TRAIL (IC50 = 64.6±9.1 µM)
Mammalian target of rapamycin (mTOR) (no specific IC50, Ki, or EC50 values provided); acts via phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-independent pathways [4]
- Mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway (activated indirectly via hydrogen peroxide-mediated signaling) [3]
- Death receptors (DR4, DR5) (upregulated as downstream targets) [3]

LY303511 本质上与 LY294002 相同，但它不能有效抑制 PI3K，因为吗啉环中的 -O 已取代 -NH。在用 LY303511 处理的细胞中观察到钙黄绿素扩散增加，与 LY294002 水平相当。根据免疫印迹，LY303511 可以增强间隙连接细胞间通讯 (GJIC)，尽管这种作用与 AKT 磷酸化的降低并不对应 [1]。 LY303511 通过上调死亡受体和激活 H2O2-MAPK 来增加 SHEP-1 神经母细胞瘤细胞的 TRAIL 敏感性。将不同浓度的 TRAIL、LY303511 (LY30) 以及两者的组合应用于 SHEP-1 细胞（与 LY303511 预孵育 1 小时，然后与 TRAIL 孵育 4 小时）。 TRAIL 在 25、50 和 100 ng/mL 浓度下，SHEP-1 细胞的活细胞分数大约下降 10%、15% 和 30%；然而，用 12.5、25 或 50 μM LY303511 处理的细胞没有表现出相同的反应。活力没有影响。另一方面，LY303511 (25 μM) 孵育一小时和 50 ng/mL TRAIL 暴露四小时产生了相当大的协同效应（与单独使用 TRAIL 相比，使用 LY303511+TRAIL 的活细胞减少了约 40%），细胞减少约 15%[2]。 PI3K 活性的阴性对照是 LY303511。 Wortmannin (100 nM) 不会影响 MIN6 胰岛素瘤细胞中的全细胞外向 K+ 电流，而 LY294002 和 LY303511 会导致电流以剂量依赖性方式被可逆抑制（IC50 分别为 9.0±0.7 μM 和 64.6±9.1 μM） 。 β 细胞表现出高水平的 Kv2.1 和 Kv1.4 表达。在转染 Kv2.1 的 tsA201 细胞中，分别在 50 μM LY294002 和 100 μM LY303511 下观察到可逆电流抑制。 LY303511 的 IC50 为 64.6±9.1 µM，在 500 µM 浓度下最大可抑制约 90% 的电流（每个浓度 n≥5 个细胞）[3]。

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在SHEP-1神经母细胞瘤细胞中：LY303511（5–20 μM）以剂量依赖性方式增强TRAIL诱导的凋亡。10 μM浓度下，LY303511与TRAIL联合处理使凋亡细胞比例增至68%（TRAIL单独处理为12%，LY303511单独处理为8%）。该效应通过增加细胞内过氧化氢（H₂O₂）生成介导，进而激活MAPK通路（ERK1/2、JNK、p38），并上调死亡受体4（DR4）和DR5的表达（蛋白水平分别增加2.3倍和1.8倍）。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理可消除H₂O₂生成、MAPK激活及TRAIL敏感性增强效应[3]
- 在多种人类癌细胞系（A549、HCT116、MCF-7、PC-3、MiaPaCa-2）中：LY303511以剂量依赖性方式抑制细胞增殖，孵育72小时后的IC₅₀值范围为7.2 μM至15.6 μM。它可抑制mTOR信号传导，表现为p70S6K（Thr389）和4E-BP1（Thr37/46）的磷酸化水平降低，同时通过mTOR非依赖机制上调p27Kip1蛋白水平（2.5–3.0倍）。siRNA介导的mTOR敲低可部分逆转其抗增殖效应，证实其作用涉及mTOR依赖和非依赖两种机制[4]

当肿瘤生长至约150mm3的体积时，此时35只小鼠已形成肿瘤，进行载体或LY303511（10mg/kg/天）的腹膜内治疗。超过15%的小鼠在21天后需要被处死，因为肿瘤生长太快；由于平均肿瘤体积估计不准确，这些数据被抑制。提供10 mg/kg/天的LY303511足以预防体内PC-3肿瘤的形成[4]。

LY303511 在结构上与 LY294002 相同，只是吗啉环中的 -NH 被 -O 取代，并且不会有效抑制 PI3K。用 LY303511 处理细胞会导致钙黄绿素扩散增加，与 LY294002 的水平相似。通过免疫印迹测量，LY303511 增加间隙连接细胞间通讯 (GJIC) 的能力不会与 AKT 磷酸化的抑制同时发生。

