RAB7A (inhibits recruitment of RAB7A to lysosomes, thereby blocking autophagosome-lysosome fusion) [1]
DNM1L (induces dephosphorylation at Ser637 and mitochondrial translocation, leading to mitochondrial fission) [1]

20 µM 的莲心碱处理增加了 MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞中 EGFP-LC3 斑点的形成。[1] 莲心碱导致 LC3B-II、LAMP1 和 SQSTM1 呈剂量和时间依赖性积累，而 BECN1 水平在 MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞中保持不变。[1] 20 µM 莲心碱处理 24 小时后，U937、LN229 和 A549 细胞中 LC3B-II 和 SQSTM1 的水平升高。[1] 透射电镜分析显示，莲心碱处理的细胞中自噬小泡增多，线粒体部分分裂。[1] 莲心碱增加了 EGFP-LC3 与 RFP-mito 的共定位，表明线粒体自噬受到调控。 [1]
利恩辛宁（20 µM，24 小时）可增加 EGFP-LC3 稳定细胞中的总 EGFP 强度，与巴弗洛霉素 A1 的作用相似；与巴弗洛霉素 A1 联合处理后，EGFP 强度未进一步增加。[1]
利恩辛宁处理导致 LC3B-II 和 SQSTM1 的积累，巴弗洛霉素 A1 并未进一步增强这种积累，而雷帕霉素诱导的 LC3B-II 增加可被巴弗洛霉素 A1 进一步增强。[1]
tfLC3 报告基因检测显示，利恩辛宁导致出现黄色（绿色和红色）LC3 斑点，表明自噬通量在后期受到阻断，与巴弗洛霉素 A1 的作用相似，而雷帕霉素仅产生红色斑点。 [1] 莲心碱阻断自噬体-溶酶体融合：EGFP-LC3斑点与LysoTracker Red不共定位，mRFP-LC3与LAMP1-mGFP不共定位。[1] 莲心碱以时间依赖性方式增加LAMP2和RAB7A蛋白水平。[1] 免疫沉淀实验表明，莲心碱降低LAMP1与LC3B-II或RAB7A的相互作用，但不改变RAB7A与LC3B-II的相互作用。[1] 免疫荧光实验表明，莲心碱降低LAMP1和RAB7A的共定位，但不改变EGFP-LC3和RAB7A的共定位。[1] 莲心碱增加CTSB、CTSD和CTSL的前体/原体形式，并降低成熟形式的水平；雷帕霉素的作用相反。 [1]
吖啶橙染色显示，与对照组相比，莲心碱增加了酸性囊泡（红色荧光）的数量，而巴弗洛霉素A1则减少了酸性囊泡的数量。[1]
溶酶体传感器黄/蓝DND-160染色显示，莲心碱不改变溶酶体pH值（pH约为4.5），而巴弗洛霉素A1则提高了溶酶体pH值。[1]
莲心碱消除了CTSD与LAMP1的共定位。[1]
在MDA-MB-231和MCF-7细胞中，与单药治疗相比，莲心碱（20 µM）与化疗药物（阿霉素、紫杉醇、长春新碱、顺铂、星形孢菌素）联合治疗降低了细胞活力。 [1]
与单药治疗（约5-10%）相比，莲心宁联合阿霉素（MDA-MB-231细胞0.2 µM，MCF-7细胞0.4 µM）可显著增加细胞凋亡（约50%），并促进CASP9和CASP3的裂解和PARP1的降解，以及线粒体向胞质释放CYCS。[1]
莲心宁联合阿霉素可进一步增强全细胞裂解液和线粒体组分中LC3B-II、SQSTM1、泛素、HSPD1和COX4I1的积累。[1]
联合治疗可增加自噬/线粒体自噬空泡的数量，并通过透射电镜观察到线粒体肿胀和嵴异常。 [1]
联合治疗增加了EGFP-LC3斑点及其与RFP-mito的共定位。[1]
联合治疗显著增加了线粒体碎片化（线粒体分裂）细胞的比例，如MitoTracker Red CMXRos染色所示。[1]
莲心宁联合阿霉素增加了线粒体中DNM1L的水平，降低了胞质中DNM1L的水平，并降低了磷酸化DNM1L（Ser637）的水平，但不影响磷酸化DNM1L（Ser616）的水平。[1]
Mdivi-1（DNM1L抑制剂）预处理减少了联合治疗诱导的DNM1L易位、LC3B-II和SQSTM1在线粒体中的积累、线粒体分裂和细胞凋亡。 [1]
siRNA敲低DNM1L可减少联合用药诱导的DNM1L线粒体定位、线粒体分裂、LC3B-II积累和细胞凋亡。[1]
过表达DNM1L S637D突变体（磷酸化模拟物）可减弱联合用药诱导的细胞凋亡、CASP3激活和CYCS释放；DNM1L S637A突变体略微增强了阿霉素介导的细胞凋亡，而莲心碱可进一步增强这种凋亡。[1]
3-MA（自噬抑制剂）预处理可减少联合用药诱导的LC3B-II积累、DNM1L去磷酸化（Ser637）和线粒体易位、线粒体分裂、细胞凋亡、CYCS释放和CASP3激活。 [1]
敲低ATG5或ATG7可减少联合用药诱导的LC3B-II积累、DNM1L去磷酸化和线粒体易位、线粒体分裂、细胞凋亡、CASP3激活以及CYCS释放。[1]

