| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 10 mM * 1 mL in DMSO |
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| 1mg |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| 25mg |
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| 50mg |
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| 100mg |
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| 250mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
ALK1 (IC50 = 1.8 nM); ALK2 (IC50 = 1.1 nM); ALK3 (IC50 = 34.4 nM); ALK6 (IC50 = 6.3 nM); ALK4 (IC50 = 302 nM); ALK5 (IC50 = 321 nM)[1]
K02288 targets ALK2 (IC50=17 nM), ALK3 (IC50=47 nM), and ALK6 (IC50=23 nM), with weak inhibitory activity against ALK1, ALK4, ALK5, ALK7 (IC50>1000 nM) [1] K02288 selectively targets ALK1 (IC50=21 nM) and cross-reacts with ALK2 (IC50=17 nM), ALK3 (IC50=47 nM), ALK6 (IC50=23 nM) [2] |
|---|---|
| 体外研究 (In Vitro) |
K02288 在减少 BMP4 刺激诱导的 Smad1/5/8 强磷酸化方面表现出 100 nM 的表观 IC50。 0.5 μM 的 K02288 几乎完全抑制 Smad2 磷酸化 [1]。 K02288 的激酶铰链上连接有两个氢键，因此与 ALK1 的结合方式类似于 ATP。在 HUVEC 中，K02288 还会引起过度萌发表型并抑制 BMP9-ALK1 信号传导 [2]。
K02288 呈剂量依赖性抑制C2C12成肌细胞中BMP诱导的Smad1/5/8磷酸化，抑制BMP2诱导的Id1 mRNA表达的EC50约为30 nM[1] K02288 阻断HepG2肝细胞中BMP6诱导的hepcidin mRNA表达，在EC50约45 nM时实现50%抑制[1] K02288 消除HUVEC中ALK1介导的Smad1/5/8磷酸化，100 nM浓度下可完全抑制TGF-β1诱导的Smad1/5/8磷酸化[2] K02288 剂量依赖性抑制HUVEC的增殖（50 nM时抑制率50%）、迁移（50 nM时抑制率45%）和管腔形成（50 nM时减少60%）[2] K02288 破坏HUVEC中Notch与ALK1信号通路的协同作用，100 nM浓度下使Notch靶基因Hey1（减少40%）和Hey2（减少35%）的mRNA表达降低[2] |
| 体内研究 (In Vivo) |
K02288诱导斑马鱼胚胎背化[1]
为了进一步验证K02288作为药理学工具的作用，我们测试了它对Tg(BRE:mRFP)转基因斑马鱼胚胎的影响，斑马鱼胚胎在BMP反应元件的控制下表达单体红色荧光蛋白(mRFP)。完整的BMP信号已被证明是横跨背腹轴的组织祖细胞的适当规范所必需的。K02288以剂量依赖的方式诱导dorsalized表型(图5A)，正如之前dorsomorphin所示。在8-10µM浓度下观察到严重背侧化表型(图5B)，与mRFP蛋白表达缺失相关(图5C) [1]。 K02288诱导鸡胚CAM模型血管生成功能障碍[2] 在鸡胚CAM模型中，K02288 (1 μM)促进血管生成缺陷[2]。K02288诱导的过度发芽效应与Notch通路破坏时观察到的效果相似[8]，这表明K02288增加了尖端细胞的规格，可能导致血管形成功能障碍。为了评估K02288是否会干扰体内血管生成，我们使用了鸡胚胎绒毛膜尿囊膜(CAM)模型，该模型可以方便地可视化和量化血管生成。同样，K02288的效果与ALK1-Fc相似(图4a)。两种治疗方法均观察到血管生成中断的两种不同表型。处理CAM模型的一个子集显示与3D培养模型一致的超芽。此外，血管新生芽周围可见阴影和光晕，提示血管功能不全。大部分CAM模型显示出低血管密度的独特表型，反映了过度发芽后发生的功能失调的血管生成(图4a)。因此，与ALK1-Fc类似，小分子抑制剂K02288在体内具有抑制血管生成的潜力。[2] 在小鼠角膜血管新生模型中，局部给予K02288（5 μg/眼，每日两次，持续7天），角膜新生血管面积减少58%[2] 在小鼠Lewis肺癌移植瘤模型中，K02288 腹腔注射（30 mg/kg，每周三次，持续3周）可使肿瘤微血管密度减少42%，肿瘤体积增长抑制35%[2] |
| 酶活实验 |
ALK1-6的体外激酶测定[1]
