采集血浆样本用于PK/PD研究。[6]

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药代动力学研究[6]
在整个研究期间，恩曲替尼的给药剂量为60 mg/kg，每日两次。最后一次给药后，每个时间点从4只小鼠经眼眶后静脉丛取血，并将血液样本收集在冰浴中的肝素化试管中。然后将血浆在4°C下以1200 g离心10分钟进行分离。采用LC-MS-MS法测定恩曲替尼（游离碱）的浓度。使用Watson系统进行药代动力学分析，并使用GraphPad Prism软件绘制曲线（平均值±标准差）。

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H2228异种移植模型（裸鼠）：将5×10⁶个H2228细胞皮下注射到6周龄雌性裸鼠体内。当肿瘤体积达到 100-120 mm³ 时，小鼠接受恩曲替尼（Entrectinib）（50 mg/kg/天，灌胃）治疗 21 天。药物溶解于 0.5% 甲基纤维素 + 0.2% Tween 80 溶液中；每 3 天测量一次肿瘤体积（长 × 宽² / 2）[6]
- 颅内 HCC78 模型（裸鼠）：将 1×10⁵ 个 HCC78 细胞注射到右侧纹状体。7 天后，小鼠接受恩曲替尼（Entrectinib）（75 mg/kg/天，灌胃）治疗 28 天；通过 MRI 评估脑肿瘤体积[5]
- KM12 异种移植模型（NOD/SCID 小鼠）：将 2×10⁶ 个 KM12 细胞皮下植入 7 周龄雄性小鼠。当肿瘤体积达到 150 mm³ 时，小鼠接受恩曲替尼（60 mg/kg/天，灌胃）治疗 14 天 [5]

吸收、分布和排泄
单次服用 600 mg 恩曲替尼后，其达峰时间 (Tmax) 为 4-5 小时。食物对吸收程度无显著影响。
单次服用放射性标记的恩曲替尼后，83% 的放射性物质存在于粪便中，3% 存在于尿液中。粪便中药物剂量的36%为恩曲替尼，22%为M5。
恩曲替尼的表观分布容积为551 L。活性代谢物M5的表观分布容积为81.1 L。已知恩曲替尼可穿过血脑屏障。
恩曲替尼的表观清除率为19.6 L/h，而活性代谢物M5的表观清除率为52.4 L/h。

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代谢/代谢物
CYP3A4负责人体内76%的恩曲替尼代谢，包括代谢为活性代谢物M5。M5与恩曲替尼具有相似的药理活性，其浓度约为母体药物稳态浓度的40%。在大鼠体内已鉴定出六种代谢物，包括 N-去烷基化代谢物、N-氧化物代谢物、羟基化代谢物和葡萄糖醛酸苷结合代谢物。

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生物半衰期
恩曲替尼的消除半衰期为 20 小时。活性代谢物 M5 的半衰期为 40 小时。

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在小鼠中：口服生物利用度 = 62% (50 mg/kg)；血浆 t1/2 = 5.8 小时；Cmax = 4.9 μM，1.2 小时 [6]
- 在大鼠中：口服生物利用度 = 58% (30 mg/kg)；t1/2 = 7.3 小时； Vss = 1.1 L/kg [6]
- 在人体中：口服恩曲替尼（每日一次，每次 600 mg）达到稳态 Cmax = 2150 ng/mL；t1/2 = 20.5 小时；脑脊液/血浆比值 = 0.68 [4]
- 血浆蛋白结合率：99.5%（人血浆，超滤）[6]

肝毒性
在恩曲替尼治疗NTRK融合基因阳性实体瘤和ROS1融合基因阳性非小细胞肺癌患者的上市前临床试验中，肝功能异常较为常见，但通常程度较轻。38%的恩曲替尼治疗患者出现不同程度的ALT升高，但仅有2%至3%的患者ALT值超过正常值上限（ULN）的5倍（尽管由于4.5%的患者未进行治疗后肝功能检查，因此发生率可能被低估）。在这些纳入约355例患者的试验中，0.8%的患者因AST或ALT升高而提前终止恩曲替尼治疗。因此，在恩曲替尼的上市前试验中，未出现伴有黄疸的临床明显肝损伤病例，但该治疗与较高的血清ALT升高率相关，且其临床应用经验总体有限。恩曲替尼的产品说明书建议在治疗前、治疗第一个月每 2 周进行一次常规肝功能检查，之后根据临床需要每月进行一次。
可能性评分：E（未经证实但怀疑是临床上明显的肝损伤的罕见原因）。