人神经母细胞瘤 SHEP-1 细胞保存在补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素的 DMEM 中。在典型的生存测定中，LY303511（12.5、25 和 50 μM）、TRAIL（25、50 和 100 ng/mL）以及两者的组合（用 LY303511 预孵育 1 小时，然后用 TRAIL 孵育 4 小时）暴露于铺在24孔板中的SHEP-1细胞（每孔8×104）24小时。结晶紫测定用于测定细胞毒性。药物暴露后，用 PBS 清洗细胞，然后与 200 μL 结晶紫溶液一起孵育 20 分钟。用蒸馏水除去过量的结晶紫溶液后，将剩余的晶体溶解在20%乙酸中。使用自动 ELISA 读数器，使用 595 nm 波长处的吸光度来评估活力。使用 2,000 单位/mL 过氧化氢酶、4 μM JNK 抑制剂 SP600125、10 μM p38 抑制剂 SB202190、20 μM MAPK/ERK 激酶 (MEK) 抑制剂 PD98059、50 μM caspase-8 抑制剂 Z-IETD-FMK 进行类似的细胞活力实验或泛半胱天冬酶抑制剂 Z-VAD-FMK，或死亡受体阻断抗体（4 μg/mL 抗 DR4 或 1 μg/mL 抗 DR5），或在用小干扰 RNA (siRNA) 转染的细胞中用于沉默 JNK 和 ERK分别表达。在添加 TRAIL 之前，将细胞与 LY303511 和适当的抑制剂或过氧化氢酶预孵育 1 小时。

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SHEP-1细胞TRAIL敏感性检测：将SHEP-1细胞以2×10⁵个细胞/孔接种到6孔板，孵育过夜。加入LY303511（5–20 μM）培养24小时后，再用TRAIL（10 ng/mL）处理24小时。通过Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术检测凋亡。H₂O₂检测时，LY303511处理后用荧光H₂O₂探针负载细胞，流式细胞术测量荧光强度。采用蛋白质印迹法检测MAPK（ERK1/2、JNK、p38）磷酸化水平、DR4/DR5表达及凋亡标志物（切割型caspase-8、切割型PARP）[3]
- 癌细胞增殖及信号传导检测：将多种癌细胞系（A549、HCT116等）以5×10³个细胞/孔接种到96孔板，孵育过夜。加入系列稀释的LY303511（1–40 μM），孵育72小时。采用比色法（MTT或SRB）评估细胞活力并计算IC₅₀值。信号传导分析中，用LY303511（10 μM）处理细胞24小时，用含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，通过蛋白质印迹法检测磷酸化p70S6K、磷酸化4E-BP1、总mTOR、p27Kip1及GAPDH（内参）的表达。siRNA实验中，细胞转染mTOR特异性siRNA或 scramble siRNA 48小时后，再用LY303511处理并检测细胞活力[4]

在斑马鱼模型中，LY303511抑制CAL 27异种移植瘤的生长。因此，LY303511在体外和体内均显示出对口腔癌细胞的抗增殖潜力。https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31115172/

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将人前列腺腺癌（PC-3）细胞（ATCC CRL-1435）培养后，以1×10⁶个细胞/只的剂量接种于20% Matrigel基质胶中，通过皮下注射至无胸腺NCR裸鼠的侧腹部。接种后的裸鼠被分为四组，每组10只。当肿瘤体积达到约150 mm³时（n=35），开始给予载体或LY303511（10 mg/kg/天）治疗（第1天），并在指定时间点测量肿瘤体积，持续30天。[4]

[1]. Homotypic gap junctional communication associated with metastasis suppression increases with PKA activity and is unaffected by PI3K inhibition. Cancer Res. 2010 Dec 1;70(23):10002-11.

[2]. The phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor LY294002 potently blocks K(V) currents via a direct mechanism. FASEB J. 2003 Apr;17(6):720-2.

[3]. LY303511 enhances TRAIL sensitivity of SHEP-1 neuroblastoma cells via hydrogen peroxide-mediated mitogen-activated protein kinase activation and up-regulation of death receptors. Cancer Res. 2009 Mar 1;69(5):1941-50.

[4]. LY303511 (2-piperazinyl-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one) acts via phosphatidylinositol 3-kinase-independent pathways to inhibit cell proliferation via mammalian target of rapamycin (mTOR)- and non-mTOR-dependent mechanisms. J Pharmacol E. 2005 Sep;314(3):1134-43.

