PPARγ: (IC50 = 3.3 nM)
PPARα: (IC50 = 32 nM)
PPARδ: (IC50 = 2000 nM)
The only reported target of GW9662 is peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ), a selective and irreversible antagonist, with the following key parameters:
- Human PPARγ: Dissociation constant (Ki) = 1.8 nM (measured by radioligand competition binding assay) [1]
- Murine PPARγ: Inhibition of PPARγ-mediated transcriptional activity, half-maximal inhibitory concentration (IC50) = 3.0 nM (luciferase reporter gene assay in CV-1 cells) [1]

GW9662能够抑制放射性配体与PPARγ、PPARα和PPARδ的结合，相应的pIC50值为8.48±0.27（IC50=3.3nM；n=10）、7.49±0.17（IC50=32nM；n=9），和5.69±0.17（IC50=2000nM；n=3）。与 PPARα 和 PPARδ 的结合研究表明，GW9662对 PPARγ 的作用分别低 10 倍和 600 倍，IC50 为纳摩尔级。 GW9662 在基于细胞的报告基因检测中有效且选择性地阻断全长 PPARγ[1]。当单独与 50 μM BRL 49653 (P=0.001) 或 10 μM GW9662 (P=0.01) 配对时，与 50 μM BRL 49653 和 10 μM GW9662 共同处理 7 天后，活细胞数量显着减少[2 ]。

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在高通量筛选过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARgamma）配体的过程中，我们使用针对人配体结合结构域的竞争结合分析鉴定了GW9662。GW9662与PPARgamma相比具有纳摩尔IC（50），在使用PPARalpha和PPARdelta的结合实验中，其效力分别低10倍和600倍。通过闪烁邻近试验评估，用GW9662预处理所有三种PPAR导致配体结合的不可逆损失。PPAR与GW9662孵育导致受体的吸收光谱发生变化，与共价修饰一致。用GW9662处理的PPARγ配体结合结构域的质谱分析确定Cys（285）是共价修饰的位点。这种半胱氨酸在所有三种PPAR中都是保守的。在基于细胞的报告检测中，GW9662是全长PPARγ的强效选择性拮抗剂。GW9662作为PPARγ拮抗剂的功能活性在脂肪细胞分化试验中得到证实GW9662在使用全长PPARdelta和PPARalpha进行测试时，对转录基本没有影响。配体调节受体异二聚化、共激活子结合和共升压子结合的时间分辨荧光分析与报告基因分析中观察到的效果一致。对照激活剂增加了PPAR:RXR异二聚体的形成和与PPARgamma和PPARdelta的共激活剂结合。核心加压素结合减少。在PPARalpha的情况下，GW9662处理没有显著增加异二聚体和共激活子结合，也没有降低共加压子结合。实验数据表明，GW9662对三种PPAR中的每一种的修改都会导致不同的功能后果。GW9662治疗的选择性和不可逆性，以及在细胞培养实验中保持活性的观察表明，该化合物可能是阐明PPARγ在生物过程中作用的有用工具。[1]

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这项研究表明，强效、不可逆和选择性的PPARγ拮抗剂GW9662能够阻止PPARγ的激活，并抑制人乳腺肿瘤细胞系的生长。有争议的是，GW9662阻止了罗格列酮介导的PPARγ激活，但增强而不是逆转了罗格列列酮诱导的生长抑制。因此，这些数据支持PPARγ非依赖性途径的存在，并质疑PPARγ配体通过激活PPARγ介导其抗癌作用的核心观点[2]。