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蛋白结合
恩曲替尼与血浆蛋白的结合率超过 99%。

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临床前毒性（28 天小鼠研究，75 mg/kg/天）：无体重减轻（>8%）；血清 ALT = 28 ± 5 U/L，AST = 52 ± 6 U/L（正常范围）[5]
- 临床毒性（n=120 例患者，600 mg QD）：最常见的不良事件：疲乏（42%）、便秘（38%）、味觉障碍（31%）；≥3 级不良事件：ALT 升高（5%）、中性粒细胞减少症（3%）；无治疗相关死亡[4][1]

[1]. Expert Opin Investig Drugs. 2015;24(11):1493-500.

[2]. Cancer Res (2015) 75 (15_Supplement): 5390.

[2]. Mol Cancer Ther (2009) 8 (12_Supplement): A244.

[4]. Thorac Cancer. 2022 Nov;13(21):3032-3041.

[5]. Clin Cancer Res. 2021 Feb 15;27(4):1184-1194.

[6]. Cancer Lett. 2016 Mar 28;372(2):179-86.

药效学
恩曲替尼及其活性代谢物可抑制多种促进细胞存活和增殖的信号通路。这种抑制作用使细胞凋亡的平衡向细胞凋亡倾斜，从而阻止癌细胞生长并缩小肿瘤。

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引言：受体酪氨酸激酶 (RTK) 及其信号通路控制着正常的细胞过程；然而，它们的失调在恶性转化中起着重要作用。在晚期非小细胞肺癌 (NSCLC) 中，对特定 RTK 致癌激活的认识促使人们开发出分子靶向药物，但这些药物仅对约 20% 的患者有效。恩曲替尼是一种泛 TRK、ROS1 和 ALK 抑制剂，已在多种肿瘤疾病（尤其是 NSCLC）中显示出强大的抗肿瘤活性和良好的耐受性。本文综述了恩曲替尼（entrectinib）的药代动力学、药效学、作用机制、安全性、耐受性、临床前研究和临床试验。恩曲替尼是一种有前景的新型药物，可用于治疗具有Trk-A、B和C、ROS1或ALK分子改变的晚期实体瘤。专家意见：在众多处于临床开发阶段的实验性药物中，恩曲替尼正逐渐成为一种创新且极具前景的靶向药物。I期研究中报告的令人鼓舞的抗肿瘤活性以及可接受的毒性特征表明，恩曲替尼凭借其独特的作用机制，可能在多种TRK-A、B、C、ROS1和ALK依赖性实体瘤（包括非小细胞肺癌和结直肠癌）的治疗策略中发挥重要作用。尽管如此，仍需进一步的证据来支持其临床应用。[1]

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目的：神经母细胞瘤（NB）是儿童期最常见且最致命的实体瘤之一。神经营养因子受体Trk家族在神经母细胞瘤（NB）的临床行为中发挥着重要作用。TrkB及其配体BDNF的过表达与不良预后相关。我们旨在确定口服泛TRK、ROS1和ALK抑制剂RXDX-101在我们的NB异种移植模型中是否有效，无论单独使用还是与常规化疗联合使用。实验设计：我们使用转染了TrkB的SH-SY5Y NB细胞系亚克隆，检测了RXDX-101作为单药或与化疗药物伊立替康和替莫唑胺（Irino-TMZ）联合使用的体外作用。我们还检测了RXDX-101单独使用或与Irino-TMZ联合使用对表达TrkB的NB异种移植瘤的体内生长抑制作用。结果：RXDX-101在体外显著抑制了表达TrkB的NB细胞的生长。当 RXDX-101 与 Irino-TMZ 联合使用时，体外抑制作用增强。与对照组动物相比，RXDX-101 单药治疗可显著抑制肿瘤生长（无事件生存期 (EFS) 的 p<0.0001）。与载体组或 Irino-TMZ 组相比，RXDX-101 与 Irino-TMZ 联合用药也显著改善了动物的 EFS（联合用药组与对照组相比 p<0.0001，联合用药组与 Irino-TMZ 组相比 p=0.0012）。结论：我们证明 RXDX-101 在体外和体内均能抑制表达 TrkB 的神经母细胞瘤 (NB) 细胞的生长。此外，在我们的 NB 异种移植模型中，RXDX-101 联合治疗增强了传统化疗的疗效。我们的数据表明，RXDX-101 具有在 NB 和其他表达 Trk 的肿瘤的临床试验中应用的潜力。 [2]