与甲硝唑类药物类似，莲心宁（灌胃给药，100 或 200 mg/kg，每日一次，持续 10 周）能够以剂量依赖的方式有效治疗牙周炎[2]。在小鼠异种移植模型（MDA-MB-231 细胞皮下接种于裸鼠）中，莲心宁（60 mg/kg，每日腹腔注射）联合多柔比星（2 mg/kg，每 4 天腹腔注射一次）治疗 30 天，与溶剂对照组、单独使用莲心宁组或单独使用多柔比星组相比，肿瘤生长显著减少（P<0.01）。各组间未观察到显著的体重变化。[1] 联合治疗组小鼠肿瘤的 H&E 染色显示，肿瘤形态发生显著改变，包括坏死、炎症细胞浸润和纤维化。 TUNEL染色显示联合治疗显著增加了TUNEL阳性细胞（棕色）。免疫组化显示裂解型CASP3的免疫反应性增强。[1]
肿瘤切片的免疫荧光显示联合治疗增加了LC3斑点和LC3与HSPD1的共定位，以及DNM1L与TOMM20的共定位。[1]

细胞（MDA-MB-231、MCF-7、U937、LN229、A549、293FT）在含10%胎牛血清（FBS）的适宜培养基中，于37℃、5% CO2条件下培养。[1]
细胞活力检测（MTT法）：将细胞以每孔2000-5000个的密度接种于96孔板中，按指定方法处理48-72小时后，每孔加入20 µl MTT（5 mg/ml），孵育4小时，再加入150 µl DMSO溶解甲臜，于490 nm处测定吸光度。[1]
流式细胞术凋亡检测：根据制造商说明，使用ANXA5-FITC/PI试剂盒对细胞进行染色。 [1]
酸性囊泡检测：细胞用吖啶橙（1.5 µg/ml）在 37°C 下染色 15 分钟，然后通过流式细胞术分析红色（660 nm）与绿色（530 nm）荧光比值。[1]
EGFP-LC3 稳定细胞：稳定表达 EGFP-LC3 的 MDA-MB-231 细胞用 G418（200 µg/ml）维持培养，然后进行处理，并通过流式细胞术分析总 EGFP 强度。[1]
透射电镜 (TEM)：细胞在 4°C 下用 2.5% 戊二醛固定过夜，室温下用 2% 四氧化锇后固定 1.5 小时，包埋，用醋酸铀/柠檬酸铅染色，并在 60 kV 下观察。 [1]
对于转染：使用 Lipofectamine 3000 将编码 mRFP-LC3、tfLC3、LAMP1-mGFP、EGFP-LC3、RFP-mito、ATG5-siRNA、ATG7-siRNA、DNM1L siRNA 或通过定点诱变产生的 DNM1L-mCherry 突变体 (S637A, S637D) 的质粒转染到细胞中。 [1]
对于线粒体和胞质分离：收集细胞，用冷的 PBS 洗涤，重悬于缓冲液 A（20 mM HEPES pH7.5、10 mM KCl、1.5 mM MgCl2、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM Na3VO4、2 mM 亮抑蛋白酶肽、1 mM PMSF、1 mM DTT、2 mM 胃蛋白酶抑制剂 A、250 mM 蔗糖）中，通过 22 号针头均质 30 次，在 4°C 下以 3,500 g 离心（沉淀 = 线粒体组分），上清液在 4°C 下以 120,000 g 离心（上清液 = 胞质组分）。 [1]
