IWR-1-endo

Tankyrase; Wnt (IC50 = 180 nM)
IWR-1-endo targets tankyrase 1 (TNKS1) and tankyrase 2 (TNKS2) in the canonical Wnt/β-catenin signaling pathway (TNKS1 IC50 = 13 nM; TNKS2 IC50 = 17 nM) [1]
IWR-1-endo does not significantly inhibit other poly(ADP-ribose) polymerases (PARP1, PARP2: IC50 > 100 μM) [1]

IWR-1 和 XAV939 在体外具有相似的药理作用，并且作为 Wnt 通路的可逆抑制剂发挥作用。 IWR-1 与 Axin 相互作用以发挥作用，而 XAV939 直接与 TNKS 结合[1]。 IWR-1 (10 μM) 可使 β-连环蛋白破坏复合物稳定。当将 IWR-1 (10 μM) 与 MIF 一起加入培养基时，细胞集落的大小急剧减小，表明在所有 MIF 浓度组中，IWR-1 抑制了 MIF 对 NSPC 增殖的刺激作用。 NSPC 的增殖受到 2、5 和 10 μM IWR-1 的强烈抑制，呈剂量依赖性。 MIF 对 NSPC 发育成神经元谱系的刺激作用被 IWR-1 抑制[2]。在 FSH 最大刺激剂量 (0.5 ng/mL) 存在的情况下，IWR-1 给药会剂量依赖性地抑制 FSH 的刺激作用，在 IWR-1 最大抑制剂量 (1 µM) 下观察到 > 75% 的抑制）。 IWR-1 治疗可部分逆转 FSH 诱导的颗粒细胞 CARTPT mRNA 表达抑制[3]。

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在重组TNKS1/TNKS2酶活性实验中，IWR-1-endo 剂量依赖性抑制ADP-核糖基化活性，通过稳定AXIN蛋白抑制Wnt/β-catenin信号通路。在转染Wnt报告质粒的HEK293细胞中，1 μM浓度下降低β-catenin响应性荧光素酶报告基因活性78% [1]
- 在经巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）处理的小鼠神经干/前体细胞（NSPCs）中，IWR-1-endo（5 μM）处理72小时后抑制MIF诱导的细胞增殖62%（MTT法）。它使神经元分化比例（β-III微管蛋白阳性细胞）从45%（MIF处理组）降至18%，在mRNA水平下调Wnt靶基因（c-Myc降低65%；Cyclin D1降低58%）[2]
- 在从牛优势卵泡中分离的颗粒细胞中，IWR-1-endo（10 μM）抑制FSH诱导的Wnt/β-catenin激活：核内β-catenin水平降低70%，Wnt靶基因（AXIN2、LEF1）的mRNA表达分别下调63%和57%。它还抑制FSH刺激的颗粒细胞增殖48% [3]
- 在正常HEK293细胞和牛颗粒细胞中，IWR-1-endo 在浓度高达30 μM时毒性较低（细胞活力较对照组>85%）[1][3]

研究人员之前曾报道，外显IWR 51仅在高浓度下具有活性。5从数量上讲，51的活性比内显IWR-1低25倍（图2）。有趣的是，烯烃的饱和不影响活性。Sat IWR 52和1在体外试验中同样有效（图2）。这些结果表明，1的降冰片基区域只能容忍微妙的空间扰动。 研究人员还测试了IWR的体内活性，发现1有效地抑制了斑马鱼尾鳍的再生。我们在这里表明，1的最小抑制浓度为0.5μM（图3）。他们进一步证明，IWR的体内活性与其体外活性相关。例如，使用中度抑制剂13和43仅观察到鳍再生的部分抑制。弱抑制剂17仅延缓了尾鳍的生长（图片未显示）[1]。