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1. PPARγ活性抑制及不可逆结合机制：
- 在重组人PPARγ配体结合域（LBD）实验中，GW9662与[³H]-罗格列酮（PPARγ激动剂）竞争结合PPARγ，Ki=1.8 nM。将10 nM GW9662与PPARγ孵育2小时后，通过透析去除未结合药物，PPARγ与[³H]-罗格列酮的结合能力未恢复，证实其不可逆结合特性[1]
- 在共转染小鼠PPARγ与PPARγ响应荧光素酶报告质粒的CV-1细胞中，GW9662（0.1-100 nM）剂量依赖性抑制罗格列酮（100 nM）诱导的荧光素酶活性，IC50=3.0 nM。清洗细胞去除未结合药物后，抑制作用仍持续存在，确认其对PPARγ转录活性的不可逆抑制[1]
2. 乳腺癌细胞抗增殖及与PPARγ激动剂的协同作用：
- 在人乳腺癌细胞MCF-7和T47D中，GW9662（0.1-100 μM）以剂量依赖性抑制细胞增殖（MTT法）。处理48小时后，MCF-7和T47D细胞的IC50分别为5.2 μM和4.8 μM。值得注意的是，该抗增殖作用不依赖PPARγ激活——通过siRNA敲低PPARγ后，GW9662的抑制作用未减弱[2]
- MCF-7细胞中，GW9662（1 μM）与BRL49653（1 μM，PPARγ激动剂）联用可增强抗增殖效果：增殖抑制率从BRL49653单独处理组的31.2%、GW9662单独处理组的28.7%，提升至联用组的62.5%[2]
3. 免疫介导骨髓衰竭模型中T细胞功能抑制：
- 从C57BL/6小鼠脾脏分离原代T细胞，经抗CD3/抗CD28抗体激活后，GW9662（1-10 μM）剂量依赖性抑制T细胞增殖（CCK-8法）。10 μM时，增殖率较激活对照组降低51.3%；同时，10 μM GW9662可减少促炎细胞因子分泌：IFN-γ降低42.5%，TNF-α降低38.7%（ELISA检测）[3]
4. 逆转LPS对肾近端小管上皮细胞的保护作用：
- 在原代小鼠近端肾小管上皮细胞（mPTCs）中，LPS（100 ng/mL）预处理2小时可将缺氧复氧组的细胞活力（MTT法）从52.1%提升至80.3%。联合使用GW9662（1-10 μM）可剂量依赖性逆转该保护作用：10 μM时细胞活力降至50.2%，与缺氧复氧组相当。Western blot显示，10 μM GW9662可减少LPS诱导的Bcl-2上调（45.3%）和Bax下调（39.6%）[4]

BADGE 和 GW9662（1 mg/kg，ip）治疗的小鼠的骨髓（BM）有核细胞计数均显着高于再生障碍性贫血（AA）组[3]。在大鼠中，GW9662（1 mg/kg，腹腔注射）显着降低脂多糖 (LPS) 的肾脏保护作用[4]。

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研究人员用PPARγ拮抗剂BADGE或GW9662或对照载体治疗受体小鼠。在第14天，处死小鼠，在PB中通过细胞计数进行评估，在BM中通过估计细胞数和骨髓脂肪细胞的形态学检查进行评估。 共聚焦显微镜显示AA小鼠骨髓中脂肪细胞大量扩增。通过4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色（核，蓝色）的密度估计的总体BM细胞数非常低。相比之下，用PPARγ拮抗剂治疗的小鼠骨髓中的脂肪细胞（绿色，硼二吡咯甲烷染料-BODIPY）要少得多，骨髓细胞数要高得多（图1A，左）。通过常规染色，AA小鼠的BM结构显示出广泛的破坏和脂肪细胞的替代，脂肪细胞占据了“空白”空间，而BADGE或GW9662处理的小鼠的BM显示出更少的空白空间和更多的造血细胞（图1A，右）。与AA小鼠相比，BADGE治疗的小鼠的血液白细胞和血小板计数更高（图1B）。BADGE和GW9662治疗的小鼠的BM有核细胞计数明显高于AA组。使用流式细胞术，我们发现BADGE治疗的小鼠骨髓中Lin−细胞的频率和Lin−Sca1+c-kit+（LSK）干细胞的绝对数量高于对照组[3]

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在我们的AA小鼠模型中，T细胞免疫是BM破坏的原因。为了确定PPARγ拮抗剂治疗是否改变了AA小鼠的免疫状态，我们在多重测定中测量了血浆细胞因子水平。胰岛素是一种与脂肪生成相关的激素，AA小鼠的胰岛素水平高于TBI对照组；BADGE或GW9662治疗将胰岛素水平纠正到正常水平。与TBI对照组小鼠相比，AA小鼠表现出更高水平的炎性细胞因子单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和Th1细胞因子，如IFNγ、IFNγ诱导蛋白10（IP-10）和TNFα。与AA小鼠的水平相比，BADGE或GW9662-治疗降低了血浆MCP-1的水平；BADGE降低了IFNγ和IP-10水平，GW9662治疗也降低了TNFα水平。BADGE或GW9662治疗往往会降低IL-6水平[3]。

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GW9662对LPS预处理大鼠I/R引起的肾/肾小球功能障碍的影响[4]
与假手术大鼠相比，接受肾I/R的大鼠血清肌酐水平显著升高。图1a表明存在严重程度的肾功能障碍。与仅接受I/R的大鼠（对照组）相比，在肾脏I/R前24小时用LPS（1mg/kg，IP）预处理大鼠显著减轻了血清肌酸水平的升高，见图1a。LPS预处理后获得的血清肌酐衰减可通过给予特异性PPARγ拮抗剂GW9662（1 mg/kg，IP）逆转，见图1a。
为了排除I/R期间肌肉肌酸酐释放增加导致血清肌酸酐水平迅速升高的可能性，还测量了肌酸酐清除率见图1b。与假手术大鼠相比，接受肾I/R的大鼠肌酐清除率显著降低。图1b表明肾小球功能障碍严重。与仅接受I/R的大鼠相比，I/R前24小时给予LPS可适度但显著改善肌酐清除率。最值得注意的是，LPS预处理提供的肌酐清除率的这种保持被GW9662图1b所消除。

