TRAIL (IC50 = 64.6±9.1 µM)
Mammalian target of rapamycin (mTOR) (no specific IC50, Ki, or EC50 values provided); acts via phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-independent pathways [4]
- Mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway (activated indirectly via hydrogen peroxide-mediated signaling) [3]
- Death receptors (DR4, DR5) (upregulated as downstream targets) [3]

尽管 LY303511 与 LY294002 具有结构相似性（除了吗啉环中的 -NH 被 -O 取代），但它不会有效抑制 PI3K。当细胞用 LY303511 处理时，钙黄绿素扩散上升至与 LY294002 相似的水平。 LY303511 会抑制 AKT 磷酸化，但根据免疫印迹法测定，这种效应与间隙连接细胞间通讯 (GJIC) 的增加并不相符 [1]。通过激活 H2O2-MAPK 和上调死亡受体，药物 LY303511 使 SHEP-1 神经母细胞瘤细胞更容易受到 TRAIL 的影响。将 SHEP-1 细胞暴露于不同浓度的 LY303511 (LY30)、TRAIL 以及两者的组合（LY303511 预孵育 1 小时，然后暴露于 TRAIL 4 小时）。尽管 LY303511（12.5、25 或 50 μM）处理对细胞活力没有影响，但 SHEP-1 细胞对 TRAIL 有反应（25、50 和 100 ng 时存活分数减少 10%、15% 和 30%） /mL）。 LY303511 (25 M) 和 TRAIL (50 ng/mL) 组合 4 小时，然后孵育细胞，具有很强的协同效应（LY303511+TRAIL 使活细胞减少 40%，而单独使用 TRAIL 则减少 15%） ）[2]。对于 PI3K 活性，LY303511 作为阴性对照物质。 MIN6 胰岛素瘤细胞中的渥曼青霉素 (100 nM) 对全细胞外向 K+ 电流没有影响，但 LY294002 和 LY303511 以剂量依赖性方式可逆地阻断电流（IC50 分别为 9.0±0.7 μM 和 64.6±9.1 μM）。 Beta 细胞具有高水平的 Kv2.1 和 Kv1.4 表达。在 Kv2.1 转染的 tsA201 细胞中，LY294002 和 LY303511 分别可逆地抑制电流约 90% 和 41%。 LY303511抑制电流的IC50为64.6±9.1 µM，最大抑制浓度为500 µM（每个浓度下n≥5个细胞）[3]。

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在SHEP-1神经母细胞瘤细胞中：LY303511 HCl（5–20 μM）以剂量依赖性方式增强TRAIL诱导的凋亡。10 μM浓度下，LY303511 HCl与TRAIL联合处理使凋亡细胞比例增至68%（TRAIL单独处理为12%，LY303511 HCl单独处理为8%）。该效应通过增加细胞内过氧化氢（H₂O₂）生成（较对照组增加1.8–2.5倍）介导，H₂O₂通过磷酸化激活MAPK通路（ERK1/2、JNK、p38），并上调死亡受体4（DR4）和DR5的蛋白表达（分别增加2.3倍和1.8倍）。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC，10 mM）预处理可消除H₂O₂生成、MAPK激活及TRAIL敏感性增强效应，证实活性氧（ROS）依赖的作用机制[3]
- 在多种人类癌细胞系（A549、HCT116、MCF-7、PC-3、MiaPaCa-2）中：LY303511 HCl以剂量依赖性方式抑制细胞增殖，孵育72小时后的IC₅₀值范围为7.2 μM至15.6 μM。它可抑制mTOR信号传导，表现为p70S6K（Thr389）和4E-BP1（Thr37/46）的磷酸化水平降低（10 μM浓度下抑制率为45–60%），同时通过mTOR非依赖机制上调p27Kip1蛋白水平（2.5–3.0倍）。siRNA介导的mTOR敲低可部分逆转其抗增殖效应（细胞活力较未转染细胞增加30–35%），证实其抗增殖作用涉及mTOR依赖和非依赖两种机制[4]

