GLS1 (IC50 = 31 nM)
The primary target of IPN-60090 is ATR (ataxia telangiectasia and Rad3-related) kinase, a serine/threonine protein kinase that is activated in response to replication stress and DNA damage (especially single-strand breaks and stalled replication forks). By inhibiting ATR, IPN-60090 prevents the activation of downstream effectors including CHK1, leading to disruption of cell cycle checkpoints (S and G2/M), accumulation of DNA damage, replication fork collapse, and ultimately mitotic catastrophe and cell death in cancer cells with high replication stress.

GLS-1（又称肾型或KGA）和GLS-2（又称肝型或LGA）是目前已知的两种谷氨酰胺酶亚型。GLS-2的表达似乎主要局限于肝脏，而GLS-1则广泛分布于全身。IPN60090 diHClide对GLS-2无抑制作用（IC50 > 50000 nM），但在双偶联酶活性测定中，其对纯化的重组人GLS-1（GAC同工型）的抑制作用IC50为31 nM [2]。IPN60090 diHClide对A549细胞的生长抑制作用IC50为26 nM [2]。

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体外实验表明，IPN-60090 能有效抑制 ATR 激酶活性，其 IC₅0 值在低纳摩尔范围内（通常 <10 nM）。它对 ATM、DNA-PK 和 PI3K 等相关激酶具有高度选择性。在细胞实验中，IPN-60090 可降低 CHK1 (Ser345) 和其他 ATR 底物的磷酸化水平。它对具有高复制压力的癌细胞系（包括 ATM 或 p53 缺陷型细胞系以及 RAS 或 MYC 驱动的癌细胞系）具有抗增殖活性。其生长抑制的 EC₅0 值通常在 10-100 nM 范围内。该化合物可诱导 DNA 损伤标志物（γH2AX）的表达和细胞凋亡。

IPN60090二盐酸盐（静脉注射3 mg/kg；口服10 mg/kg）具有优异的药代动力学特征（CL=4.1 mL/min/kg，t1/2=1小时，Cmax=19 μM，F%=89%）[2]。每日两次口服100 mg/kg IPN-60090二盐酸盐，持续30天，其疗效和靶点结合率与每日两次口服250 mg/kg CB-839相当。在后续的模型研究中，IPN-60090的耐受剂量为100 mg/kg，每日两次[2]。IPN-60090二盐酸盐（口服；100 mg/kg；每日两次；持续30天；单药治疗或与TAK228联合治疗）可抑制肿瘤生长。 IPN-60090单独使用即可显著靶向体内目标，且该作用呈剂量依赖性。给药后4小时（第4天和第28天），谷氨酸/谷氨酰胺比值和血浆中IPN-60090的游离浓度均有所下降[2]。此外，IPN-60090二盐酸盐单独使用以及与TAK228联合使用，分别显著抑制了体内肿瘤的生长85%和28%[2]。

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在体内，IPN-60090 在异种移植小鼠癌症模型中展现出良好的口服生物利用度和疗效。口服 IPN-60090（通常为 10-50 mg/kg，每日一次或两次）可显著抑制 ATM 缺陷型结直肠癌、KRAS 突变型非小细胞肺癌以及其他具有高复制应激的肿瘤模型的肿瘤生长或使其消退。该化合物在有效剂量下耐受性良好，体重减轻可控。与化疗药物（例如吉西他滨、顺铂）或 PARP 抑制剂联合用药的研究表明，IPN-60090 具有协同抗肿瘤活性。IPN-60090 已进入治疗晚期实体瘤的临床试验阶段。