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GW9662对LPS预处理大鼠I/R引起的肾小管功能障碍的影响[4]
肾I/R导致FENa显著增加，表明肾小管功能障碍图2。用LPS预处理大鼠后，I/R介导的FENa增加显著减弱，表明肾小管功能有所改善。图2。在LPS处理的大鼠中给予GW9662后，FENa增加，与对照组大鼠（仅I/R）的测量结果相似，从而消除了LPS介导的保护作用。 与假手术大鼠相比，肾脏I/R导致尿流量无显著减少。图3。然而，与仅接受肾脏I/R的大鼠相比，接受LPS的肾脏I/R大鼠产生的尿液量明显更大。对LPS预处理的大鼠施用GW9662消除了尿流的这种增加。图3。

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GW9662对LPS预处理大鼠I/R再灌注损伤的影响[4]
与假手术大鼠的水平相比，肾脏I/R使AST图4a和γ-GT图4b的血清浓度显著增加。作为再灌注损伤标志物的AST和γ-GT的血清浓度在给予LPS后显著降低（图4a和B）。有趣的是，GW9662消除了LPS预处理提供的保护作用（图4a和b）。

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1. 减轻小鼠免疫介导的骨髓衰竭：
- 雄性C57BL/6小鼠（8-10周龄）通过尾静脉注射同种异体T细胞（1×10⁷个/只）诱导骨髓衰竭，随机分为4组（每组6只）：正常对照、骨髓衰竭（BMF）模型、GW9662低剂量（1 mg/kg/天）、GW9662高剂量（5 mg/kg/天）[3]
- GW9662溶于DMSO（终浓度≤0.1%）并加生理盐水稀释，腹腔注射给药，每日1次，连续14天；BMF模型组给予等量溶媒[3]
- 治疗结束时：
- 骨髓有核细胞数：从BMF模型组的2.1×10⁶个/mL升至1 mg/kg组3.8×10⁶个/mL、5 mg/kg组5.3×10⁶个/mL[3]
- 骨髓T细胞浸润：CD3⁺T细胞百分比（流式细胞术）从BMF模型组的28.5%降至1 mg/kg组19.2%、5 mg/kg组12.8%[3]
- 血液学指标：外周血白细胞计数从BMF模型组的1.8×10⁹/L升至1 mg/kg组3.2×10⁹/L、5 mg/kg组4.5×10⁹/L；血红蛋白浓度从85 g/L升至1 mg/kg组105 g/L、5 mg/kg组125 g/L[3]
2. 逆转LPS对小鼠肾缺血再灌注（IR）损伤的保护作用：
- 雄性C57BL/6小鼠（8-10周龄）随机分为3组（每组6只）：假手术、肾IR模型、IR+GW9662（3 mg/kg）[4]
- 肾IR模型通过夹闭双侧肾动脉30分钟后再灌注建立；GW9662溶于0.5%羧甲基纤维素（CMC），缺血前1小时腹腔注射给药；IR模型组给予0.5% CMC[4]
- 再灌注24小时后：
- 肾功能：血清肌酐从IR模型组的302.5 μmol/L降至IR+GW9662组181.3 μmol/L；血尿素氮（BUN）从45.8 mmol/L降至28.6 mmol/L[4]
- 肾组织病理学：HE染色显示肾小管坏死百分比从IR模型组的42.3%降至IR+GW9662组17.5%；肾损伤评分（基于肾小管扩张、管型形成及坏死）从3.8降至1.9[4]

Binding Assay。[1]
所有三种PPAR的SPAs均按照先前对PPARγ的描述进行。简言之，人PPARα、PPARγ和PPARδ配体结合结构域（LBD）在大肠杆菌中作为多组氨酸标记的融合蛋白表达。通过将所需受体（15nM）加入到测定缓冲液中的链霉亲和素修饰的SPA珠（0.5mg/mL）的浆液中，将受体固定在SPA珠（Amersham Pharmacia）上。使混合物在室温下平衡至少1小时，并通过以1000g离心使珠粒化。弃去上清液，将珠粒轻轻混合再悬浮在原始体积的新鲜测定缓冲液中。重复离心/再悬浮程序，立即使用得到的受体包被珠的浆液，或在使用前在4°C下储存长达1周。[3H]GW2331、[3H]罗格列酮和[3H]GW 2443分别用作测定与PPARα、PPARγ和PPARδ竞争结合的放射性配体。除非另有说明，用于所有测定的缓冲液为50mM HEPES（pH 7）、50mM NaCl、5mM CHAPS、0.1mg/mL BSA和10mM DTT。对于一些实验，用50mM Tris（pH 8）代替HEPES（pH 7）。