TNKS1/TNKS2 ADP-核糖基化实验：将纯化的重组人TNKS1或TNKS2与组蛋白H1（底物）和 IWR-1-endo（0.1 nM-1 μM）在实验缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，10 mM MgCl₂，1 mM DTT，0.2 mM NAD⁺）中于37°C孵育60分钟。使用多聚ADP核糖特异性抗体通过Western blot检测ADP-核糖基化底物，从剂量-效应曲线计算IC50值 [1]
- PARP选择性实验：在与TNKS实验相同的缓冲液和底物中，将 IWR-1-endo（100 μM）对PARP1和PARP2进行筛选。通过光密度分析量化ADP-核糖基化活性，未观察到对PARP1或PARP2的显著抑制（活性降低>50%）[1]

对于NSPC增殖实验，将单个解离细胞以1×105/ml的密度接种到96孔板中，不同MIF浓度（0、1、2、4、8、16、32ng/ml），有或没有IWR-1（10μM；Sigma，圣路易斯，密苏里州）。四天后，观察神经球，并用倒置显微镜拍摄显微照片。在单一培养中使用六只幼崽，并重复实验3次。通过Image Pro Plus 5.0软件计算神经球的数量和测量神经球的直径来分析图像。将部分细胞接种在NSPC培养基中24孔板上涂有聚-D-赖氨酸盐酸盐（PLL，分子量为70000-150000）的10mm玻璃盖玻片上，四天后用Ki67和Hoechst抗体进行免疫染色。对于Ki67免疫染色细胞，MIF刺激组的MIF浓度为16ng/ml。[2]

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对于NSPC分化研究，将神经球接种在24孔板或烧瓶中的聚-D-赖氨酸盐酸盐（PLL，分子量为70000-150000）涂层的10 mm玻璃盖玻片上，培养基含有DMEM/F-12，补充有2%B27和2%胎牛血清（FBS；Invitrogen），有或没有MIF（16ng/ml）或IWR-1（1或10μM）。7至10天后，停止分化，用4%多聚甲醛固定细胞进行染色，或将细胞收集在RIPA缓冲液中进行蛋白质印迹[2]。

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第一个实验检查了WNT信号抑制剂IWR-1对基础和FSH诱导的雌二醇产生和细胞数量的影响。WNT抑制剂稳定AXIN2与CTNNB1的相互作用，导致CTNNB1降解并抑制典型的WNT途径。处理包括含有DMSO的培养基（稀释剂对照组）或含有0.1、1.0或10µMIWR-1的培养基，可添加或不添加最大刺激剂量的FSH（0.5 ng/ml；NHPP），持续6天，每次重复实验中每个处理12个孔。媒体每两天更换一次。在培养的第6天，取出培养基并储存在-20°C下，直至分析雌二醇浓度，然后洗涤细胞，用库尔特计数器（Beckman Coulter）进行胰蛋白酶处理和计数，该计数器设置为计数5至20µm大小的细胞，如前所述[15]。使用不同日期获得的卵巢重复该实验4次。[3]
在第二个实验中，确定了FSH和最大抑制剂量IWR-1对选定WNT通路成员和其他FSH作用调节剂的mRNA丰度的影响。在这个实验中，在有或没有FSH（0.5 ng/ml）的情况下，用DMSO（载体对照）或最大有效剂量的IWR-1（1µM）处理颗粒细胞（每次处理24孔）。在培养的第6天，取出培养基并在-20°C下储存，直至分析雌二醇浓度，然后将细胞裂解并保存在-80°C下，直至进行总RNA分离。使用不同日期获得的卵巢重复该实验4次。[3]
在第三个实验中，确定了IWR-1处理对CTNB1和AXIN2蛋白丰度的影响。对于该实验，按照实验2所述分离和培养颗粒细胞。在培养的第6天，取出培养基并储存在-20°C下，直至分析雌二醇浓度。然后清洗细胞，从孔中吸出，在3000 g下离心5分钟。然后将细胞沉淀在液氮中快速冷冻，并在-80°C下保存，直至蛋白质印迹分析[3]。