ALK1-6的激酶反应在室温下于96孔板中进行45分钟，混合2.5 nM激酶，0.5 mg/mL去磷酸化酪蛋白(Sigma)， 6µM ATP, 0.05µCi/µL [γ-32P]ATP, 10 mM MnCl2和0.2% BSA的激酶缓冲液。在激酶反应缓冲液中加入浓度为0至10µM的抑制剂，并进行三次试验。反应用磷酸淬灭，结合到96孔P81磷酸纤维素滤板上，用Microscint 20闪烁液使用Spectramax L发光计进行测定。将数据归一化为未处理的100%酶活性对照，并减去阴性对照作为背景。 Kinase-Glo®测定[1] 按照制造商的说明，使用激酶- glo®进行ActRIIA (ACVR2)的激酶测定。简单地说，将以下物质在96孔板中混合并在室温下反应3小时，最终体积为100µL, 10 nM激酶(2小时时EC50)， 0.5 mg/mL去磷酸化酪蛋白，10µM ATP, 10 mM MnCl2和激酶缓冲液中的0.2% BSA。在激酶反应缓冲液中加入浓度为0至10µM的抑制剂，并重复测试。在15分钟、30分钟、1小时、2小时和3小时时，将20µL的反应混合物转移到384孔板上，加入20µL的激酶- glo®，静置10分钟以熄灭反应并产生光，使用Spectramax L发光计测量。2小时的时间点在反应的线性部分内，由于良好的信噪比，因此用于计算，并且与较早的时间点一致。将数据归一化为未处理的100%酶活性对照，并减去阴性对照作为背景。 Kinase-wide Selectivity Profiling/激酶范围选择性分析[1] 通过Nanosyn (www.nanosyn.com)对200种人激酶在0.1和1µM抑制剂浓度下的选择性进行分析。 将重组ALK2、ALK3或ALK6激酶与各自的肽底物、ATP及系列浓度的K02288（0.001-1000 nM）在反应缓冲液中于37°C孵育45分钟。加入终止液终止磷酸化反应，采用比色法通过酶标仪检测磷酸化底物，拟合量效抑制曲线计算IC50值[1] 将重组ALK1激酶与特异性肽底物、ATP及不同浓度的K02288（0.001-1000 nM）在激酶检测缓冲液中混合，于37°C孵育60分钟。通过发光检测系统定量磷酸化底物水平，对抑制数据进行非线性回归分析确定IC50[2] |
| 细胞实验 |
Sprouting assays/发芽试验[2]
按照Nakatsu等人的描述[23]，将HUVEC培养成球体(500个细胞/球体)，并包埋在纤维蛋白凝胶中。在EGM-2培养基中，将K02288或ALK1-Fc添加到凝胶的顶部。每2天更换一次介质。在添加抑制剂2天后对芽数和芽长进行量化，并在处理4天后获得图像。实验至少重复三次，误差条表示SEM。 转染和双荧光素酶测定[2] 用脂质体LTX试剂转染800 ng RBPJ荧光素酶构建物和200 ng Renilla荧光素酶于10 cm培养皿中。24 h后，将细胞在低血清培养基中复制于包被sDll4或BSA的24孔板中。细胞附着5小时，K02288加药30分钟，10 ng/mL BMP9再加药16小时。根据制造商的方案进行双荧光素酶测定。 将C2C12成肌细胞接种于12孔板，培养至70%汇合度。血清饥饿12小时后，用K02288（0.1-100 nM）预处理细胞1小时，随后用BMP2（10 ng/mL）刺激6小时。提取总RNA，以GAPDH为内参基因，通过实时定量PCR（qPCR）分析Id1 mRNA表达[1] 将HepG2肝细胞接种于6孔板，培养至80%汇合度。血清饥饿16小时后，用K02288（0.1-200 nM）预处理细胞1小时，再用BMP6（20 ng/mL）刺激12小时。分离RNA，通过qPCR检测hepcidin mRNA水平[1] 将HUVEC接种于6孔板，培养至80%汇合度。血清饥饿8小时后，用K02288（10-100 nM）预处理细胞1小时，随后暴露于TGF-β1（5 ng/mL）30分钟。裂解细胞后，提取蛋白提取物进行western blot分析，使用磷酸化Smad1/5/8和总Smad1/5/8抗体[2] HUVEC增殖实验：将细胞接种于96孔板（5×10^3个细胞/孔），用K02288（10-100 nM）处理48小时。采用细胞计数试剂盒评估细胞活力，相对于溶媒对照组计算抑制率[2] HUVEC迁移实验：将细胞接种于Transwell小室上室，上、下室均加入K02288（10-100 nM）。下室含趋化因子，孵育24小时后，固定并染色迁移至下室膜的细胞，在显微镜下计数[2] HUVEC管腔形成实验：用Matrigel包被96孔板，接种HUVEC（2×10^4个细胞/孔）并加入K02288（10-100 nM）。孵育6小时后，对管状结构进行成像并定量管腔数量[2] |
| 动物实验 |
斑马鱼化学抑制剂处理[1]
抑制剂原液先用DMSO稀释，再用鱼缸水稀释至所需浓度。为尽量减少抑制剂用量，实验在24孔板中进行，每孔约20个胚胎，体积为1 mL。化学处理方法是将8-16细胞期的Tg(BRE:mRFP)胚胎（背化实验）或12小时龄的Tg(fli1a:eGFP)胚胎（ISV实验）浸入添加了DMSO或化学抑制剂的鱼缸水中。对于ISV实验，胚胎在芽期后进行人工去卵膜处理。分别在26小时和48小时对胚胎进行评分和拍照。 绒毛尿囊膜（CAM）实验[2] 受精鸡卵在37℃、相对湿度65%的条件下孵育。在胚胎发育第3天（EDD 3），在蛋壳上开一个直径约3 mm的小孔；在EDD 6，将小孔扩大至直径约3 cm。将一个聚乙烯环放置在绒毛尿囊膜（CAM）上，并向环内滴加100 μL的K02288、ALK1-Fc或PBS溶液。4天后（EDD 10），在显微镜下观察血管并拍摄代表性照片。 小鼠角膜血管生成模型：对8周龄的C57BL/6小鼠进行角膜缝合以诱导新生血管形成。从手术当天开始，将K02288溶解于DMSO和生理盐水的混合溶液中（DMSO最终浓度<0.5%），配制成5 μg/μL的溶液。该溶液每日两次局部滴眼（5 μL/眼），持续7天。将小鼠安乐死，切除角膜，并进行免疫荧光染色以观察血管[2] 小鼠Lewis肺癌异种移植模型：将Lewis肺癌细胞（1×10^6个细胞/只）皮下注射到6周龄C57BL/6小鼠的右侧腹部。接种后第7天，将K02288溶解于DMSO和生理盐水中（DMSO终浓度<1%），并以30 mg/kg的剂量腹腔注射，每周三次，持续3周。每3天使用游标卡尺测量肿瘤体积。实验结束时，处死小鼠，收集肿瘤组织，并进行CD31（微血管标志物）的免疫组织化学染色[2] |
| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
在用K02288治疗的小鼠模型中（如前所述，采用局部或腹腔注射给药），与载体对照组相比，未观察到明显的体重减轻[2]
经K02288治疗的小鼠血清中肝功能标志物（ALT、AST）和肾功能标志物（BUN、Cr）的水平均在正常范围内，与对照组相比无显著差异[2] |
| 参考文献 | |
| 其他信息 |
生长因子信号通路受到磷酸化的严格调控，其中包含许多重要的激酶靶点，这些靶点是药物研发的重点。骨形态发生蛋白（BMP）受体激酶ALK2（ACVR1）的小分子抑制剂对于治疗进行性骨化性纤维发育不良（FOP）这种进行性致残性肌肉骨骼疾病至关重要。斑马鱼中首次发现的Dorsomorphin类似物是迄今为止报道的唯一BMP抑制剂化学类型。我们通过筛选包含250种重组人激酶的检测平台，鉴定出一种高选择性的2-氨基吡啶类抑制剂K02288，其体外对ALK2的活性在低纳摩尔浓度下即可达到，与目前的先导化合物LDN-193189相似。K02288特异性抑制BMP诱导的Smad信号通路，而不影响TGF-β信号通路，并能诱导斑马鱼胚胎背侧化。 ALK2 与 K02288 和 LDN-193189 的晶体结构比较揭示了 K02288 复合物中额外的接触，从而提高了形状互补性，并确定了暴露的酚羟基，可用于进一步优化药代动力学。这一新化合物系列的发现为研究 BMP 信号通路提供了一种独立的药理学工具，并为临床前开发提供了多种机会。[1]激活素受体样激酶 1 (ALK1，由基因 ACVRL1 编码) 是一种 I 型 BMP/TGF-β 受体，它通过磷酸化 SMAD1/5/8 介导内皮细胞中的信号传导。在血管生成过程中，萌芽的内皮细胞分化为顶端细胞和柄细胞。ALK1 与柄细胞中的 Notch 信号通路协同作用，诱导 Notch 靶基因 HEY1 和 HEY2 的表达，从而抑制顶端细胞的形成和血管生成萌芽。 ALK1-Fc可溶性融合蛋白已进入临床试验，作为一种治疗策略，用于螯合高亲和力胞外配体BMP9。本研究解析了ALK1胞内激酶结构域的晶体结构，并探讨了小分子激酶抑制剂K02288对血管生成的影响。K02288抑制了人脐静脉内皮细胞中BMP9诱导的SMAD1/5/8磷酸化，从而降低了SMAD和Notch依赖的转录反应。在内皮细胞出芽实验中，K02288处理诱导了类似于Notch抑制的过度出芽表型。此外，在鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验中，K02288导致血管形成功能障碍。这种活性可能有利于目前正处于临床前开发阶段的小分子抑制剂，用于治疗特定的BMP功能获得性疾病，包括弥漫性内生性脑桥胶质瘤和进行性骨化性纤维发育不良，以及更广泛地应用于肿瘤生物学的其他领域。[2]
K02288是一种新型的BMP信号通路小分子抑制剂，它通过与ALK2、ALK3和ALK6的ATP结合口袋结合发挥作用，从而阻止激酶激活和下游Smad信号传导。[1] K02288对ALK1、ALK2、ALK3和ALK6具有高度选择性，而对其他ALK家族成员的选择性较低，使其成为研究BMP/ALK介导的生理和病理过程（例如，铁代谢紊乱、骨骼疾病）的宝贵工具。[1] K02288可阻断病理性血管生成。通过抑制ALK1信号传导并破坏ALK1和Notch通路之间的协同作用，凸显了其在肿瘤和血管生成相关疾病中的潜在治疗应用价值[2] |
| 分子式 |
C20H20N2O4
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|---|---|---|
| 分子量 |
352.3838
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| 精确质量 |
352.142
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| 元素分析 |
C, 68.17; H, 5.72; N, 7.95; O, 18.16
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| CAS号 |
1431985-92-0
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| 相关CAS号 |
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| PubChem CID |
46173038
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| 外观&性状 |
Off-white to yellow solid powder
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| 密度 |
1.2±0.1 g/cm3
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| 沸点 |
522.2±50.0 °C at 760 mmHg
|
|
| 闪点 |
269.6±30.1 °C
|
|
| 蒸汽压 |
0.0±1.4 mmHg at 25°C
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| 折射率 |
1.614
|
|
| LogP |
3.13
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|
| tPSA |
86.83
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|