对于蛋白质印迹：在 1× NuPAGE LDS 样品缓冲液中制备总蛋白裂解物，或通过 BCA 测定定量线粒体/胞质组分，通过 SDS-PAGE 分离，转移到 PVDF 膜上，用 5% 脱脂奶粉（溶于 TBS-Tween20）封闭，与一抗（LC3B、SQSTM1、LAMP1、LAMP2、RAB7A、CTSB、CTSD、CTSL、BECN1、PARP1、cleaved CASP9、cleaved CASP3、CYCS、DNM1L、phospho-DNM1L Ser616、phospho-DNM1L Ser637、COX4I1、HSPD1、TOMM20、泛素、ACTB、GAPDH）孵育，然后与 HRP 标记的二抗孵育，用 ECL 底物显色。 [1]
免疫沉淀：将总蛋白裂解液与一抗在4℃摇床上孵育，用Protein A/G琼脂糖珠收集免疫复合物，PBS洗涤5次，然后进行SDS-PAGE和Western blot分析。[1]
免疫荧光：将细胞或组织切片用4%多聚甲醛固定30分钟，用0.1% Triton X-100的PBS溶液透化5-10分钟，用10%驴血清的PBS溶液封闭，与一抗孵育过夜，然后与合适的二抗孵育，最后用共聚焦显微镜观察。线粒体和溶酶体根据制造商的说明分别用MitoTracker Red CMXRos、LysoTracker Red DND-99或LysoSensor Yellow/Blue DND-160染色。 [1]
溶酶体pH测量：将细胞用5 µM LysoSensor Yellow/Blue DND-160在37°C下标记5分钟，用PBS洗涤，然后在冰冷的25 mM MES校准缓冲液（pH 3.5-6.0，含5 mM NaCl、115 mM KCl、1.2 mM MgSO4）中用10 µM莫能菌素和10 µM尼日利亚菌素处理2分钟。在340 nm和380 nm激发下测量535 nm处的光发射，生成pH校准曲线。 [1]
克隆形成生长实验：将稳定表达ATG5-siRNA、ATG7-siRNA或对照siRNA的MDA-MB-231细胞与莲心宁和阿霉素共同处理48小时，然后将5000个细胞重新接种于6孔板中，培养1-7天，并用细胞计数器计数。[1]

动物/疾病模型： KM 小鼠 [2]
剂量： 100 mg/kg，200 mg/kg
给药途径： 口服（灌胃），每日一次，持续 10 周
实验结果： 与对照组相比，牙龈指数降低，SOD、CAT 和 GSH-Px 水平升高，NO、MDA 和 ET 水平降低。

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动物/疾病模型： 癌症研究所 (ICR) 小鼠（雄性，20-22 克）[3]
剂量：
给药途径： 口服 5 mg/kg； 1 mg/kg 静脉注射 (iv) 给药
实验结果： 联心宁在小鼠体内的药代动力学/PK参数 口服 (5 mg/kg) 静脉注射 (1 mg/kg) AUC(0-t) (ng/mL*h) 18.8 ± 2.7 211.2 ± 54.9 AUC(0-∞) (ng/mL*h) 19.1 ± 2.8 227.9 ± 60.1 MRT(0-t) (h) 3.2 ± 0.4 2.6 ± 0.5 MRT(0-∞) (h) 3.4 ± 0.5 3.5 ± 0.9 t1/2z (h) 1.9 ± 0.2 3.8 ± 0.8 CLz/F (L/h/kg) 266.0 ± 41.3 4.7 ± 1.2 Vz/F (L/kg) 708.5 ± 79.9 25.9 ± 11.0 Cmax (ng/mL) 5.3 ± 0.2 169.5±53.5

