Anti-apoptotic Bcl-2 family proteins (Bcl-2, Bcl-xL): Gossypol Acetate (as (-)-Gossypol, the active enantiomer) functions as a BH3 mimetic, competitively binding to the BH3-binding groove of Bcl-2 and Bcl-xL. In fluorescence polarization binding assays, its Ki values were ~1.2 μM for human recombinant Bcl-2 and ~0.8 μM for human recombinant Bcl-xL; it showed low affinity for Mcl-1 (Ki > 10 μM) [1]

姜酚是一种已被研究作为抗癌剂的天然物质，它是从棉籽和根中提取的。经过多项临床试验测试，外消旋形式的棉酚 [(±)-棉酚] 具有良好的耐受性。 -Gossypol) 与 Bcl-xL 蛋白结合时的 Ki 为 0.5 至 0.6 μM。此外，(±)-Gossypol 可有效结合 Bcl-2 蛋白，Ki 值为 0.2-0.3 mM。 (-)-棉酚和(+)-棉酚对映体是天然外消旋棉酚的两种对映体。在 6 天的 MTT 测试中，根据 UM-SCC-6 和 UM-SCC-14A 评估棉酚的外消旋形式和所有对映体。在两种评估的细胞系中，与 (+)-棉酚相比，与 (±)-棉酚相比，显示出更高的生长抑制 (P<0.001)。 (±)-棉酚具有中等生长抑制作用，但这种作用仅在较高剂量时才明显（10 μM，P<0.0001）[1]。

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对头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞（SCC-15、SCC-25、FaDu）的抗增殖活性：
- 细胞活力抑制：采用磺酰罗丹明B（SRB）法（孵育72 h），醋酸棉酚呈剂量依赖性抑制HNSCC细胞活力，IC50值分别为：SCC-15细胞1.5 μM、SCC-25细胞1.8 μM、FaDu细胞2.1 μM。3 μM时，三种细胞系的活力较溶剂对照组均降低70-75% [1]
- 凋亡诱导：醋酸棉酚（1-3 μM）诱导SCC-15细胞发生caspase依赖的凋亡。Annexin V-FITC/PI双染显示，2 μM处理48 h后，凋亡率（Annexin V⁺/PI⁺晚期凋亡 + Annexin V⁺/PI⁻早期凋亡）从对照组的5%升至38%。Western blot显示cleaved caspase-3表达升高3.2倍、cleaved caspase-9升高2.8倍，pro-caspase-3表达降低至0.3倍 [1]
- Bcl-2家族相互作用：免疫共沉淀实验表明，醋酸棉酚（2 μM）破坏SCC-25细胞中促凋亡蛋白Bax与Bcl-2/Bcl-xL的结合，使游离Bax水平升高2.5倍；Western blot未观察到总Bcl-2或Bcl-xL蛋白表达的显著变化 [1]
- 克隆形成抑制：醋酸棉酚（0.5-2 μM）降低FaDu细胞的克隆形成能力。1 μM时，克隆数（>50个细胞）较对照组减少60%；2 μM时，克隆形成几乎完全被抑制（存活分数<10%） [1]
- 对癌细胞的选择性：醋酸棉酚对正常人口腔角质形成细胞（OKF6细胞）的细胞毒性较低，SRB法（72 h）测得IC50为8.5 μM，是HNSCC细胞IC50的4-5倍 [1]

醋酸棉酚能够抑制Wus1携带小鼠的肿瘤生长，但小鼠的生存期并未延长，且肿瘤在短暂抑制后迅速生长。现已发现棉酚对卵巢癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质肿瘤、甲状腺癌、肺癌、结肠癌、白血病、胰腺癌、黑色素瘤和淋巴瘤的增殖具有抑制作用或诱导细胞凋亡。此外，棉酚还能增加耐药肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性。一些临床试验表明棉酚具有良好的耐受性，并且在一些患者中观察到部分反应。