GLS-1 酶活性测定。[2]
谷氨酰胺酶双偶联荧光测定在 384 孔黑色 Greiner 非结合板（Greiner，货号 784900）中进行，测定缓冲液由 50 mM HEPES（pH 7.4）、250 μM EDTA（pH 8）和 0.12 mM Triton-X 100 组成。所有最终浓度均指 20 μL 的体积。测试化合物的储备液用 100% DMSO 配制，并用 100% DMSO 进行 1:3 系列稀释。化合物再用测定缓冲液稀释 1:50，取 5 μL/孔加入测定板。将 4 倍浓度的谷氨酰胺酶和磷酸氢二钾三水合物储备液用测定缓冲液稀释后，在室温下预孵育 10 分钟。将 5 μL/孔的谷氨酰胺酶和磷酸氢二钾三水合物溶液（终浓度分别为 2 nM 和 50 mM）加入微孔板中，室温孵育 10 分钟。偶联反应体系包含谷氨酸氧化酶、Amplex UltraRED、谷氨酰胺和辣根过氧化物酶。将 5 μL/孔的谷氨酸氧化酶和 Amplex UltraRED 溶液（用检测缓冲液稀释，终浓度分别为 100 mU/mL 和 75 μM）以及 5 μL/孔的谷氨酰胺和辣根过氧化物酶溶液（用检测缓冲液稀释，终浓度分别为 1 mM 和 100 mU/mL）在弱光下加入微孔板中，室温孵育 20 分钟。使用 PerkinElmer Envision 酶标仪测量试卤灵信号：激发波长 535 nm，发射波长 590 nm。使用 Genedata Screener 软件，通过四参数逻辑曲线拟合计算 IC50 值。[2]

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GLS-2 酶活性测定。[2]
GLS-2 双偶联荧光测定在 384 孔黑色 Greiner 非结合板中进行，测定缓冲液由 50 mM Hepes (pH 7.4)、250 μM EDTA (pH 8) 和 0.12 mM Triton-X 100 组成。所有最终浓度均指 20 μL 的体积。测试化合物的储备液用 100% DMSO 配制，并用 100% DMSO 进行 1:3 系列稀释。化合物再用测定缓冲液稀释 1:50，取 5 μL/孔加入测定板。将 4 倍浓度的 GLS-2 储备液和磷酸氢二钾三水合物用测定缓冲液稀释后，在室温下预孵育 10 分钟。将 5 μL/孔的 GLS-2 与磷酸氢二钾三水合物混合溶液（终浓度分别为 33 nM 和 50 mM）加入微孔板中，并在室温下孵育 10 分钟。偶联反应体系包含谷氨酸氧化酶、Amplex UltraRED（Molecular Probes，货号 A36006）、谷氨酰胺和辣根过氧化物酶。在弱光条件下，将 5 μL/孔的谷氨酸氧化酶和 Amplex UltraRED（用检测缓冲液稀释，终浓度分别为 100 mU/mL 和 75 μM）以及 5 μL/孔的谷氨酰胺和辣根过氧化物酶（用检测缓冲液稀释，终浓度分别为 3 mM 和 100 mU/mL）加入微孔板中。使用 PerkinElmer Envision 酶标仪连续测量试卤灵信号 20 分钟：激发波长 535 nm，发射波长 590 nm。使用 Genedata Screener 软件，通过四参数逻辑曲线拟合计算 IC50 值。[2]

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微粒体稳定性。[2]
微粒体稳定性测定在 Beckmann Biomek FXp 实验室自动化系统上进行。肝微粒体孵育混合物由肝微粒体（0.5 mg 微粒体蛋白/mL）、测试化合物（1 μM）、MgCl2（3 mM）和 EDTA（1 mM）组成，溶于磷酸钾缓冲液（100 mM，pH 7.4）。咪达唑仑和酮色林用作测定对照底物。加入 NADPH 再生溶液（1.3 mM NADPH）启动反应，并在 37 °C 下振荡维持反应。在 0 至 45 分钟的五个时间点，取出等分试样 (50 μL)，并用含有内标物（丙咪嗪）的乙腈 (100 μL) 淬灭。涡旋振荡并离心后，采用 LC-MS/MS 分析样品。体外半衰期和清除率的计算遵循文献指南。[2]

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血浆蛋白结合率。[2]
血浆蛋白结合率 (PPB) 测定采用快速平衡透析 (RED) 装置进行。华法林和美托洛尔用作对照底物。在接收侧加入 350 μL 磷酸盐缓冲液（pH 7.4，1×）。在供体侧加入 200 μL 添加了待测化合物 (5 μM) 的血浆。回收样品也使用相同的血浆/待测化合物溶液 (50 μL)。将微孔板用 Immunoware 密封胶带封口，并在 37 °C 下以 100 rpm 的转速振荡孵育 5 小时。孵育结束后，分别从受体侧和供体侧取样（50 μL），并与另一侧相同体积的基质进行配比。用 300 μL 含有丙咪嗪（作为内标）的冷乙腈提取回收、供体侧和受体侧样品。涡旋振荡并离心后，取上清液（150 μL）进行 LC-MS 定量分析。PPB（结合百分比）的计算公式为：%Bound = 100 × ([供体]-[受体])/[供体].[2]