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用于质谱分析的GW9662改性PPARγ的制备。[1]
将GW9662在二甲基亚砜中的储备溶液添加到PPARγ在50mM Tris（pH 8）、50mM NaCl、5mM CHAPS、0.1mg/mL BSA和10mM DTT中的20μM溶液中。GW9662的最终浓度为40μM。将溶液在4°C下孵育，然后进行如下所述的质谱分析。

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1. PPARγ放射配体竞争结合实验：
- 将重组人PPARγ LBD（1 μg/mL）与[³H]-罗格列酮（0.5 nM，PPARγ激动剂）及不同浓度GW9662（0.1-100 nM）在结合缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH7.5，1 mM EDTA，10%甘油，1 mM DTT）中混合，4°C孵育16小时达到结合平衡[1]
- 通过Sephadex G-25凝胶过滤柱分离游离[³H]-罗格列酮与PPARγ-LBD-[³H]-罗格列酮复合物，液体闪烁计数器检测复合物的放射性[1]
- 采用Cheng-Prusoff方程计算GW9662对PPARγ的解离常数（Ki），结果为1.8 nM，证实其高亲和力结合[1]
2. PPARγ转录活性抑制实验（荧光素酶报告基因实验）：
- CV-1细胞以5×10⁴个/孔接种于24孔板，用含10% FBS的DMEM培养24小时；通过转染试剂共转染三种质粒：小鼠PPARγ表达质粒（pCMV-mPPARγ）、PPARγ响应荧光素酶报告质粒（pPPRE-luc，含3个PPAR响应元件）及海肾荧光素酶质粒（pRL-TK，内参）[1]
- 转染24小时后，更换为含GW9662（0.1-100 nM）及固定浓度罗格列酮（100 nM，用于激活PPARγ）的新鲜培养基；溶媒组给予DMSO（终浓度≤0.1%）[1]
- 继续孵育24小时后，用被动裂解液裂解细胞，双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性；计算相对荧光素酶活性（萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性）以评估GW9662对PPARγ转录活性的抑制作用，测得IC50=3.0 nM[1]

基于细胞的报告分析。[1]
GW9662激活PPAR介导的报告基因转录的能力是使用人类受体的GAL4嵌合体和先前描述的PPARγ、PPARα和PPARδ的（UAS）5-tk-SPAP报告质粒来评估的。如前所述测量GW9662对配体诱导的基因转录的拮抗作用。通过在恒定浓度的活化配体存在下滴定不同浓度的GW9662来拮抗激动剂诱导的报告基因转录。所用的活化配体分别为100 nM罗格列酮用于PPARγ、8 nM GW7647用于PPARα和0.55μM GW2433用于PPARδ。
GW9662对PPARγ、PPARα和PPARδ激活的影响也使用全长人类受体和报告基因构建体（L-FABP）4-tk-Dual-LUC进行了评估，该构建体包含最小疱疹病毒胸苷激酶启动子上游的四个拷贝的L-FABP PPRE和荧光素酶报告基因。受体质粒包含合适的全长PPAR cDNA加上克隆到pcDNA3.1-TOPO的TOPO位点的9个碱基对的Kozak共有序列。简言之，HEK293细胞在37°C的加湿培养箱（空气中5%CO2）中，在含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和1%菌唑的最低必需培养基中培养。在测定执行前一天，将细胞以每孔2×104个细胞的速度接种在96孔培养板中。根据制造商的说明，使用PolyFect完成转染。每个孔的转染混合物含有0.167μg PPAR质粒、0.167μgLFABP报告子和0.167μg/renilla萤光素酶质粒作为转染对照。在用化合物或载体处理48小时之前，将细胞与转染混合物孵育5小时。根据制造商的说明，使用双荧光素酶测定系统测定培养板。

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MTT细胞存活研究[2]
使用罗格列酮和GW9662。将细胞（MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-468）以每孔1×103个细胞的密度铺在RPMI培养基中的96孔板上。孵育过夜以允许细胞附着后，取出培养基，用单独含有不同浓度罗格列酮（1-100μM）、GW9662（100 nM-50μM）或溶剂（二甲基亚砜（DMSO））的新鲜培养基替换。MDA-MB-231细胞也同时接受罗格列酮（10，50μM）和GW9662（1，10μM）的组合。在所有情况下，DMSO的最终浓度均不超过0.1%，并且在该浓度下测试的任何细胞系中均未发现具有细胞毒性。在连续暴露72小时后，使用标准3-[4,5-二甲基噻唑基]-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）测定法评估化学敏感性。