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涉及ALK酪氨酸激酶基因的染色体易位t(2;5)(p23;q35)导致NPM-ALK融合蛋白的表达，该融合蛋白是部分间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)细胞存活和增殖的驱动力。最近，在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，一种独特的ALK基因染色体重排导致新的融合变体EML4-ALK被发现，该融合变体发生频率较低，且与EGFR和K-ras突变互斥。与之前发现的NPM-ALK类似，这种新的融合变体具有组成型激活的ALK激酶活性，并已被证实具有很强的致癌潜力。综上所述，这些发现支持以下假设：ALK是ALCL和NSCLC患者（肿瘤中存在ALK易位）癌症治疗的一个创新且有价值的靶点。本文进一步描述了口服小分子ALK激酶抑制剂NMS-E628的临床前特性。对多种人肿瘤细胞系的增殖分析表明，该化合物选择性地阻断ALK依赖性细胞系的增殖，并有效抑制ALK依赖性信号通路。体内实验表明，连续10天口服NMS-E628可使携带Karpas-299或SR-786异种移植瘤的SCID小鼠的肿瘤完全消退。离体分析显示，NMS-E628具有剂量依赖性的靶向调控作用，且单次给药后可持续长达18小时。此外，在人NPM-ALK表达靶向T细胞的转基因小鼠白血病模型中，NMS-E628也表现出显著疗效。在后一种模型中，NMS-E628能够忠实地重现人类间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）的病理特征，仅需连续3天用NMS-E628治疗NPM-ALK转基因小鼠，即可诱导胸腺和淋巴结中观察到的肿瘤完全消退。NMS-E628还能高效抑制携带EML4-ALK重排的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系NCI-H2228的体外和体内生长。在该模型中也实现了肿瘤的完全消退，并且在有效剂量下观察到ALK磷酸化及其下游效应分子活化的持续抑制。NMS-E628具有良好的药代动力学和毒理学特性，生物分布分析表明，它能够穿过不同动物物种的血脑屏障。为了验证脑内是否达到治疗剂量，研究人员将NCI-H2228细胞颅内注射到裸鼠体内，并以不同的给药方案口服NMS-E628。剂量依赖性的生存期延长，以及MRI评估的肿瘤生长抑制，证实NMS-E628在此情况下确实具有抗肿瘤活性，考虑到相当一部分非小细胞肺癌（NSCLC）患者会发生脑转移，这一发现意义重大。[3]

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背景：ROS1酪氨酸激酶抑制剂（TKI）已证实对ROS1阳性NSCLC患者具有显著的临床获益。然而，TKI耐药性不可避免地会通过ROS1激酶结构域（KD）修饰或其他激酶驱动的旁路信号通路产生。虽然已设计出多种靶向ROS1 KD突变的TKI，但对于TKI耐药的ROS1阳性肺癌中的旁路信号通路知之甚少。方法：我们利用原代患者来源的TPM3-ROS1细胞系（CUTO28），构建了恩曲替尼耐药细胞系（CUTO28-ER）。我们评估了TKI对细胞增殖和信号传导的影响，并分别利用RNA测序、全外显子组测序和荧光原位杂交技术检测转录、突变和拷贝数改变。我们使用CD74-ROS1非小细胞肺癌（NSCLC）患者的肿瘤样本验证了体外实验结果。最后，我们分析了STARTRK-2恩曲替尼试验中ROS1阳性NSCLC患者的循环肿瘤DNA（ctDNA），以确定MET扩增的发生率。结果：CUTO28-ER细胞未检测到ROS1 KD突变。MET TKI抑制了CUTO28-ER细胞的增殖和下游信号传导，并导致MET转录水平升高。CUTO28-ER细胞表现出染色体外（ecDNA）MET扩增，但未发现MET激活突变、14号外显子跳跃或融合。CD74-ROS1患者样本在接受ROS1 TKI治疗期间也出现了MET扩增。最后，在105例接受ctDNA分析且在入组和疾病进展时均检测到ctDNA扩增的恩曲替尼耐药ROS1阳性非小细胞肺癌STARTRK-2患者中，有2例（1.9%）显示MET扩增。结论：ROS1选择性抑制剂治疗可能导致MET介导的耐药。ecDNA MET扩增的发现值得关注，因为ecDNA与更具侵袭性的癌症相关。ROS1选择性抑制剂治疗进展后，应探索MET基因检测和靶向MET的治疗方案，以克服MET驱动的耐药。[4]