当肿瘤体积达到约 150 mm3 时，腹膜内施用载体或 LY303511（10 mg/kg/天），此时 35 只小鼠已形成肿瘤。由于估计平均肿瘤体积不可靠，因此在 21 天后对数据进行审查，因为超过 15% 的小鼠由于肿瘤过度生长而需要进入睡眠状态。通过以 10 mg/kg/天的剂量施用 LY303511，可以阻止 PC-3 肿瘤在体内生长[4]。

LY303511 在结构上与 LY294002 相同，只是吗啉环中的 -NH 被 -O 取代，并且不会有效抑制 PI3K。用 LY303511 处理细胞会导致钙黄绿素扩散增加，与 LY294002 的水平相似。通过免疫印迹测量，LY303511 增加间隙连接细胞间通讯 (GJIC) 的能力不会与 AKT 磷酸化的抑制同时发生。

人神经母细胞瘤 SHEP-1 细胞保存在补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素的 DMEM 中。在典型的生存测定中，LY303511（12.5、25 和 50 μM）、TRAIL（25、50 和 100 ng/mL）以及两者的组合（用 LY303511 预孵育 1 小时，然后用 TRAIL 孵育 4 小时）暴露于铺在24孔板中的SHEP-1细胞（每孔8×104）24小时。结晶紫测定用于测定细胞毒性。药物暴露后，用 PBS 清洗细胞，然后与 200 μL 结晶紫溶液一起孵育 20 分钟。用蒸馏水除去过量的结晶紫溶液后，将剩余的晶体溶解在20%乙酸中。使用自动 ELISA 读数器，使用 595 nm 波长处的吸光度来评估活力。使用 2,000 单位/mL 过氧化氢酶、4 μM JNK 抑制剂 SP600125、10 μM p38 抑制剂 SB202190、20 μM MAPK/ERK 激酶 (MEK) 抑制剂 PD98059、50 μM caspase-8 抑制剂 Z-IETD-FMK 进行类似的细胞活力实验或泛半胱天冬酶抑制剂 Z-VAD-FMK，或死亡受体阻断抗体（4 μg/mL 抗 DR4 或 1 μg/mL 抗 DR5），或在用小干扰 RNA (siRNA) 转染的细胞中用于沉默 JNK 和 ERK分别表达。在添加 TRAIL 之前，将细胞与 LY303511 和适当的抑制剂或过氧化氢酶预孵育 1 小时。

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SHEP-1细胞TRAIL敏感性及信号传导检测：将SHEP-1细胞以2×10⁵个细胞/孔的密度接种到6孔板，在完全培养基中孵育过夜。加入5 μM、10 μM和20 μM浓度的LY303511 HCl，培养24小时；联合处理组在LY303511 HCl预处理后加入TRAIL（10 ng/mL），继续培养24小时。采用Annexin V-FITC/PI双染色和流式细胞术检测凋亡，Annexin V阳性细胞（无论PI染色结果）定义为凋亡细胞。细胞内H₂O₂水平检测：LY303511 HCl处理后，用H₂O₂特异性荧光探针负载细胞30分钟，通过流式细胞术分析荧光强度。蛋白质印迹分析：用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，提取蛋白并进行SDS-PAGE分离，膜上孵育抗磷酸化ERK1/2、磷酸化JNK、磷酸化p38、DR4、DR5、切割型caspase-8、切割型PARP和GAPDH（内参）的一抗，再加入二抗孵育，通过化学发光检测免疫反应条带[3]
- 癌细胞增殖及mTOR信号传导检测：将人类癌细胞系（A549、HCT116、MCF-7、PC-3、MiaPaCa-2）以5×10³个细胞/孔接种到96孔板，孵育过夜。将系列稀释的LY303511 HCl（1–40 μM）加入孔中，培养72小时。采用基于四唑盐还原的比色法评估细胞活力，在570 nm处测量吸光度，通过非线性回归拟合剂量-反应曲线计算IC₅₀值。mTOR信号传导分析：将细胞接种到6孔板（2×10⁵个细胞/孔），用LY303511 HCl（10 μM）处理24小时，按上述方法裂解细胞，采用蛋白质印迹法检测磷酸化p70S6K（Thr389）、磷酸化4E-BP1（Thr37/46）、总mTOR、p27Kip1和GAPDH的表达。siRNA实验：细胞转染mTOR特异性siRNA或 scramble siRNA（阴性对照），48小时后用LY303511 HCl（10 μM）处理，药物加入72小时后测量细胞活力，以评估mTOR在抗增殖效应中的作用[4]