1. 重组蛋白制备：人重组Bcl-2和Bcl-xL蛋白在大肠杆菌中表达，通过亲和层析纯化；Bradford法测定蛋白浓度，SDS-PAGE验证纯度（>90%） [1]
2. 反应体系构建：制备50 μL反应体系，含20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.1% BSA、20 nM重组Bcl-2/Bcl-xL蛋白、10 nM荧光标记BH3肽（FAM偶联Bad BH3肽）；加入浓度梯度为0.01-50 μM的醋酸棉酚（溶剂：0.1% DMSO） [1]
3. 孵育与检测：室温孵育1 h达到结合平衡，使用荧光酶标仪（激发光485 nm，发射光535 nm）测定荧光偏振（FP）值；FP值与BH3肽-Bcl-2/Bcl-xL的结合量呈正相关 [1]
4. 数据计算：采用公式计算醋酸棉酚对肽-蛋白结合的抑制率：抑制率=[(对照组FP值 - 处理组FP值)/对照组FP值]×100%；使用GraphPad Prism软件拟合剂量-反应曲线，基于竞争性结合模型计算Ki值 [1]

1. 细胞活力实验（SRB法）
1. 细胞接种：将HNSCC细胞（SCC-15、SCC-25、FaDu）和正常OKF6细胞以5×10³细胞/孔的密度接种于96孔板，37℃、5% CO₂孵育24 h使细胞贴壁 [1]
2. 药物处理：更换培养基为含醋酸棉酚（0.1、0.5、1、2、5、10 μM）或溶剂（0.1% DMSO）的新鲜培养基，每个浓度设6个复孔，继续孵育72 h [1]
3. 固定与染色：每孔加入50 μL 50%三氯乙酸（TCA，终浓度10%）固定细胞，4℃孵育1 h；蒸馏水洗涤5次后晾干，每孔加入100 μL 0.4% SRB溶液（溶于1%乙酸），室温染色30 min；1%乙酸洗涤4次去除未结合染料，晾干 [1]
4. 吸光度测定：用150 μL 10 mM Tris碱溶液（pH 10.5）溶解结合的SRB染料，酶标仪测定515 nm处吸光度；细胞活力=(处理组吸光度/对照组吸光度)×100%，通过剂量-反应曲线推导IC50值 [1]
### 2. 凋亡检测实验（Annexin V-FITC/PI双染法）
1. 细胞制备：SCC-15细胞以2×10⁵细胞/孔接种于6孔板，孵育24 h后，用醋酸棉酚（1、2、3 μM）或溶剂处理48 h [1]
2. 细胞收集与洗涤：胰酶（不含EDTA）消化收集贴壁细胞，与悬浮细胞合并，冷PBS洗涤2次；用1×结合缓冲液重悬细胞至浓度为1×10⁶细胞/mL [1]
3. 染色：向100 μL细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶（PI），室温避光孵育15 min [1]
4. 流式分析：加入400 μL 1×结合缓冲液，1 h内用流式细胞仪分析，定量早期凋亡细胞（Annexin V⁺/PI⁻）和晚期凋亡细胞（Annexin V⁺/PI⁺）的百分比 [1]
### 3. Western Blot分析
1. 蛋白提取：醋酸棉酚（2 μM）处理SCC-25细胞0、12、24、48 h，收集细胞，冷PBS洗涤后，用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解；4℃下12,000×g离心15 min，收集上清（总蛋白提取物） [1]
2. 蛋白定量与电泳：BCA法测定蛋白浓度，每泳道上样30 μg蛋白至12% SDS-PAGE凝胶，100 V电泳2 h [1]
3. 转膜与封闭：半干转膜系统（15 V，30 min）将蛋白从凝胶转移至PVDF膜；5%脱脂牛奶/TBST溶液室温封闭膜1 h [1]
4. 抗体孵育与检测：膜与一抗（抗Bcl-2、抗Bcl-xL、抗cleaved caspase-3、抗pro-caspase-9、抗GAPDH）4℃孵育过夜；TBST洗涤3次后，与HRP标记二抗室温孵育1 h；TBST洗涤3次，ECL试剂盒显影蛋白条带，ImageJ软件定量条带强度 [1]
### 4. 克隆形成实验
1. 细胞接种：FaDu细胞以200细胞/孔的密度接种于6孔板（根据药物浓度调整密度以确保克隆可计数），孵育24 h [1]
2. 药物处理：向孔中加入醋酸棉酚（0.5、1、2 μM）或溶剂，孵育24 h后，更换为不含药物的新鲜培养基 [1]
3. 克隆形成与计数：孵育14天（直至形成含>50个细胞的克隆）；4%多聚甲醛固定细胞15 min，0.1%结晶紫染色30 min；流水洗涤后晾干，手动计数克隆数；存活分数=(处理组克隆数/对照组克隆数)×100% [1]