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将 1×10^7 个 MDA-MB-231 细胞悬浮于含 Matrigel 基底膜基质的 1:1 无血清 DMEM 培养基中，皮下接种于 5-7 周龄的雌性裸鼠。[1]
肿瘤接种一周后，将小鼠随机分为 4 组（每组 8 只）。每日腹腔注射莲心宁 (60 mg/kg)。每隔 4 天注射一次阿霉素 (2 mg/kg)。治疗持续 30 天。测量肿瘤直径，并计算肿瘤体积 (mm^3)，公式为 (最短直径 × 最长直径)/2。 [1]
小鼠在给药30天后处死。处死前30分钟，小鼠腹腔注射200 µl 1%戊巴比妥钠溶液。切除肿瘤，并用福尔马林固定或在-20°C下速冻。进行TUNEL染色、组织学（H&E染色）和免疫组织化学分析。[1]

[1]. A novel autophagy/mitophagy inhibitor liensinine sensitizes breast cancer cells to chemotherapy through DNM1L-mediated mitochondrial fission. Autophagy. 2015;11(8):1259-79.

[2]. Protective effect of liensinine on periodontitis through its antioxidant effect in mice. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry volume 58, pages927-936.

[3]. Pharmacokinetics and bioavailability of liensinine in mouse blood by UPLC-MS/MS. Acta Chromatographica,Volume 33: Issue 4,14 Oct 2020.

莲（Nelumbo nucifera）是一种异喹啉类化合物。它存在于莲（Nelumbo nucifera）中，并已有相关数据报道。

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莲心碱是从莲（Nelumbo nucifera Gaertn）种子胚中提取的主要异喹啉生物碱，已知具有广泛的生物活性，包括抗心律失常、抗高血压、抗肺纤维化和舒张血管平滑肌。[1]
本研究首次证实莲心碱通过阻断自噬体-溶酶体融合来抑制晚期自噬/线粒体自噬，其机制可能是抑制RAB7A募集至溶酶体而非自噬体。[1]
莲心碱与化疗药物（尤其是阿霉素）联合使用，代表了一种治疗乳腺癌的新策略。该组合通过去磷酸化（Ser637）和DNM1L的线粒体转位触发线粒体分裂，从而增强阿霉素介导的细胞凋亡。自噬体/线粒体自噬体的过度积累（“自噬应激”）与此过程有关。[1]

C37H42N2O6

610.7392

610.304

2586-96-1

Liensinine Diperchlorate;5088-90-4;Liensinine perchlorate;2385-63-9

160644

White to off-white solid powder

1.2±0.1 g/cm3

722.0±60.0 °C at 760 mmHg

95-99ºC

390.4±32.9 °C

0.0±2.4 mmHg at 25°C

1.618

4.84

83.86

2

8

9

45

917

2

CN1CCC2=CC(=C(C=C2[C@H]1CC3=CC=C(C=C3)O)OC4=C(C=CC(=C4)C[C@@H]5C6=CC(=C(C=C6CCN5C)OC)OC)O)OC

XCUCMLUTCAKSOZ-FIRIVFDPSA-N

InChI=1S/C37H42N2O6/c1-38-14-13-26-20-35(43-4)37(22-29(26)30(38)16-23-6-9-27(40)10-7-23)45-33-18-24(8-11-32(33)41)17-31-28-21-36(44-5)34(42-3)19-25(28)12-15-39(31)2/h6-11,18-22,30-31,40-41H,12-17H2,1-5H3/t30-,31-/m1/s1

4-[[(1R)-6,7-dimethoxy-2-methyl-3,4-dihydro-1H-isoquinolin-1-yl]methyl]-2-[[(1R)-1-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-6-methoxy-2-methyl-3,4-dihydro-1H-isoquinolin-7-yl]oxy]phenol

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~81.87 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.41 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.41 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.41 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 20 mg/mL (32.75 mM) in 50% PEG300 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶 (<60°C).
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。