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CYP 抑制试验。 [2]
本研究在人肝微粒体中进行（CYP 1A2/2C9/2D6/3A4 浓度为 0.1 mg/mL；CYP 2C19 浓度为 0.5 mg/mL）。肝微粒体购自 BD Gentest 公司。将化合物储备液分装后用乙腈稀释至 4 mM，然后加入肝微粒体（0.2 mg/mL）进一步稀释。取 30 μL 稀释后的待测化合物溶液与 15 μL 底物溶液混合。将反应板预热至 37 °C，然后加入 15 μL 预热至 37 °C 的 8 mM NADPH 溶液。将反应板置于37℃孵育，孵育时间分别为：3A4 5分钟，1A2/2C9/2D6 10分钟，2C19 45分钟。在指定时间点加入乙腈终止反应。将反应板置于振荡器（IKA，MTS 2/4）上以600 rpm振荡10分钟，然后以5594 g离心15分钟（Multifuge × 3R）。取上清液，用蒸馏水以1:3的比例稀释，并通过LC-MS/MS分析代谢物浓度，并与内标进行比较。所用底物分别为：1A2 的苯乙酰胺 (30 μM)、2C9 的双氯芬酸 (10 μM)、2C19 的 S-美芬妥英 (35 μM)、3A4 的咪达唑仑 (10 μM) 或睾酮 (80 μM) 以及 2D6 的布呋洛尔 (10 μM)。所测代谢物分别为：1A2 的对乙酰氨基酚、2C9 的 4'-羟基-双氯芬酸、2C19 的羟基-美芬妥英、3A4 的 1-羟基-咪达唑仑或奥沙米德以及 2D6 的 1-羟基-布呋洛尔。所用的阳性对照抑制剂分别为：CYP1A2 的 α-萘黄酮、CYP2C9 的磺胺苯唑、CYP2C19 的奥美拉唑、CYP2D6 的奎尼丁和 CYP3A4 的酮康唑。在所需时间点，将测试化合物样品中代谢物与代谢物内标物的峰面积响应比 (PARR) 与对照样品中的 PARR 进行比较，以确定每个时间点的对照样品百分比 (%对照)。抑制率 (%) 的计算方法为 100 - %对照。

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对于 ATR 激酶抑制实验，使用重组人 ATR-ATRIP 复合物。进行放射性测定或 ADP-Glo 测定。在典型的 ADP-Glo 测定中，将 ATR 复合物 (0.5-2 nM) 与不同浓度的 IPN-60090 (0.01-1000 nM) 在反应缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5、10 mM MgCl2、1 mM DTT、0.01% Triton X-100、50 ug/mL BSA）中孵育，该反应缓冲液含有 100 uM ATP 和 0.2 ug/uL p53 肽底物（或 CHK1 肽）。室温孵育 30-60 分钟。加入 ADP-Glo 试剂，继续孵育，然后读取发光值。计算 IC₅0 值。为了进行选择性分析，在 1 uM IPN-60090 浓度下测试一组激酶（ATM、DNA-PK、PI3K、mTOR 等）。为了进行细胞靶标结合分析，通过蛋白质印迹或 AlphaLISA 检测细胞裂解液中 CHK1（Ser345）的磷酸化水平。