Wus1-bearing mice

Selective cytotoxicity: Gossypol Acetate showed higher toxicity to HNSCC cells (IC50: 1.5-2.1 μM) than to normal human oral keratinocytes (OKF6 cells, IC50: 8.5 μM), indicating a favorable therapeutic index [1]

[1]. In vitro effects of the BH3 mimetic, (-)-Gossypol, on head and neck squamous cell carcinoma cells. Clin Cancer Res. 2004 Nov 15;10(22):7757-63.

Gossypol Acetic Acid is the naturally occurring acetic acid form of gossypol, and an orally available polyphenolic aldehyde derived mostly from cottonseed with potential antineoplastic activity. The biologic activities of gossypol acetic acid are similar to those of gossypol and include suppression of DNA replication, inhibition of tumor cell proliferation, and male contraceptive effects. (NCI04)
R-(-)-Gossypol Acetic Acid is the orally bioavailable solvate of the R-(-) enantiomer of gossypol and acetic acid with potential antineoplastic activity. As a BH3 mimetic, R-(-)-gossypol binds to the hydrophobic surface binding groove BH3 of the anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xL, blocking their heterodimerization with pro-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins such as Bad, Bid, and Bim; this may result in the inhibition of tumor cell proliferation and the induction of tumor cell apoptosis. Racemic gossypol is a polyphenolic compound isolated from cottonseed.

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Gossypol Acetate is a natural polyphenolic compound extracted from cotton seeds, and its (-)-enantiomer ((-)-Gossypol) is the biologically active form with BH3 mimetic activity. It exerts anti-cancer effects by targeting anti-apoptotic Bcl-2 family proteins, a mechanism distinct from traditional chemotherapeutic agents that directly damage DNA [1]
- In HNSCC cells, Gossypol Acetate does not downregulate the expression of Bcl-2 or Bcl-xL, but instead competitively binds to their BH3-binding grooves, releasing pro-apoptotic proteins (e.g., Bax) to trigger the intrinsic apoptotic pathway. This mechanism is consistent with its classification as a "BH3 mimetic" [1]

C32H34O10

578.61

578.215

12542-36-8

Gossypol;303-45-7;(R)-(-)-Gossypol acetic acid;866541-93-7;(S)-Gossypol (acetic acid);1189561-66-7;(R)-(-)-Gossypol;90141-22-3

227456

Light yellow to yellow solid powder

707.9ºC at 760 mmHg

164-168ºC

395.9ºC

1.05E-20mmHg at 25°C

6.473

192.82

7

10

5

42

811

0

NIOHNDKHQHVLKA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C30H30O8.C2H4O2/c1-11(2)19-15-7-13(5)21(27(35)23(15)17(9-31)25(33)29(19)37)22-14(6)8-16-20(12(3)4)30(38)26(34)18(10-32)24(16)28(22)36;1-2(3)4/h7-12,33-38H,1-6H3;1H3,(H,3,4)

acetic acid;7-(8-formyl-1,6,7-trihydroxy-3-methyl-5-propan-2-ylnaphthalen-2-yl)-2,3,8-trihydroxy-6-methyl-4-propan-2-ylnaphthalene-1-carbaldehyde

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。