GSK2606414   中文名称: GSK-2606414

EIF2AK3 (PERK) (IC50 = 0.4 nM); EIF2AK1 (HRI) (IC50 = 420 nM); EIF2AK2 (PKR) (IC50 = 696 nM)

GSK2606414 抑制细胞中 PERK 激活[1]。
GSK2606414单独抑制PK4，对响应替代应激信号的其他两种疟原虫eIF2α激酶没有影响（图S6）。重要的是，GSK2606414抑制了疟原虫eIF2α磷酸化，并消除了ART治疗后的复发（图5）。由于ER和PERK在成熟红细胞中不存在，GSK2606414很可能通过寄生虫发挥其活性。

GSK2606414（50 和 150 mg/kg，口服）可防止小鼠肿瘤异种移植物生长[1]。
此外，化合物38（GSK2606414）被推进到小鼠的人类异种移植物功效研究中，并证明小分子抑制PERK可以抑制体内肿瘤生长，这与转化的PERK-/-小鼠胚胎成纤维细胞衍生的肿瘤生长缓慢一致。对38的物理性质和药代动力学进行进一步优化将是未来交流的主题。[1]

GST-PERK 胞质结构域是购买的。 6-His 全长人 eIF2 从 Sf9 昆虫细胞中的杆状病毒表达中纯化。 eIF2 蛋白通过透析到 PBS 中进行缓冲液交换，通过 NHS-LC-生物素进行化学修饰，然后通过透析到 50 mM Tris、pH 7.2、250 mM NaCl 和 5 mM DTT 中进行缓冲液交换。将蛋白质等分并保存在 80°C。将新鲜配制的淬灭溶液添加到反应中后，会产生 4 nM eIF2 磷酸 Ser51 抗体、已用 Eu-1024 标记的 4 nM 抗兔 IgG、40 nM 链霉亲和素 Surelight APC 和 15 mM 的终浓度乙二胺四乙酸。反应在黑色 384 孔聚苯乙烯低体积板中进行，最终体积为 10 μL。将所研究的化合物溶解在 DMSO 中至浓度为 1.0 mM，然后在 DMSO 中连续稀释 1-3 至 11 倍。将每个浓度以 0.1 μL 的量转移至测定板的相应孔中。结果产生 0.00017 至 10 μM 的最终化合物浓度范围。为了测定含有化合物的板，在室温下预孵育 30 分钟后添加 GST-PERK 溶液。添加 ATP 和 eIF2 底物溶液以启动反应。孵育1小时后添加淬灭溶液。在信号检测之前，将板在室温下覆盖 2 小时。在 Viewlux 阅读器上，产生的信号被量化。通过使用 APC/Eu 计算转换数据，APC 信号被归一化为铕信号。浓度响应曲线的信息绘制为使用数据缩减公式 100 × [1 – (U1 – C2)/(C1 – C2)] 与化合物浓度计算的抑制百分比，其中 U 是未知值，C1 是平均值C2 是 1% DMSO 获得的对照值，C2 是 0.1 M EDTA 获得的平均对照值。使用最小响应、最大响应、斜率因子、化合物浓度和抑制浓度 (IC50) 将数据拟合到曲线。每种化合物的结果均以 IC50 值列出。

PERK 抑制剂（GSK2606414，化合物 38）孵育后，用毒胡萝卜素刺激细胞。两小时后裂解细胞并检查 PERK 自磷酸化抑制。
A549细胞中的PERK磷酸化[1]
将指数生长的A549，一种人肺腺癌细胞系，在补充有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基中的六孔培养皿中以500000个细胞/孔的速度接种，并在37°C、5%CO2下孵育过夜。第二天早上，用DMSO或化合物（3倍稀释液0.33、0.11、0.37μM）处理细胞，并如上所述孵育1小时。然后用1μM thapsigargin刺激细胞额外1小时，以诱导ER应激。收集细胞颗粒并在冷RIPA缓冲液[150mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH 7.5、0.25%脱氧胆酸钠、1%NP-40、蛋白酶和磷酸酶抑制剂以及100mM原钒酸钠]中裂解。通过SDS–PAGE解析澄清的裂解物，并使用Invitrogen的NuPAGE系统将其转移到硝化纤维素膜上。将印迹与总PERK和总eIF-2α的初级抗体一起孵育。使用IRDye700DX标记的山羊抗小鼠IgG和IRDye800CW驴抗山羊IgG作为二抗。奥德赛红外成像仪检测到蛋白质.