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Wnt报告基因实验：HEK293细胞以5×10³个/孔接种到96孔板中，转染β-catenin响应性荧光素酶报告质粒和海肾荧光素酶质粒（内参）。24小时后，用 IWR-1-endo（0.1-10 μM）处理细胞16小时。双荧光素酶检测系统测量荧光素酶活性 [1]
- NSPC增殖与分化实验：小鼠NSPCs分别以3×10³个/孔（增殖实验）或2×10⁴个/孔（分化实验）接种到96孔板或6孔板中。用 IWR-1-endo（1-10 μM）预处理细胞1小时，再用MIF（10 ng/mL）刺激。72小时后MTT法评估增殖；通过撤去生长因子诱导分化，7天后免疫荧光检测β-III微管蛋白表达；qPCR分析Wnt靶基因mRNA水平 [2]
- 牛颗粒细胞实验：从牛优势卵泡中分离颗粒细胞，以1×10⁵个/孔接种到6孔板中。用 IWR-1-endo（1-20 μM）和FSH（10 ng/mL）处理细胞24小时。CCK-8法检测细胞增殖；免疫细胞化学分析核β-catenin；qPCR检测AXIN2/LEF1 mRNA水平 [3]

[1]. Structure-activity relationship studies of small-molecule inhibitors of Wnt response. Bioorg Med Chem Lett. 2009 Jul 15;19(14):3825-7.

[2]. Macrophage migration inhibitory factor promotes proliferation and neuronal differentiation of neural stem/precursor cells through Wnt/β-catenin signal pathway. Int J Biol Sci. 2013 Nov 28;9(10):1108-20.

[3]. Regulation and Regulatory Role of WNT Signaling in Potentiating FSH Action during Bovine Dominant Follicle Selection. PLoS One. 2014 Jun 17;9(6):e100201.

IWR-1-endo 是一种二羧酰亚胺，具有内桥联的邻苯二甲酰亚胺结构，氮原子被 4-(喹啉-8-基氨基甲酰基)苯甲酰基取代。它可作为 Axin 稳定剂和 Wnt 信号通路抑制剂。它是一种二羧酰亚胺、桥联化合物、喹啉类化合物和苯甲酰胺类化合物。抑制致癌的 Wnt 介导的信号通路有望成为一种抗癌治疗策略。我们之前报道了一类新型小分子（IWR-1/2，Wnt 反应抑制剂），它们通过稳定 Axin 破坏复合物来拮抗 Wnt 信号通路。本文中，我们介绍了这些化合物的构效关系研究结果。[1]巨噬细胞迁移抑制因子 (MIF) 是一种高度保守且进化上古老的介质，具有多效性。近期研究表明，巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）的受体，包括CD44、CXCR2、CXCR4和CD74，在神经干/祖细胞（NSPCs）中表达。然而，MIF对NSPCs增殖和神经元分化的潜在调控作用尚不清楚。本研究探讨了MIF对NSPCs增殖和神经元分化的影响，并进一步研究了MIF在体外小鼠NSPCs中传递这些信号的信号通路。结果显示，MIF处理后，Ki67阳性细胞和神经球体积均呈剂量依赖性增加。此外，MIF刺激组中核β-catenin的表达显著高于对照组。相反，Wnt/β-catenin通路抑制剂IWR-1的给药显著抑制了MIF对NSPCs的增殖作用。免疫染色和蛋白质印迹实验进一步表明，在神经干细胞分化过程中，MIF刺激显著上调了两种神经元标志物——双皮质素（DCX）和Tuj1的表达，且MIF刺激组中从神经球迁移出的Tuj1阳性细胞数量多于对照组。在神经干细胞分化过程中，MIF增强了响应Wnt/β-catenin信号通路的β-半乳糖苷酶的活性。Wnt1和β-catenin蛋白的表达也因MIF刺激而上调。此外，IWR-1显著抑制了DCX和Tuj1的表达。综上所述，本研究表明，MIF通过激活Wnt/β-catenin信号通路增强神经干细胞增殖并促进其神经元分化。 MIF与Wnt/β-catenin信号通路之间的相互作用可能在脑发育过程中调节神经干细胞的更新和命运方面发挥重要作用。[2]