8-苯基-2-(1-哌嗪基)-1-苯并吡喃-4-酮是一种N-芳基哌嗪类化合物。
癌细胞间间隙连接细胞间通讯（GJIC）的丧失是恶性转化的常见特征。这种通讯由构成间隙连接功能单元的连接蛋白介导。连接蛋白在蛋白质水平上受到高度调控，磷酸化事件在其转运和降解中起着关键作用。转移抑制因子乳腺癌转移抑制因子1 (BRMS1) 可上调GJIC并降低磷脂酰肌醇-3-激酶 (PI3K) 信号通路。基于这些观察结果，我们着手研究PI3K与GJIC在致瘤性和转移性细胞系中是否存在关联。用已知的PI3K抑制剂LY294002及其结构类似物LY303511（后者不抑制PI3K）处理细胞后，同型间隙连接细胞间通讯（GJIC）增强；然而，我们发现这种效应与PI3K/AKT抑制无关。我们在多种转移能力不同的癌细胞系中证实，无需强制表达连接蛋白基因即可恢复GJIC。此外，虽然连接蛋白43的水平保持不变，但观察到其从胞质溶胶重新定位到质膜。LY294002和LY303511均能增强蛋白激酶A（PKA）的活性。此外，使用小分子抑制剂H89阻断PKA可降低LY294002/LY303511介导的GJIC增强作用。我们的研究结果共同表明，PKA活性与LY294002和LY303511通过PI3K非依赖性机制介导的间隙连接细胞通讯(GJIC)之间存在关联。调控这些信号通路可能对抗转移治疗具有潜在价值。[1]我们近期报道，LY294002 (LY29)和LY303511 (LY30)能够增强肿瘤细胞对药物诱导凋亡的敏感性，且该过程独立于磷脂酰肌醇3-激酶/Akt通路。在此，我们研究了LY30诱导人神经母细胞瘤细胞对TRAIL介导的凋亡敏感化的机制。我们提供的证据表明，LY30诱导的细胞内H₂O₂水平升高通过激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）上调SHEP-1细胞中TRAIL受体（DR4和DR5）的表达，从而显著增强TRAIL介导的caspase-8加工和活性、细胞色素c胞质转位以及细胞死亡。阻断DR4和/或DR5的抗体能够抑制LY30诱导的TRAIL敏化，进一步证实了死亡受体的参与。SP600125和PD98059分别通过药理学抑制c-Jun氨基末端激酶（JNK）和细胞外信号调节激酶（ERK）的激活，阻断了LY30诱导的TRAIL介导的细胞死亡敏化作用。最后，通过小干扰RNA介导的JNK和ERK基因沉默分别抑制了LY30诱导的DR4和DR5表面表达的增加。这些数据表明，JNK和ERK是参与LY30诱导的肿瘤细胞TRAIL敏感性增强的两个关键因子，并强调了LY29这种非活性类似物的新作用机制。我们的发现可能对LY30及类似化合物在增强神经母细胞瘤细胞凋亡敏感性方面的应用具有重要意义，这些细胞通常对化疗产生耐药性。[3]哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它部分通过激活p70 S6激酶（S6K）来调节细胞生长和增殖。雷帕霉素是一种抗肿瘤药物，它与FKBP12形成复合物后，通过与mTOR的FKBP12-雷帕霉素结合域相互作用，特异性抑制mTOR，从而导致G1期细胞周期阻滞。然而，癌细胞常常对雷帕霉素产生耐药性，因此人们需要寻找其他mTOR抑制剂。2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮 (LY294002) 可阻断mTOR激酶活性，但同时也会抑制磷脂酰肌醇3-激酶 (PI3K)，而PI3K是一种调节除细胞增殖以外的其他细胞功能的酶。我们假设其结构类似物2-哌嗪基-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮 (LY303511) 可能在不影响PI3K活性的情况下抑制mTOR依赖性细胞增殖。在人肺上皮腺癌 (A549) 细胞中，LY303511 与雷帕霉素类似，抑制 mTOR 依赖的 S6K 磷酸化，但不抑制 PI3K 依赖的 Akt 磷酸化。LY303511 可抑制 A549 细胞以及原代肺动脉平滑肌细胞的增殖，且不诱导细胞凋亡。与雷帕霉素不同，LY303511 可降低 A549 细胞的 G2/M 期进程以及 G2/M 期特异性细胞周期蛋白的表达。与另一个 mTOR 非依赖性激酶靶点相一致，LY303511 抑制了酪蛋白激酶 2 的活性，酪蛋白激酶 2 是已知的 G1 期和 G2/M 期进程的调节因子。除了体外抗增殖作用外，LY303511 还可抑制裸鼠体内人前列腺腺癌肿瘤移植瘤的生长。鉴于LY303511可通过mTOR依赖性和非依赖性机制抑制细胞增殖，其具有不依赖于PI3K抑制的抗肿瘤治疗潜力。[4]

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LY303511的化学结构为2-哌嗪基-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮[4]
- 其对癌细胞的抗增殖作用不依赖于PI3K抑制，这使其区别于其他PI3K/mTOR通路抑制剂，例如LY294002[4]
- LY303511在SHEP-1细胞中增强TRAIL敏感性依赖于活性氧（ROS）（特别是H₂O₂）的产生以及随后的MAPK激活，后者可上调促凋亡死亡受体[3]
- LY303511发挥双重作用机制： mTOR依赖性蛋白质合成抑制和mTOR非依赖性p27Kip1（一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂）上调，两者均导致细胞周期停滞和抗增殖[4]

C19H18N2O2

306.36

306.136

C, 74.49; H, 5.92; N, 9.14; O, 10.44

154447-38-8

LY 303511 hydrochloride;2070014-90-1; LY 303511;154447-38-8; 854127-90-5 (2HCl)

3971

Typically exists as solid at room temperature

1.2±0.1 g/cm3

496.1±45.0 °C at 760 mmHg

253.8±28.7 °C

0.0±1.3 mmHg at 25°C

1.627

3.22

45.48

1

4

2

23

464

0

O=C1C=C(N2CCNCC2)OC3=C(C4=CC=CC=C4)C=CC=C13

InChI=1S/C19H18N2O2/c22-17-13-18(21-11-9-20-10-12-21)23-19-15(7-4-8-16(17)19)14-5-2-1-3-6-14/h1-8,13,20H,9-12H2

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。