Female nude mice have their right flank subcutaneously implanted with exponentially growing BxPC3 tumor cells (10×10⁶ cells/mouse) cultivated in cell culture. Mice with tumors measuring less than 200 mm³ are randomly assigned to one of eight treatment groups sixteen days post-implantation. The animals are given the compound at 50 or 150 mg/kg, b.i.d., for 21 days along with a vehicle (0.5% hydoxypropylmethylcellulose, 0.1% Tween 80 in water, pH 4.8). Using calipers, the tumor volume is measured twice a week and computed. When the dosage is finished, the results are expressed as a percent inhibition, or 100[1-(average growth of the drug-treated population)/(average growth of the vehicle-treated control population)]. In statistical analysis, the two-tailed t test is employed.
Pharmacokinetic Studies[1]
All studies were conducted after review by the Institutional Animal Care and Use Committee at GSK and in accordance with the GSK Policy on the Care, Welfare and Treatment of Laboratory Animals. Pharmacokinetics were studied in male Sprague–Dawley rats, male beagle dogs, and/or male CD-1 mice following single intravenous and/or oral administration. Absolute oral bioavailability was estimated using a crossover study design (n of 2 or 3), unless otherwise indicated. Blood samples were assayed using protein precipitation followed by LC/MS/MS analysis, and the resulting concentration–time data were analyzed by noncompartmental methods (WinNonlin Professional, version 4.1).[1]
BxPC3 Human Pancreatic Xenograft Model[1]
All studies were conducted after review by the Institutional Animal Care and Use Committee at GSK and in accordance with the GSK Policy on the Care, Welfare and Treatment of Laboratory Animals. Exponentially growing BxPC3 tumor cells (10 × 106 cells/mouse) from cell culture were implanted subcutaneously into the right flank of female nude mice (Charles River). Sixteen days after implantation, mice with ∼200 mm3 tumors were randomized into various treatment groups (n = 8 mice/group). Animals were orally treated with vehicle (0.5% hydoxypropylmethylcellulose, 0.1% Tween 80 in water, pH 4.8), compound 38 at 50 or 150 mg/kg, b.i.d. for 21 days. Tumor volume was measured twice weekly with calipers and calculated using the following equation: tumor volume (mm3) = (length × width)2/2. Results are represented as percent inhibition on completion of dosing, which is 100[1 – (average growth of drug-treated population)/(average growth of vehicle-treated control population)]. Statistical analysis was performed using a two-tailed t test.

[1]. Discovery of 7-methyl-5-(1-{[3-(trifluoromethyl)phenyl]acetyl}-2,3-dihydro-1H-indol-5-yl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amine (GSK2606414), a potent and selective first-in-class inhibitor of protein kinase R (PKR)-like endoplasmic reticulu.

[2]. Inhibiting the Plasmodium eIF2α Kinase PK4 Prevents Artemisinin-Induced Latency. Cell Host Microbe. 2017 Dec 13;22(6):766-776.e4.

See also: Gsk2606414 (annotation moved to).

C24H20F3N5O

451.44

451.161

C, 63.85; H, 4.47; F, 12.63; N, 15.51; O, 3.54

1337531-36-8

53469448

white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

720.3±60.0 °C at 760 mmHg

389.4±32.9 °C

0.0±2.3 mmHg at 25°C

1.668

4.53

77.04

1

7

3

33

721

0

FC(C1=C([H])C([H])=C([H])C(=C1[H])C([H])([H])C(N1C2C([H])=C([H])C(C3=C([H])N(C([H])([H])[H])C4C3=C(N([H])[H])N=C([H])N=4)=C([H])C=2C([H])([H])C1([H])[H])=O)(F)F

SIXVRXARNAVBTC-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H20F3N5O/c1-31-12-18(21-22(28)29-13-30-23(21)31)15-5-6-19-16(11-15)7-8-32(19)20(33)10-14-3-2-4-17(9-14)24(25,26)27/h2-6,9,11-13H,7-8,10H2,1H3,(H2,28,29,30)

1-[5-(4-amino-7-methylpyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2,3-dihydroindol-1-yl]-2-[3-(trifluoromethyl)phenyl]ethanone

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.54 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.54 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.54 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: in 5% DMSO+45% PEG 300+ddH2O: 20mg/mL

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配方 5 中的溶解度: 3.33 mg/mL (7.38 mM) in 0.5% HPMC 0.2%Tween80 (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。