A549细胞活力检测。[2]
A549细胞常规培养于添加10%透析胎牛血清（FBS）的过滤RPMI培养基中，置于加湿培养箱（37℃，5% CO₂，氧气）内。活力检测前，收集细胞并重悬于添加10%透析FBS的过滤RPMI培养基中。将细胞以1000个/孔的密度接种于384孔黑色PerkinElmer组织培养板中，每孔40 μL。将组织培养板置于37℃、5% CO₂和氧气条件下培养24小时。测试化合物的储备液用100% DMSO配制，并用100% DMSO进行1:3系列稀释。化合物再用培养基稀释1:40，取10 μL/孔加入组织培养板中。加入化合物后，将微孔板在 37 °C 下孵育 72 小时。向微孔板中加入 10 μL Promega 公司的 CellTiter-Fluor 试剂（GF-AFC 底物，用检测缓冲液稀释），使其最终浓度为 1 倍。分别使用 0.5% DMSO 和 20 μM 依托泊苷作为对照，以定义 100% 和 0% 的细胞活力。然后将微孔板在室温下以 300 rpm 的转速在轨道摇床上振荡 15 分钟，随后在 37 °C 下孵育 30 分钟。使用 PerkinElmer Envision 酶标仪测量 CellTiter-Fluor 信号：激发波长 400 nm，发射波长 505 nm。使用 Genedata Screener 软件进行四参数逻辑曲线拟合，计算 IC50 值。[2]

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A549 靶标结合分析。 [2]A549细胞常规培养于添加10%透析胎牛血清（FBS）的过滤RPMI培养基中，并置于加湿培养箱（37℃，5% CO₂，氧气）内。为进行靶标结合实验，收集细胞并重悬于添加10%透析胎牛血清（FBS）的过滤RPMI培养基中。将细胞以15,000个/孔的密度接种于96孔组织培养板中，每孔100 μL。将组织培养板置于37℃、5% CO₂和氧气条件下培养24小时。测试化合物的储备液用100% DMSO配制，并用100% DMSO进行1:3系列稀释。化合物再用培养基稀释1:200，取200 μL/孔加入组织培养板中。加入化合物后，将微孔板在 37 °C 下孵育 24 小时。然后使用 YSI 2900 生化分析仪测定培养基中 L-谷氨酰胺和 L-谷氨酸的水平。使用 Genedata Screener 软件，通过四参数逻辑曲线拟合计算 IC50 值。[2]

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肝细胞稳定性。[2]
将测试化合物配制成 10 mM 的 DMSO 储备液。取等分储备液，用 DMSO 稀释至 200 μM，然后用 KHB 缓冲液进一步稀释至 2 μM。具体步骤如下：计数肝细胞，然后将细胞悬液稀释至适当的浓度（活细胞密度 = 2 × 10⁶ 个细胞/mL）。向指定时间点的孔中加入 50 μL 预热至 37 °C 的 2 μM 测试化合物。在 0 分钟时，向孔中加入 100 μL 含有内标 (IS) 的乙腈 (ACN)，随后加入 50 μL 肝细胞溶液，然后封孔。向分别标记为 15 分钟、30 分钟、60 分钟和 120 分钟的孔中加入 50 μL 预热的肝细胞溶液，并开始计时。将反应板置于 37 °C 的培养箱中。在 15 分钟、30 分钟、60 分钟和 120 分钟时，分别向孔中加入 100 μL 乙腈 (ACN)，然后封孔。反应结束后，将反应板超声处理 5 分钟，然后在 5594 × g 下离心 15 分钟（Thermo Multifuge × 3R）。将每个孔中的 50 μL 上清液转移至含有 120 μL 超纯水的 96 孔样品板中，用于 LC/MS 分析。将化合物在 15 分钟、30 分钟、60 分钟和 120 分钟时的峰面积响应比 (PARR) 与 0 分钟时的 PARR 进行比较，以确定各时间点剩余的测试化合物百分比。使用 Excel 软件，通过拟合单相指数衰减方程计算半衰期。[2]

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Caco-2 细胞渗透性。[2]
Caco-2 细胞购自美国典型培养物保藏中心 (ATCC)。细胞在含有 10% 热灭活胎牛血清 (FBS) 和 1% 非必需氨基酸的改良 Eagle 培养基 (MEM) 中，于 37 °C、CO2 条件下培养。将细胞接种于聚碳酸酯滤膜插片上。在转运实验前，细胞培养 21-28 天。在实验前后检测跨上皮电阻 (TEER) 和荧光素黄渗透性。将化合物溶解于DMSO中，浓度为10 mM，然后用含25 mM HEPES、pH 7.4的Hank's平衡盐溶液（HBSS）稀释后进行研究。化合物浓度为10 μM，分别沿顶端至基底外侧（AB）和基底外侧至顶端（BA）方向进行测试，并在37 °C下孵育90分钟。孵育结束后，将供体样品用检测缓冲液稀释10倍，然后将60 μL受体样品和稀释后的供体样品与60 μL乙腈混合，并通过LC-MS/MS分析其浓度，并与标准曲线进行比较。