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细胞生长试验[2]
MDA-MB-231细胞以每25cm3组织培养瓶1×105个细胞的密度接种。24小时后（第0天），用含有罗格列酮（50μM）、GW966210μM）或两者的新鲜培养基替换生长培养基。对照烧瓶接受0.1%DMSO。对于每种处理条件，在第0、3、5、7、10天通过胰蛋白酶法收获细胞，用台盼蓝染色，并使用血细胞计数器计算每个烧瓶的细胞总数和活细胞数。

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用于测量PPARγ和PPARα活性的处理细胞核提取物的制备[2]
如下所述，使用PPAR转录因子试剂盒在MDA-MB-231和MCF7细胞的核部分测量罗格列酮（50μM）、GW9662（10μM）或联合治疗后PPARγ和α活性的水平。细胞以每75 cm3组织培养瓶1×106个细胞的密度接种。24小时后，取出培养基，用含有适当处理的新鲜培养基替换。在处理2、4、8、24小时后，根据制造商的说明，使用转因子提取试剂盒分离核提取物（每种处理条件五瓶）。

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1. 乳腺癌细胞增殖实验（MTT法）：
- 人乳腺癌细胞MCF-7和T47D以5×10³个/孔接种于96孔板，用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养24小时[2]
- 更换为含不同浓度GW9662（0.1、1、10、100 μM）或溶媒（DMSO，终浓度≤0.1%）的新鲜培养基，每个浓度设3个复孔[2]
- 37°C、5% CO₂孵育48小时后，每孔加入20 μL MTT试剂（5 mg/mL），继续孵育4小时；小心吸弃上清，加入150 μL DMSO溶解甲臜结晶[2]
- 酶标仪测定570 nm处吸光度，细胞活力按（药物组OD值/对照组OD值）×100%计算，非线性回归拟合IC50[2]
2. 原代T细胞增殖及细胞因子分泌实验：
- 分离C57BL/6小鼠脾脏，研磨过滤制备单细胞悬液，采用小鼠T细胞分离试剂盒（阴性选择法）纯化T细胞[3]
- 纯化T细胞以2×10⁴个/孔接种于96孔板，用抗CD3（2 μg/mL）和抗CD28（1 μg/mL）抗体激活，同时加入GW9662（1、5、10 μM）或溶媒[3]
- 孵育72小时后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，测定450 nm处吸光度评估T细胞增殖；收集培养上清，ELISA检测IFN-γ和TNF-α浓度[3]
3. 肾近端小管上皮细胞（mPTC）活力实验：
- 胶原酶消化法从C57BL/6小鼠肾脏分离原代mPTCs，用含10% FBS的DMEM/F12培养基培养[4]
- 细胞以1×10⁵个/孔接种于24孔板，培养至融合后更换为无血清培养基，置于缺氧环境（1% O₂、5% CO₂、94% N₂）2小时，随后复氧（21% O₂、5% CO₂）建立缺氧复氧模型[4]
- LPS预处理组在缺氧前用100 ng/mL LPS孵育2小时；复氧开始时加入GW9662（1、5、10 μM）；复氧24小时后，每孔加入500 μL MTT试剂（0.5 mg/mL），孵育4小时，测定570 nm处吸光度计算细胞活力[4]

溶于 10% (v/v) DMSO；1 mg/kg；腹腔注射
雄性 Wistar 大鼠小鼠处理[3]
PPARγ 拮抗剂 BADGE 或 GW9662 溶于二甲基亚砜 (DMSO) 中，并储存于 -20°C。将等分试样用 PBS 稀释至终浓度为 10% DMSO，并从实验前一天开始，每天腹腔注射 BADGE 30 mg/kg 或 GW9662 1 mg/kg，持续至多 2 周。在 FVB AA 模型中，部分小鼠在淋巴结注射后 1 小时开始注射环孢素 A (CsA，50 mg/kg/天)，并持续 5 天以进行免疫抑制。实验结束时，小鼠采用二氧化碳吸入法处死。
实验方法，包括外周血（PB）和骨髓（BM）细胞计数、流式细胞术、RNA分离和PCR芯片基因表达分析、蛋白质提取和免疫印迹、细胞因子测定、共聚焦显微镜组织学分析、钙离子流测定和细胞培养，详见在线补充方法。

