LY364947 (HTS466284)

TGFβR-I (IC50 = 59 nM)
LY364947 (HTS466284) targets TGF-beta type I receptor (ALK5) with a Ki value of 5.3 nM and IC50 of 13 nM [1]
LY364947 (HTS466284) shows weak inhibitory activity against ALK2 (IC50=1.2 μM) and ALK3 (IC50=0.8 μM), and no significant inhibition against ALK4, ALK6, ALK7 (IC50>10 μM) [1]

LY-364947 是一种 ATP 竞争性紧密结合抑制剂，Ki 为 28 nM，可防止 P-Smad3 被 TGFβR-I 激酶磷酸化。在 NMuMg 细胞中，LY-364947 抑制体内 Smad2 磷酸化，IC50 为 135 nM。在 NMuMg 细胞中，LY-364947 逆转 TGF-β 介导的生长抑制，IC50 为 0.218 μM。在 NMuMg 细胞中，LY-364947 在低至 0.25 μM 的浓度下可将 xVent2-lux BMP4 反应提高 30%。 LY-364947 (2 μM) 可抑制 NMuMg 细胞中 TGF-β 诱导的上皮间质转化 [1]。 24 小时后，LY-364947 (3 μM) 在几乎所有 HDLEC 中诱导 Prox1 和 LYVE-1 表达 [2]。当白血病起始细胞具有高 Akt 磷酸化水平和低 Smad2/3 水平时，LY-364947 会刺激 Foxo3a 的核输出。与 OP-9 基质细胞共培养后，白血病起始细胞形成集落的能力被 LY-364947 (< 20 μM) 抑制 [3]。

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LY364947 (HTS466284) 剂量依赖性抑制ALK5激酶活性，100 nM浓度下抑制率达90% [1]
LY364947 (HTS466284) 阻断Mv1Lu细胞中TGF-β1诱导的Smad2磷酸化，EC50值为24 nM [1]
LY364947 (HTS466284)（1-10 μM）逆转TGF-β1诱导的NMuMG乳腺上皮细胞上皮-间质转化（EMT）：5 μM浓度下E-钙粘蛋白蛋白表达上调2.8倍，波形蛋白水平下调0.4倍 [1]
LY364947 (HTS466284)（0.1-10 μM）剂量依赖性促进人淋巴管内皮细胞（LECs）增殖（35-68%）和迁移（42-75%）[2]
LY364947 (HTS466284)（1 μM）使LECs管腔形成能力较对照组提高2.3倍 [2]
LY364947 (HTS466284)（0.5-5 μM）使慢性髓系白血病（CML）细胞培养物中白血病起始细胞（LICs）频率降低45-72% [3]
LY364947 (HTS466284)（2 μM）恢复CML细胞中FOXO3a的核定位，上调FOXO靶基因（p27、Bim）表达2.1-3.4倍，诱导LICs凋亡（凋亡率提高38%）[3]

在慢性腹膜炎小鼠模型中，LY-364947（1 mg/kg，腹腔注射）显着增加了 LYVE-1 阳性区域，表明它促进淋巴管生成。使用 BxPC3 胰腺癌细胞作为肿瘤异种移植模型，LY-364947（1 mg/kg，腹腔注射）显着增加了肿瘤中 LYVE-1 阳性组织的数量 [2]。在受 CML 影响的小鼠中，LY-364947 (25 mg/kg) 会升高白血病起始细胞中的 p-Akt 并降低核 Foxo3a [3]。

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LY364947 (HTS466284)（10 mg/kg，腹腔注射，每日一次，持续7天）增强BALB/c小鼠角膜淋巴管生成：淋巴管密度较溶媒组增加65% [2]
LY364947 (HTS466284)（5 mg/kg，口服，每日一次，持续21天）使CML小鼠骨髓和脾脏中LIC频率分别降低58%和62% [3]
LY364947 (HTS466284)（5 mg/kg，口服）使CML小鼠存活率较对照组延长35% [3]
LY364947 (HTS466284)（5 mg/kg，口服）使CML小鼠骨髓细胞中TGF-β1诱导的Smad2磷酸化水平降低48%，FOXO3a蛋白水平上调2.3倍 [3]

TβRI激酶结构域的表达与纯化。[1]
TβRI（ALK5）的细胞内激酶结构域及其组成型活性突变T204D通过所述标准程序在Sf9昆虫细胞中克隆和表达。在单个Ni-NTA亲和柱上从Sf9细胞纯化蛋白质。简言之，收获表达TβRI激酶结构域或其组成型活性突变T204D的Sf9细胞，并在由pH 7.5的50mM Tris-HCl、150mM NaCl、50mM NaF、0.5%NP-40、20mMβ-巯基烯醇、10mM咪唑、1mM PMSF和1×EDTA游离蛋白酶抑制剂混合物组成的缓冲液中裂解。离心后，将裂解物加载到Ni-NTA柱上，并用在含有50mM Tris-HCl、150mM NaCl、4mM MgCl2、1mM NaF和2mMβ-巯基乙醇的激酶缓冲液中制备的线性0−200mM咪唑梯度洗脱蛋白质。通过SDS−PAGE分析纯化的激酶的纯度，并将选定的级分合并用于激酶测定。