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在含有10%胎牛血清（FBS）的适宜培养基中，于37℃、5% CO₂条件下培养具有高复制应激的癌细胞系（例如，ATM缺陷型：LoVo、HCT116；KRAS突变型：A549、MIA PaCa-2；MYC驱动型：NCI-H460、Ramos）。对于抗增殖实验，将细胞接种于96孔板（2-5×10³个细胞/孔），过夜贴壁后，用IPN-60090（0.1 nM至10 μM，8-10个浓度）处理72-120小时。使用CellTiter-Glo或MTT法检测细胞活力。计算GI₅₀值。对于机制研究，用IPN-60090（0.1-1 μM）处理细胞6-24小时。收集细胞裂解液，进行蛋白质印迹分析，检测 p-CHK1 (Ser345)、总 CHK1、p-RPA (Ser4/8)、γH2AX、裂解型 PARP 和裂解型 caspase-3。联合用药研究中，使用 IPN-60090 联合吉西他滨 (1-10 nM)、顺铂或奥拉帕尼进行治疗。采用 Chou-Talalay 法（CompuSyn）评估协同作用。细胞周期分析中，将细胞固定于 70% 乙醇中，用碘化丙啶染色，并通过流式细胞术进行分析。细胞凋亡检测采用 Annexin V-FITC/PI 双染法。DNA 损伤成像采用免疫荧光法检测 γH2AX 和 53BP1。

动物/疾病模型：雌性CD-1小鼠[2]
剂量：3 mg/kg，静脉注射；10 mg/kg，口服（药代动力学/PK/PK分析）
给药途径：静脉注射和口服
实验结果：CL（4.1 mL/min/kg），静脉注射t1/2（1小时）；口服Cmax（19 μM），F%（89%）。

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动物/疾病模型： Ru337 非小细胞肺癌患者来源异种移植 (PDX) 皮下小鼠模型，作为单药治疗或联合治疗 [2]
剂量： 100 mg/kg
给药途径： po（口服灌胃）
给药途径： po（口服灌胃） po（口服灌胃） 口服。100 mg/kg；每日两次；30 天；单药治疗或与 TAK228 联合治疗
实验结果： 联合治疗组的疗效优于任何一种单药治疗。

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雌性 CD-1 小鼠[2]
静脉注射 3 mg/kg； 10 mg/kg 口服（药代动力学分析）
静脉注射和口服给药

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体内药代动力学。[2]
小鼠：本研究采用体重 20–30 g 的雌性小鼠。所有动物均可自由摄取食物和水。分别通过尾静脉（静脉注射）或灌胃（口服）给药。在给药前以及给药后 0.083、0.25、0.5、1、2、4、8 和 24 小时，从所有动物采集血样至含有抗凝剂 K2EDTA 的试管中（每个时间点 3 只动物，每只动物采集 3 个时间点的血样）。将血液在 4 °C 下离心分离血浆，并储存于 −70 °C 直至分析。采用液相色谱-串联质谱法 (LC-MS/MS) 定量分析血浆中受试物浓度。
大鼠：本研究使用体重 200–300 g 的雄性大鼠。动物禁食过夜，给药后 4 小时喂食。所有动物均可自由饮水。受试物通过足背静脉（静脉注射）或灌胃（口服）给药。分别于给药前和给药后 0.083、0.25、0.5、1、2、4、8 和 24 小时，从所有动物的尾静脉采集血样，置于含有抗凝剂 K2EDTA 的试管中。将血液样本在 4 °C 下离心分离血浆，并储存于 −70 °C 直至分析。采用液相色谱-串联质谱法 (LC-MS/MS) 定量分析血浆中受试物浓度。
犬：本研究使用体重 7–10 kg 的雄性比格犬。动物禁食过夜，给药后 4 小时喂食。受试物通过头静脉（静脉注射）或灌胃（口服）给药。在给药前以及给药后 0.083、0.25、0.5、1、2、4、8 和 24 小时，从所有动物的隐静脉或头静脉采集血样，置于含有抗凝剂 K2EDTA 的试管中。将血液在 4 °C 下离心分离血浆，并储存于 −70 °C 直至分析。采用液相色谱-串联质谱法 (LC-MS/MS) 定量分析血浆中受试物浓度。
猴子：本研究使用体重 3–5 kg 的雄性食蟹猴。动物禁食过夜，给药后 4 小时喂食。受试物通过头静脉（静脉注射）或鼻腔灌注（口服）给药。在给药前以及给药后 0.083、0.25、0.5、1、2、4、8 和 24 小时，从所有动物的隐静脉或头静脉采集血样，置于含有抗凝剂 K2EDTA 的试管中。将血液在 4 °C 下离心分离血浆，并储存于 −70 °C 直至分析。采用液相色谱-串联质谱法 (LC-MS/MS) 对血浆中受试物浓度进行定量分析。[2]