在斑马鱼模型中，LY303511抑制CAL 27异种移植瘤的生长。因此，LY303511在体外和体内均显示出对口腔癌细胞的抗增殖潜力。https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31115172/

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将人前列腺腺癌（PC-3）细胞（ATCC CRL-1435）培养后，以1×10⁶个细胞/只的剂量接种于20% Matrigel基质胶中，通过皮下注射至无胸腺NCR裸鼠的侧腹部。接种后的裸鼠被分为四组，每组10只。当肿瘤体积达到约150 mm³时（n=35），开始给予载体或LY303511（10 mg/kg/天）治疗（第1天），并在指定时间点测量肿瘤体积，持续30天。[4]

[1]. Homotypic gap junctional communication associated with metastasis suppression increases with PKA activity and is unaffected by PI3K inhibition. Cancer Res. 2010 Dec 1;70(23):10002-11.

[2]. The phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor LY294002 potently blocks K(V) currents via a direct mechanism. FASEB J. 2003 Apr;17(6):720-2.

[3]. LY303511 enhances TRAIL sensitivity of SHEP-1 neuroblastoma cells via hydrogen peroxide-mediated mitogen-activated protein kinase activation and up-regulation of death receptors. Cancer Res. 2009 Mar 1;69(5):1941-50.

[4]. LY303511 (2-piperazinyl-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one) acts via phosphatidylinositol 3-kinase-independent pathways to inhibit cell proliferation via mammalian target of rapamycin (mTOR)- and non-mTOR-dependent mechanisms. J Pharmacol E. 2005 Sep;314(3):1134-43.

癌细胞间间隙连接通讯（GJIC）的丧失是恶性转化的常见特征。这种通讯由构成间隙连接功能单元的连接蛋白介导。连接蛋白在蛋白质水平上受到高度调控，磷酸化事件在其转运和降解中起着关键作用。转移抑制因子乳腺癌转移抑制因子1（BRMS1）上调GJIC并降低磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信号通路。基于这些观察结果，我们着手研究PI3K与GJIC在致瘤性和转移性细胞系中是否存在关联。用已知的PI3K抑制剂LY294002及其结构类似物LY303511（后者不抑制PI3K）处理细胞后，同型GJIC增加；然而，我们发现这种效应与PI3K/AKT抑制无关。我们在多种转移能力各异的癌细胞系中证实，无需强制表达连接蛋白基因即可恢复间隙连接细胞间通讯（GJIC）。此外，虽然连接蛋白43的水平保持不变，但我们观察到其从胞质溶胶重新定位至质膜。LY294002和LY303511均能增强蛋白激酶A（PKA）的活性。而且，使用小分子抑制剂H89阻断PKA后，LY294002/LY303511介导的GJIC增强作用减弱。综上所述，我们的研究结果表明，PKA活性与LY294002和LY303511通过不依赖于PI3K的机制介导的GJIC之间存在关联。调控这些信号通路可能对抗转移治疗有用。[1]