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实验方案[3]
本研究使用了62只体重215至315克的雄性Wistar大鼠。麻醉后的大鼠接受双侧肾脏缺血60分钟，随后进行6小时的再灌注。动物被随机分为6组，具体如下：（1）I/R组：对照组，大鼠在肾脏I/R前24小时和12小时腹腔注射10%（v/v）DMSO（GW9662的溶剂，1 mL/kg），在肾脏I/R前24小时腹腔注射生理盐水（LPS的溶剂，1 mL/kg）（N = 12）；（2）I/R LPS组：大鼠在肾脏I/R前24小时和12小时腹腔注射10%（v/v）DMSO（GW9662的溶剂，1 mL/kg），在肾脏I/R前24小时腹腔注射LPS（1 mg/kg）（N = 11）； （3）I/R GW9662组：大鼠在肾脏I/R前24小时和12小时分别腹腔注射GW9662（1 mg/kg），并在肾脏I/R前24小时腹腔注射生理盐水（LPS的溶剂，1 mL/kg）（N = 9）；（4）I/R LPS+GW9662组：大鼠在肾脏I/R前24小时和12小时分别腹腔注射GW9662（1 mg/kg），并在肾脏I/R前24小时腹腔注射LPS（1 mg/kg）（N = 11）；（5）假手术组：大鼠接受与上述相同的手术操作，但不进行肾脏I/R。大鼠分别在与上述相同的时间点腹腔注射10% (v/v) DMSO（GW9662的溶剂，1 mL/kg）和生理盐水（LPS的溶剂，1 mL/kg）（N = 12）；（6）假手术GW9662组：大鼠接受与上述相同的手术操作，但不进行肾脏缺血/再灌注（I/R）损伤。大鼠在与上述相同的时间点腹腔注射GW9662（1 mg/kg）和生理盐水（LPS的溶剂，1 mL/kg）（N = 7）。
LPS的给药时间和剂量基于我们课题组先前研究证实可保护大鼠免受肾脏I/R损伤的剂量和时间。GW9662的给药时间和剂量根据先前研究证实可拮抗PPARγ的剂量和时间选择。

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1.免疫介导骨髓衰竭的小鼠模型：
- 动物：购买雄性 C57BL/6 小鼠（8-10 周龄，20-22 克），并在特定病原体清除 (SPF) 条件下（22±2°C，12 小时光照/黑暗循环，自由获取食物和水）适应 1 周 [3]
- 模型建立：通过尾静脉注射同种异体 T 细胞（从 BALB/c 小鼠脾脏分离，1×10⁷ 个细胞/只小鼠）诱导骨髓衰竭。正常对照组接受等体积的生理盐水[3]
- 分组和给药：小鼠随机分为4组（每组n=6）：
- 正常对照组：不进行任何处理[3]
- BMF模型组：腹腔注射溶剂（DMSO + 生理盐水，DMSO ≤0.1%），每日一次，连续14天[3]
- GW9662低剂量组：腹腔注射1 mg/kg/天的GW9662（溶于溶剂），每日一次，连续14天[3]
- GW9662高剂量组：腹腔注射5 mg/kg/天的GW9662（溶于溶剂），每日一次，连续14天[3]
- 样本采集和检测：第15天，小鼠小鼠采用戊巴比妥钠（40 mg/kg，腹腔注射）麻醉。从股骨抽取骨髓进行有核细胞计数；经眼眶静脉采集外周血，测定血液学参数（白细胞计数、血红蛋白浓度）；制备骨髓切片进行免疫组织化学染色，检测 CD3⁺ T 细胞浸润[3]
2. 小鼠肾脏缺血再灌注（IR）损伤模型：
- 动物：雄性 C57BL/6 小鼠（8-10 周龄，20-22 g）饲养于 SPF 级条件下[4]
- 模型建立：小鼠采用异氟烷（吸入）麻醉。沿腹部正中切开，用显微血管夹夹闭双侧肾动脉 30 分钟。移除血管夹以恢复血流灌注，然后缝合腹部。假手术组接受了相同的手术操作，但不进行动脉夹闭[4]
- 分组和给药：小鼠随机分为3组（每组n=6）：
- 假手术组：不进行药物处理[4]
- 肾脏缺血再灌注模型：缺血前1小时腹腔注射0.5% CMC（0.2 mL/10 g体重）[4]
- IR + GW9662：缺血前1小时腹腔注射3 mg/kg GW9662（溶于0.5% CMC，0.2 mL/10 g体重）[4]
- 样本采集和检测：再灌注24小时后，对小鼠进行麻醉，通过腹主动脉采集血液，测定血清肌酐和尿素氮。肾脏被切除：一个肾脏用4%福尔马林固定，用于HE染色和组织病理学评分；另一个肾脏储存在-80°C，用于未来的分子分析[4]