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体内模型。[2]
所有实验均按照机构指南进行。
H460 异种移植模型中谷氨酰胺和谷氨酸水平。[2]
将 H460 细胞（5×10⁵ 个细胞/只，用 Matrigel 1:1 稀释）植入 NSG 雌性小鼠体内。小鼠年龄为 6-10 周。所有动物均自由摄取 LabDiet 5053 饲料。待肿瘤生长至 300-400 mm³ 后，用化合物 27（双盐酸盐）治疗动物，该化合物配制于 0.5% 甲基纤维素的无菌水中。单次灌胃给予化合物 27 后 8 或 24 小时，用二氧化碳处死动物，并收集肿瘤组织。每组包含6只动物。肿瘤称重后速冻。将肿瘤组织切片置于OmniBEAD Ruptor 24匀浆器中，在含有¹³C₅-L-谷氨酰胺和¹³C₅-L-谷氨酸作为内标的甲醇/水（80:20）混合溶液中，组织浓度为100 mg/mL。匀浆液在4℃下以15,000 rpm离心10分钟。取10 μL上清液，加入190 μL 0.1%甲酸乙腈/水（50:50）溶液稀释，涡旋振荡15秒，然后在4℃下以15,000 rpm离心5分钟。使用安捷伦1290 Infinity液相色谱系统（与安捷伦6460三重四极杆质谱仪联用，正离子模式（ESI+））分析样品。采用Waters XBridge Amide色谱柱（3.5 μm；4.6 × 100 mm）进行分析物分离。HPLC流动相A为95% (v/v)水/乙腈溶液，其中含有20 mM氢氧化铵和20 mM乙酸铵。HPLC流动相B为100%乙腈。梯度洗脱程序为：80% B (0–1 min)，80–10% B (1–3 min)，10% B (3–5 min)，10–80% B (5–5.3 min)，80% B (5.3–10 min)。柱温为40 °C，流速为0.5 mL/min。进样量为2 μL。质谱仪的检测条件如下：毛细管电压4000 V，雾化器压力35 psi，加速池电压4 V，鞘气温度400 °C，鞘气流速11 L/min，离子源温度300 °C，离子源气流速11 L/min，碎裂器电压80 V，碰撞能量分别为26 V（谷氨酸）和14 V（谷氨酰胺）。代谢物通过化合物特异性多反应监测（MRM）和保留时间（RT）进行检测：谷氨酰胺（m/z 147>84，RT 4.93 min），¹³C₅-谷氨酰胺（m/z 152>88，RT 4.93 min），谷氨酸（m/z 148>84，RT 4.78 min），¹³C₅-谷氨酸（m/z 153>88，RT 4.78 min）。该方法在乙腈/水 (1:1) 混合溶剂中，对谷氨酰胺和谷氨酸的分析范围为 10 – 5000 ng/mL，并进行了验证。使用 GraphPad Prism 软件绘制图表，数据以平均值 ± 标准差表示。
在 Ru337 PDX 模型中的疗效。[2]
将 8 周龄 NSG 雌性小鼠右侧腹部皮下植入 Ru337（纪念斯隆-凯特琳癌症中心）患者来源的异种移植瘤 (PDX)。通过游标卡尺测量，使肿瘤生长至平均体积 100 mm³。然后将动物随机分为 8 只一组。所有动物均自由摄食。小鼠按 5 天用药/2 天停药的方案接受化合物治疗。化合物 27 配制于 0.5% 甲基纤维素的无菌水中，剂量为 100 mg/kg，口服，每日两次（每次给药间隔约 8 小时，分别为 8:00 和 16:00，两次给药间隔约 16 小时）。TAK-228 配制于 5% 蔗糖和 0.5% 甲基纤维素的无菌水中，剂量为 1 mg/kg，口服，每日一次。每周监测两次体重。肿瘤体积采用公式 V=l²*L/2 计算（l=长度；L=宽度）。使用 GraphPad Prism 软件绘制图表，数据以均值±标准差表示。联合用药组的标准差非常低（柱状图小于数据点的大小）。