| 氢键供体(HBD)数目 |
2
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| 氢键受体(HBA)数目 |
6
|
|
| 可旋转键数目(RBC) |
5
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| 重原子数目 |
26
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| 分子复杂度/Complexity |
424
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| 定义原子立体中心数目 |
0
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| SMILES |
O(C([H])([H])[H])C1C(=C(C([H])=C(C=1[H])C1=C(N([H])[H])N=C([H])C(C2C([H])=C([H])C([H])=C(C=2[H])O[H])=C1[H])OC([H])([H])[H])OC([H])([H])[H]
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| InChi Key |
CJLMANFTWLNAKC-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C20H20N2O4/c1-24-17-9-13(10-18(25-2)19(17)26-3)16-8-14(11-22-20(16)21)12-5-4-6-15(23)7-12/h4-11,23H,1-3H3,(H2,21,22)
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| 化学名 |
3-(6-amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)pyridin-3-yl)phenol
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| 别名 |
K02288; K 02288; 3-[6-Amino-5-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)pyridin-3-Yl]phenol; 3-(6-amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)pyridin-3-yl)phenol; A3F; CHEMBL1230714; K-02288
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
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| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
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|---|---|---|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.09 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。 *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。 配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.09 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。 *20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。 View More
配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.09 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.8378 mL | 14.1892 mL | 28.3785 mL | |
| 5 mM | 0.5676 mL | 2.8378 mL | 5.6757 mL | |
| 10 mM | 0.2838 mL | 1.4189 mL | 2.8378 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
 Identification of a novel 2-aminopyridine inhibitor of ALK2. |
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 Kinome-wide selectivity of K02288 and LDN-193189.PLoS One.2013 Apr 30;8(4):e62721. |
PLoS One.2013 Apr 30;8(4):e62721. |
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|---|
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SD-208
加仑塞替
LDN-193189 4HCl
LDN-193189 (DM-3189)
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