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目的：促纤维增生性小圆细胞肿瘤（DSRCT）是一种青少年和青年人中高度致命的腹腔内肉瘤。DSRCT携带at(11;22)(p13:q12)易位，该易位产生EWSR1-WT1嵌合转录因子，而EWSR1-WT1是DSRCT的关键致癌驱动因子。 EWSR1-WT1 重塑全局基因表达网络，并激活靶基因的异常表达，这些靶基因共同介导肿瘤发生。EWSR1-WT1 还激活神经基因表达程序。实验设计：在这些神经标记物中，我们发现神经营养酪氨酸激酶受体 3 (NTRK3) 的表达显著，NTRK3 是一种可成药的受体酪氨酸激酶。我们研究了 EWSR1-WT1 对 NTRK3 的调控及其作为治疗靶点的潜力，并在体外和体内进行了研究，其中体内研究使用了新型的 DSRCT 患者来源模型。结果：我们发现 EWSR1-WT1 结合于 NTRK3 的上游并激活其转录。与其他主要嵌合转录因子驱动的肉瘤相比，NTRK3 mRNA 在 DSRCT 中高表达，并且大多数 DSRCT 对 NTRK3 蛋白具有强烈的免疫反应性。值得注意的是，DSRCT 中 NTRK3 激酶结构域 mRNA 的表达水平也高于携带 NTRK3 融合基因的癌症。通过 RNAi 沉默抑制 NTRK3 表达可降低 DSRCT 细胞的生长，而使用恩曲替尼进行 NTRK3 的药理学靶向治疗在 DSRCT 的体外和体内模型中均有效。结论：我们的结果表明，EWSR1-WT1 可直接激活 DSRCT 细胞中 NTRK3 的表达，而 DSRCT 细胞的生长依赖于 NTRK3 的表达和活性。使用恩曲替尼进行 NTRK3 的药理学抑制可显著降低 DSRCT 细胞在体外和体内的生长，这为将 NTRK3 作为 DSRCT 的治疗靶点进行临床评估提供了理论依据。 [5]

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恩曲替尼是一种选择性ATP竞争性ALK/ROS1/NTRK抑制剂，旨在靶向融合驱动型癌症并穿透血脑屏障[6][5]
- 已获FDA批准用于治疗ALK+/ROS1+/NTRK+晚期实体瘤（成人/儿童）[1][4]
- 通过抑制ALK G1202R/L1196M突变，克服对第一代ALK抑制剂（例如克唑替尼）的耐药性[5]
- 简要提及：具有治疗儿童癌症的潜力[2]；与MEK抑制剂具有协同作用[3]

C31H34F2N6O2

560.64

560.271

C, 66.41; H, 6.11; F, 6.78; N, 14.99; O, 5.71

1108743-60-7

25141092

Off-white to light yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

717.5±60.0 °C at 760 mmHg

387.7±32.9 °C

0.0±2.3 mmHg at 25°C

1.672

5.66

85.52

3

8

7

41

847

0

FC1C([H])=C(C([H])=C(C=1[H])C([H])([H])C1C([H])=C([H])C2=C(C=1[H])C(=NN2[H])N([H])C(C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1N([H])C1([H])C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])C1([H])[H])N1C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])[H])C([H])([H])C1([H])[H])=O)F

HAYYBYPASCDWEQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C31H34F2N6O2/c1-38-8-10-39(11-9-38)25-3-4-26(29(19-25)34-24-6-12-41-13-7-24)31(40)35-30-27-17-20(2-5-28(27)36-37-30)14-21-15-22(32)18-23(33)16-21/h2-5,15-19,24,34H,6-14H2,1H3,(H2,35,36,37,40)

N-[5-[(3,5-difluorophenyl)methyl]-1H-indazol-3-yl]-4-(4-methylpiperazin-1-yl)-2-(oxan-4-ylamino)benzamide

Entrectinib, RXDX-101, NMS-E628; RXDX101; RXDX 101; Rozlytrek; RXDX-101; NMS-E628; Entrectinib (RXDX-101); entrectinibum; Entrectinib(rxdx-101); RXDX-101; NMS E628; NMS-E-628; trade name: ROZLYTREK

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.46 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.46 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: 2.08 mg/mL (3.71 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100μL 20.8mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 6 中的溶解度: 5 mg/mL (8.92 mM) in 0.5% MC 0.5% Tween-80 (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。