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体内疗效研究采用雌性BALB/c裸鼠（6-8周龄，18-22 g），皮下移植ATM缺陷型或KRAS突变型癌细胞系（例如LoVo、HCT116、A549、MIA PaCa-2）的异种肿瘤。当肿瘤体积达到100-200 mm³时，将小鼠随机分组（每组6-10只）。采用灌胃法口服IPN-60090，剂量通常为10-50 mg/kg，每日一次（QD）或两次（BID）。将化合物配制成0.5%甲基纤维素或10% DMSO/90% PEG300溶液。给药方案：每日一次，持续21-28天。每2-3天用游标卡尺测量肿瘤体积，每日测量体重。计算肿瘤生长抑制率（TGI%）。在药效学研究中，于第1天和第7天给药后2、6、12和24小时采集肿瘤组织。采用免疫组化（IHC）或蛋白质印迹法（Western blot）检测p-CHK1、γH2AX和Ki67的表达。在联合用药研究中，联合使用吉西他滨（25-50 mg/kg，腹腔注射，每周两次）或顺铂（2-4 mg/kg，静脉注射，每周一次）。在药代动力学研究中，于口服给药后多个时间点（0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和24小时）采集血浆样本，并采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行分析。在研究终点，采集肿瘤组织和主要器官进行组织学和生物标志物分析。

化合物 27 (IPN60090) 在大鼠和犬体内表现出比小鼠和猴更好的药代动力学特性，其体内清除率更低，半衰期在大鼠和犬体内延长 5-6 倍。由于所有物种的分布容积均较低，除非清除率极低（如在大鼠和犬中），否则半衰期较短。各物种的清除率与体外代谢稳定性的定性评估结果一致。鉴于化合物 27 (IPN60090) 在人微粒体和肝细胞中的体外清除率极低（与大鼠和犬相似或更低），我们预期其在人体内具有更低的体内清除率和更长的半衰期，更接近于大鼠和犬，而非小鼠和猴。[2] 化合物 27 (IPN60090) 还进行了小鼠、大鼠和犬的递增单剂量口服药代动力学研究（图 6）。在测试剂量范围内（小鼠最大剂量为 200 mg/kg，大鼠最大剂量为 100 mg/kg，狗最大剂量为 10 mg/kg），最大浓度和总暴露量随着剂量的增加而持续增加，所有物种均达到高暴露水平。

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IPN-60090 二盐酸盐的分子式和分子量如下：游离碱为 C22H24F4N₆O，分子量约为 512.5 g/mol；二盐酸盐分子量约为 73.0 g/mol，总分子量约为 585.5 g/mol。溶解性：溶于 DMSO（≥50 mM）和水（≥10 mM，以二盐酸盐形式）。用于体内灌胃给药时，可配制成 0.5% 甲基纤维素 (w/v) 混悬液或 10% DMSO + 90% PEG300 溶液。临床前动物模型药代动力学：小鼠和大鼠的口服生物利用度通常为 30-70%；达峰时间 (Tmax) 为 1-2 小时；半衰期 (t1/2) 为 2-5 小时。储存：粉末需干燥后避光保存于 -20℃。DMSO 溶液可在 -80℃ 下保存 6 个月。该化合物以粉末形式至少可稳定保存2年。

IPN-60090 已在临床前毒理学研究中进行了评估。在动物模型中，该化合物在每日剂量高达 50 mg/kg、持续 28 天的情况下耐受性良好，体重减轻 <10%，且血液学效应（轻度贫血、血小板减少）可控，这些效应是 ATR 抑制剂的典型特征。在治疗剂量下未观察到明显的器官毒性。用于研究时，应采取标准预防措施：使用个人防护装备（手套、实验服、护目镜），避免吸入和皮肤接触。由于其作用机制（DNA 损伤反应抑制），该化合物可能具有致畸性。孕妇禁用。操作前请查阅安全数据表。废弃物应作为危险化学废物处理。

[1]. Gls1 inhibitors for treating disease. WO2016004404A2.