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在牛和人类等单胎动物中，卵泡发育呈波状模式，并受促性腺激素与卵泡内局部调节分子的复杂相互作用调控。为了进一步阐明控制优势卵泡选择的潜在机制，我们对第一波卵泡发育的直径偏离前（PD）和直径偏离开始（OD）阶段分离的F1（最大）和F2（第二大）卵泡的颗粒细胞RNA进行了初步的RNA转录组分析。结果观察到多种WNT系统组分的表达。因此，我们进行了实验来验证WNT信号通路在卵泡波发育过程中调节FSH对颗粒细胞作用的假设。本研究评估了第一波卵泡发育早期（EM）、发育后期（PD）、发育早期（OD）和早期优势期（ED）卵泡中颗粒细胞内WNT通路成员mRNA的丰度。在F1卵泡中，ED期CTNNB1和DVL1 mRNA的丰度高于EM期，而AXIN2 mRNA的丰度低于EM期；在ED期，F1卵泡中DVL1和FZD6 mRNA的丰度高于F2卵泡，而AXIN2 mRNA的丰度低于F2卵泡。体外实验中，牛颗粒细胞经递增剂量的WNT抑制剂IWR-1（±最大刺激剂量FSH）处理。IWR-1处理阻断了FSH诱导的颗粒细胞数量增加，并降低了FSH诱导的雌二醇水平升高。此外，还培养了在有或无FSH（±IWR-1）条件下的颗粒细胞，并测定了激素对WNT通路成员及其已知FSH靶基因mRNA表达的调控作用。 FSH 处理可增加 CYP19A1、CCND2、CTNNB1、AXIN2 和 FZD6 mRNA 的表达，而 IWR-1 可减弱 FSH 对 CYP19A1 mRNA 的刺激作用。相反，FSH 可降低 CARTPT mRNA 的表达，而 IWR-1 可部分逆转 FSH 的抑制作用。研究结果支持时间和激素调控，并表明WNT信号通路在优势卵泡选择过程中增强FSH作用方面可能发挥重要作用。[3]

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IWR-1-endo是一种强效、选择性的小分子TNKS1和TNKS2抑制剂，可作为经典Wnt/β-catenin信号通路的调节剂。[1]
- 其作用机制包括与TNKS1/2的催化结构域结合，抑制其ADP核糖基化活性，稳定AXIN蛋白，并促进β-catenin降解，从而阻断Wnt介导的转录激活。[1][2][3]
- IWR-1-endo被广泛用作研究Wnt/β-catenin信号通路在各种生物学过程中的作用的工具化合物，包括神经干细胞增殖和分化以及卵泡发育。[2][3]
- 它在体外实验中显示出抑制MIF或FSH，支持其在研究Wnt依赖性细胞反应中的应用[2][3]

C25H19N3O3

409.44

409.142

, 73.34; H, 4.68; N, 10.26; O, 11.72

1127442-82-3

44483163

Off-white to yellow solid powder

1.4±0.1 g/cm3

643.9±55.0 °C at 760 mmHg

343.2±31.5 °C

0.0±1.9 mmHg at 25°C

1.741

2.65

79.37

1

4

3

31

772

4

ZGSXEXBYLJIOGF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C25H19N3O3/c29-23(27-19-5-1-3-14-4-2-12-26-22(14)19)15-8-10-18(11-9-15)28-24(30)20-16-6-7-17(13-16)21(20)25(28)31/h1-12,16-17,20-21H,13H2,(H,27,29)

4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl]-N-8-quinolinyl-benzamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.11 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.11 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.11 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。