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我们最近报道，LY294002 (LY29) 和 LY303511 (LY30) 可使肿瘤细胞对药物诱导的细胞凋亡更加敏感，且该过程独立于磷脂酰肌醇3-激酶/Akt通路。在此，我们研究了LY30诱导人神经母细胞瘤细胞对TRAIL介导的细胞凋亡更加敏感的机制。我们提供的证据表明，LY30诱导的细胞内H₂O₂水平升高可通过激活丝裂原活化蛋白激酶上调SHEP-1细胞中TRAIL受体（DR4和DR5）的表达，从而显著增强TRAIL介导的caspase-8加工和活性、细胞色素c胞质转位以及细胞死亡。阻断DR4和/或DR5的抗体能够抑制LY30诱导的TRAIL敏感性，进一步证实了死亡受体的参与。SP600125和PD98059分别通过药理学抑制c-Jun氨基末端激酶（JNK）和细胞外信号调节激酶（ERK）的激活，阻断了LY30诱导的TRAIL介导的细胞死亡敏感性的增加。最后，通过小干扰RNA介导的JNK和ERK基因沉默分别抑制了LY30诱导的DR4和DR5表面表达的增加。这些数据表明，JNK和ERK是LY30诱导的肿瘤细胞TRAIL敏感性增加过程中两个关键的参与者，并强调了这种LY29非活性类似物的新作用机制。我们的研究结果可能对LY30及类似化合物在增强神经母细胞瘤细胞凋亡敏感性方面的应用具有重要意义，这些细胞通常对化疗产生耐药性。[3]哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它部分通过激活p70 S6激酶（S6K）来调节细胞生长和增殖。雷帕霉素是一种抗肿瘤药物，它与FKBP12形成复合物后，通过与mTOR的FKBP12-雷帕霉素结合域相互作用，特异性抑制mTOR，从而导致G1期细胞周期阻滞。然而，癌细胞通常会对雷帕霉素产生耐药性，因此需要寻找其他mTOR抑制剂。 2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮 (LY294002) 可阻断 mTOR 激酶活性，但同时也会抑制磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K)，而 PI3K 是一种调节除细胞增殖以外的其他细胞功能的酶。我们假设其结构类似物 2-哌嗪基-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮 (LY303511) 可能在不影响 PI3K 的情况下抑制 mTOR 依赖性细胞增殖。在人肺上皮腺癌 (A549) 细胞中，LY303511 与雷帕霉素类似，可抑制 mTOR 依赖性 S6K 磷酸化，但不抑制 PI3K 依赖性 Akt 磷酸化。 LY303511抑制了A549细胞以及原代肺动脉平滑肌细胞的增殖，且不诱导细胞凋亡。与雷帕霉素不同，LY303511降低了A549细胞中G2/M期细胞周期的进展以及G2/M期特异性细胞周期蛋白的表达。与另一种mTOR非依赖性激酶靶点相一致，LY303511抑制了酪蛋白激酶2（一种已知的G1期和G2/M期细胞周期调节因子）的活性。除了体外抗增殖作用外，LY303511还能抑制裸鼠体内人前列腺腺癌肿瘤移植瘤的生长。鉴于LY303511可通过mTOR依赖性和非依赖性机制抑制细胞增殖，其具有不依赖于PI3K抑制的抗肿瘤治疗潜力。[4]

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LY303511 HCl是LY303511的盐酸盐形式，其化学结构为2-哌嗪基-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮盐酸盐。[4]
- 与LY294002等经典PI3K抑制剂不同，LY303511 HCl的药理作用（包括抗增殖和TRAIL增敏作用）不依赖于PI3K抑制，这使其区别于其他PI3K/mTOR通路调节剂。[4]
- LY303511 HCl增强SHEP-1神经母细胞瘤细胞对TRAIL的敏感性是通过反应性T细胞介导的。活性氧（ROS，特别是H₂O₂）的生成会触发MAPK通路激活，并随后上调促凋亡死亡受体DR4和DR5[3]
-LY303511 HCl在癌细胞中发挥双重抗增殖机制：1）mTOR依赖性抑制蛋白质合成（通过抑制p70S6K和4E-BP1磷酸化）；2）mTOR非依赖性上调p27Kip1，p27Kip1是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，可诱导细胞周期阻滞[4]

C₁₉H₁₉CLN₂O₂

342.82

342.113

C, 74.49; H, 5.92; N, 9.14; O, 10.44

2070014-90-1

LY 303511;154447-38-8; 854127-90-5 (2HCl); 2070014-90-1 (HCl)

78357796

White to light yellow solid

41.6

2

4

2

24

464

0

Cl.O1C2C(=CC=CC=2C(C=C1N1CCNCC1)=O)C1C=CC=CC=1

QGVSIVYHHKLHPY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H18N2O2.ClH/c22-17-13-18(21-11-9-20-10-12-21)23-19-15(7-4-8-16(17)19)14-5-2-1-3-6-14;/h1-8,13,20H,9-12H2;1H

8-phenyl-2-piperazin-1-ylchromen-4-one;hydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。