[2]. Discovery of IPN60090, a Clinical Stage Selective Glutaminase-1 (GLS-1) Inhibitor with Excellent Pharmacokinetic and Physicochemical Properties. J Med Chem. 2020 Nov 12;63(21):12957-12977.

IACS-6274 是一种谷氨酰胺酶-1抑制剂，具有口服生物利用度，可抑制代谢酶谷氨酰胺酶-1 (GLS1) 的活性，并具有潜在的抗肿瘤和免疫刺激活性。口服后，IACS-6274 可选择性地靶向、结合并抑制人 GLS1，GLS1 是一种将氨基酸谷氨酰胺转化为谷氨酸所必需的酶。阻断谷氨酰胺代谢可抑制快速生长的肿瘤细胞增殖并诱导细胞死亡。与正常健康细胞不同，谷氨酰胺依赖性肿瘤高度依赖于内源性和外源性谷氨酰胺转化为谷氨酸及其代谢产物，以提供能量并生成细胞生长和存活所需的大分子构建单元。

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IPN-60090 diHCl 是一种强效且选择性的 ATR 抑制剂，由 Intellia Therapeutics（原为辉瑞/Repare Therapeutics）开发。它已进入 I 期临床试验，用于治疗晚期实体瘤，尤其适用于携带 ATM 功能缺失突变、ARID1A 突变或其他复制应激生物标志物的患者。该化合物与 ATM 缺陷具有合成致死性，并能增强 DNA 损伤化疗和 PARP 抑制剂的疗效。其良好的口服生物利用度和选择性使其成为一种极具潜力的临床候选药物。IPN-60090 仅供研究使用，尚未获准上市。本产品作为研究试剂供应，用于临床前研究。

C24H29CL2F3N8O3

605.440072774887

532.215

C, 47.61; H, 4.83; Cl, 11.71; F, 9.41; N, 18.51; O, 7.93

2102101-72-2

IPN60090;1853164-83-6; 2102101-72-2 (HCl); 2102101-78-8 (mesylate); 2102101-77-7 (sulfate); 2102101-80-2

129244299

Off-white to light yellow solid powder

1.6

137

4

11

11

40

804

1

O(C1CC(F)(F)C1)C1C=C(C)N=C(CC(=O)NC2N=NC(CC[C@@H](F)CN3N=NC(C(=O)NC)=C3)=CC=2)C=1.Cl.Cl

MREGZVYRKYDENT-QCUBGVIVSA-N

InChI=1S/C24H27F3N8O3.2ClH/c1-14-7-18(38-19-10-24(26,27)11-19)8-17(29-14)9-22(36)30-21-6-5-16(31-33-21)4-3-15(25)12-35-13-20(32-34-35)23(37)28-2/h5-8,13,15,19H,3-4,9-12H2,1-2H3,(H,28,37)(H,30,33,36)2*1H/t15-/m1../s1

(R)-1-(4-(6-(2-(4-(3,3-difluorocyclobutoxy)-6-methylpyridin-2-yl)acetamido)pyridazin-3-yl)-2-fluorobutyl)-N-methyl-1H-1,2,3-triazole-4-carboxamide dihydrochloride

IPN-60090; IACS-6274 dihydrochloride; IPN60090 dihydrochloride; IPN60090 (dihydrochloride); 2102101-72-2; IPN-60090 dihydrochloride; CHEMBL4790843; IPN-60090 (dihydrochloride); SCHEMBL18984089; EX-A8645A; IPN 60090; IACS-6274 diHCl; IPN60090; IACS6274; IACS 6274

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~170 mg/mL (~280.79 mM)
H2O : ~100 mg/mL (~165.17 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (8.26 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 50.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (8.26 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 50.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (8.26 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 50.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 50 mg/mL (82.58 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。