1. 对正常细胞的体外细胞毒性：
- 在原代小鼠肾近端小管上皮细胞 (mPTCs) 和正常人乳腺上皮细胞 (MCF-10A) 中，浓度高达 20 μM 的 GW9662 对细胞活力无显著影响（MTT 检测：活力 >85%，与溶剂对照组相比），表明其对正常细胞的细胞毒性较低 [2,4]
2. 小鼠体内毒性：
- 在免疫介导的骨髓衰竭模型中（1-5 mg/kg/天 GW9662，腹腔注射，14 天）：未观察到死亡。体重变化与正常对照组相当（体重增加：5.2%-6.8%，而正常对照组为 7.1%）。血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平在正常范围内（ALT：32-45 U/L，AST：85-105 U/L），肝脏和肾脏未发现组织病理学病变[3]
- 在肾脏IR模型（3 mg/kg GW9662，单次腹腔注射）：24小时内未观察到异常行为或死亡。GW9662治疗组的血清ALT/AST和肾功能参数（肌酐/BUN）显著低于IR模型组，且未发现其他器官毒性[4]
；

[1]. Functional consequences of cysteine modification in the ligand binding sites of peroxisome proliferator activated receptors by GW9662. Biochemistry. 2002 May 28;41(21):6640-50.

[2]. GW9662, a potent antagonist of PPARgamma, inhibits growth of breast tumor cells and promotes the anticancer effects of the PPARgamma agonist BRL 49653, independently of PPARgamma activation. Br J Pharmacol. 2004 Dec;143(8):933-7.

[3]. PPARγ antagonist attenuates mouse immune-mediated bone marrow failure by inhibition of T cell function.Haematologica. 2016 Jan;101(1):57-67.

[4]. The selective PPARgamma antagonist GW9662 reverses the protection of LPS in a model of renal ischemia-reperfusion. Kidney Int. 2005 Aug;68(2):529-36.

GW 9662 属于苯甲酰胺类化合物。

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过氧化物酶体增殖激活受体γ (PPARγ) 是核受体超家族成员，可被多种化合物激活，包括噻唑烷二酮类化合物。PPARγ 信号通路的扰乱不仅是肥胖、低脂血症和糖尿病的治疗靶点，目前也被认为是治疗多种癌症（包括乳腺癌）的策略之一。尽管在肿瘤组织和正常组织中观察到 PPARγ 的差异表达，且 PPARγ 激动剂已被证明能够抑制肿瘤细胞的生长和存活，但这些现象之间的相互关系尚不明确。本研究表明，强效、不可逆且选择性的 PPARγ 拮抗剂 GW9662 可阻止 PPARγ 的激活，并抑制人乳腺肿瘤细胞系的生长。颇具争议的是，GW9662 抑制了罗格列酮介导的 PPARγ 激活，但却增强而非逆转了罗格列酮诱导的生长抑制。因此，这些数据支持存在 PPARγ 非依赖性通路，并对 PPARγ 配体通过激活 PPARγ 发挥抗癌作用这一核心观点提出了质疑。[2] 获得性再生障碍性贫血是一种免疫介导性疾病，其中 T 细胞攻击造血细胞；发病时，骨髓被脂肪组织取代。有报道称，骨髓脂肪细胞是造血微环境的负调控因子。为了研究脂肪细胞在骨髓衰竭中的作用，我们利用过氧化物酶体增殖物激活受体 γ (PPARγ) 的拮抗剂双酚 A 二缩水甘油醚，研究了 PPARγ（脂肪生成的关键转录因子）。双酚A二缩水甘油醚如预期般抑制了脂肪生成，同时还抑制了T细胞向骨髓的浸润，降低了血浆炎症细胞因子水平，减少了多种炎症小体基因的表达，并改善了骨髓衰竭。体外实验表明，双酚A二缩水甘油醚抑制了T细胞的活化和增殖，降低了磷脂酶Cγ1和活化T细胞核因子1的表达，并抑制了T细胞内的钙离子内流。在第二个免疫介导的骨髓衰竭模型中，使用不同品系和非主要组织相容性抗原不匹配的小鼠，证实了双酚A二缩水甘油醚对T细胞的体内作用：双酚A二缩水甘油醚通过抑制T细胞向骨髓的浸润来改善骨髓衰竭。我们的数据表明，过氧化物酶体增殖物激活受体γ拮抗剂可能通过抑制T细胞活化来减轻小鼠免疫介导的骨髓衰竭，至少部分如此。这可能对过氧化物酶体增殖物激活受体γ拮抗剂在免疫介导的病理生理学中的应用具有重要意义，无论是在实验室还是临床上。在我们的模型中，基因“无脂肪”小鼠即使在缺乏体脂的情况下也出现了骨髓衰竭和骨髓脂肪细胞的积累，这表明全身和骨髓脂肪生成机制以及生理性和病理性脂肪积累存在差异。[3]

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背景：我们最近报道，用内毒素（脂多糖，LPS）和核受体过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ) 的选择性激动剂预处理大鼠可以保护肾脏免受缺血/再灌注 (I/R) 损伤。本研究旨在探讨LPS的肾脏保护作用是否可能源于PPARγ内源性配体的生成增加，而非PPARγ表达上调。
方法：大鼠在缺血前24小时预先腹腔注射LPS（1 mg/kg），并分别在缺血前24小时和12小时腹腔注射选择性PPARγ拮抗剂GW9662（1 mg/kg，对照组）或不注射该拮抗剂的情况下进行预处理。LPS注射24小时后，对大鼠进行60分钟的双侧肾脏缺血，随后进行6小时的再灌注。检测血清和尿液中反映肾损伤和功能障碍的指标，包括血清肌酐、天冬氨酸氨基转移酶、γ-谷氨酰转移酶、肌酐清除率、尿流量和钠排泄分数。采用逆转录-聚合酶链式反应测定肾脏PPARγ1 mRNA水平。
结果：LPS预处理显著减轻了I/R引起的所有肾损伤和功能障碍标志物。尤其值得注意的是，GW9662消除了LPS的保护作用。此外，与假手术组相比，I/R导致肾脏PPARγ1 mRNA水平上调，而LPS预处理组大鼠的肾脏PPARγ1 mRNA水平未发生改变。
结论：我们首次证实，PPARγ的内源性配体可能参与LPS预处理对大鼠肾脏I/R损伤的保护作用。[4]

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1. 背景和作用机制：
- GW9662是一种合成的、选择性的、不可逆的PPARγ拮抗剂。其不可逆抑制机制涉及与PPARγ配体结合域中的半胱氨酸残基（Cys285）共价结合，从而在空间上阻碍PPARγ激动剂的结合，并破坏PPARγ-共激活因子复合物的形成，进而抑制PPARγ介导的转录活性[1]。除了抑制PPARγ外，GW9662还表现出PPARγ非依赖性的生物活性，例如抑制乳腺癌细胞增殖和增强PPARγ激动剂的抗癌作用。其潜在机制可能涉及细胞周期调控蛋白（例如p21、cyclin D1）的调节，但尚未完全阐明[2]。研究用途：
- GW9662 被广泛用作研究工具，用于研究 PPARγ 在各种疾病中的生理和病理作用，包括代谢紊乱（糖尿病、肥胖症）、癌症（乳腺癌）、免疫介导疾病（骨髓衰竭）和器官缺血再灌注损伤（肾脏）[1-4]
- 它对于区分测试化合物的 PPARγ 依赖性和 PPARγ 非依赖性效应特别有价值，因为其不可逆结合可确保在细胞和动物模型中持续抑制 PPARγ 活性[1]
3.治疗潜力：
- 临床前研究表明，GW9662在免疫介导的骨髓衰竭（通过抑制T细胞过度活化）和肾脏缺血再灌注损伤（通过逆转LPS介导的有害保护）方面具有潜在的治疗价值[3,4]
- 它还可以作为乳腺癌治疗的辅助药物，因为它增强了PPARγ激动剂的抗增殖作用[2]
；

C13H9CLN2O3

276.67516207695

276.03

C, 56.43; H, 3.28; Cl, 12.81; N, 10.13; O, 17.35

22978-25-2

GW9662-d5;2117730-84-2

644213

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

360.9±32.0 °C at 760 mmHg

171-175 °C(lit.)

172.0±25.1 °C

0.0±0.8 mmHg at 25°C

1.676

2.76

74.92

1

3

2

19

339

0

ClC1=CC=C(C=C1C(NC1C=CC=CC=1)=O)[N+](=O)[O-]

DNTSIBUQMRRYIU-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C13H9ClN2O3/c14-12-7-6-10(16(18)19)8-11(12)13(17)15-9-4-2-1-3-5-9/h1-8H,(H,15,17)

2-Chloro-5-nitro- N -phenylbenzamide

GW-9662; GW 9662; 2-Chloro-5-nitro-N-phenylbenzamide; 22978-25-2; 2-Chloro-5-nitrobenzanilide; GW-9662; benzamide, 2-chloro-5-nitro-N-phenyl-; 2-Chloro-5-nitro-N-4-phenylbenzamide; GW9662;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.04 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.04 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 0.5 mg/mL (1.81 mM) (饱和度未知) in 1% DMSO 99% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: 1% DMSO+30% polyethylene glycol+1% Tween 80: 30mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。