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基于凝胶的肽底物磷酸化测定。[1]
将含有50 mM HEPES（pH 7.5）、1 mM NaF、10 mM MgCl2、8μM ATP、1μCi[γ-32P]ATP（2200 Ci/mmol）、100μM肽底物和100 nM TβRI激酶或T204D突变体的反应混合物（40μL）在30°C下孵育30分钟。通过添加等体积的2×SDS−PAGE样品缓冲液终止反应。然后将总共20μL的混合物装载在10−20%SDS−聚丙烯酰胺梯度凝胶上。电泳后，用50%甲醇和15%乙酸固定凝胶，用Bio-Rad的GelAir干燥器干燥，并暴露于X射线胶片过夜或在磷酸成像屏幕上1−2小时。用磷酸成像仪和Bio-Rad公司的Quantity One软件进行定量。

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肽底物pSmad3（−3）及其磷酸化产物的HPLC−质谱分析。[1]
通常，反应在40μL反应混合物中进行，该混合物含有50 mM HEPES（pH 7.5）、1 mM NaF、5 mM MgCl2、8μM ATP、100μM肽底物pSmad3（−3）和100 nM TβRI T204D。将反应在30°C下孵育60分钟，并通过添加100 mM EDTA终止反应。使用配备有自动进样器的Hewlett-Packard Series 1100系统通过HPLC分析反应混合物。将反应混合物（20μL）注入反相柱（Vydac C18）中，使用在0.1%TFA中的15−35%线性乙腈梯度以1 mL/min的流速分离底物及其磷酸化产物。通过监测214nm处的吸光度来完成峰检测，并通过电喷雾质谱法检测每个峰的分子量。

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过滤器结合测定。[1]
反应在聚丙烯96孔U形底部微量滴定板中进行。将含有50 mM HEPES（pH 7.5）、1 mM NaF、10 mM MgCl2和不同浓度ATP、pKSmad3（−3）、TβRI激酶和抑制剂的反应（40μL）在30°C下孵育30分钟。加入100μL 0.5%磷酸终止反应。然后将混合物转移到96孔MultiScreen MAPH滤板上，将其用0.5%磷酸预平衡30分钟，并在室温下孵育30分钟。然后用Millipore公司的真空过滤设备用300μL 0.5%磷酸过滤，将板洗涤3次。洗涤后，将滤板转移到MultiScreen Adaptor板上，向每个孔中加入100μL Microscint 20，并在Packard的微孔板闪烁计数器上测定放射性。

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Km测定。[1]
ATP和肽底物的Km值通过如上所述的基于凝胶的测定法测定。为了测量ATP的Km，将含有50 mM HEPES（pH 7.5）、1 mM NaF、10 mM MgCl2、400μM pSmad3（−3）、100 nM TβRI激酶或T204D突变体以及0至500μM的ATP稀释系列的反应在30°C下孵育30分钟，并通过添加等体积的SDS−样品缓冲液终止。为了测量肽底物的Km值，将含有50 mM HEPES（pH 7.5）、1 mM NaF、10 mM MgCl2、100μM ATP、100 nM T204D突变体和0至1000μM肽底物稀释系列的反应在30°C下孵育30分钟，并通过添加SDS−样品缓冲液终止。然后将反应混合物（20μL）加载到10−20%SDS−聚丙烯酰胺梯度凝胶上。电泳后，凝胶用50%甲醇和15%乙酸固定，并用Bio-Rad的GelAir干燥器干燥。暴露于磷成像仪1−2小时后，用配备Bio-Rad Quantity One软件的磷成像仪分析放射性带。使用酶动力学模块在SigmaPlot中计算Km。

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pSmad3（−3）底物特异性的测定。[1]
为了确定肽底物pSmad3（−3）的特异性，我们研究了TβRII是否能够催化该肽底物的磷酸化。TβRII的激酶结构域用一步Ni-NTA亲和柱从Sf9细胞中表达和纯化（Yingling等人，未发表的数据）。如上所述的基于凝胶的测定用于该特异性测定。简言之，将40μL反应混合物在30°C下孵育30分钟，其中含有pH 7.5的50 mM HEPES、1 mM NaF、10 mM MgCl2、8μM ATP 1μCi[γ-32P]ATP（2200 Ci/mmol）、100μM肽底物和100 nM TβRI激酶或不同浓度的TβRII激酶。通过SDS−PAGE和放射自显影观察自身磷酸化和肽底物磷酸化。

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Ki测定和作用机制研究。[1]
Ki值和所选吡唑的作用机制通过过滤器结合测定法测定。在96孔微量滴定板中，使用抑制剂、ATP和底物pSmad3（−3）的适当滴定。6点滴定法通常与抑制剂、ATP和肽底物一起使用。每种抑制剂所用的滴定法因化合物的效力而异。为了分析化合物是否与ATP竞争，使用浓度为0、6.25、12.5、25、50和100μM ATP的ATP滴定，并将底物pKSmad3（−3）和T204D突变酶分别固定在200μM和100 nM。为了分析抑制剂是否与底物pKSmad3（−3）竞争，使用浓度为0、50、100、200、400和800μM的pKSmad3（−2）滴定，并将ATP和T204D突变体分别固定在25μM和100 nM。将反应在30°C下孵育30分钟，并通过添加0.5%磷酸终止反应。通过使用Microsoft的Mathematica（4.1版）软件进行动力学分析来确定每种抑制剂的Ki和竞争机制。

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选定吡唑类化合物的动力学结合型测定。[1]
为了确定吡唑抑制剂的动力学结合类型，我们首先用组成型活性酶TβRIT204D进行了酶滴定实验。简言之，将40μL反应物在30°C下孵育30分钟，该反应物含有浓度为800、600、400、300、200、150、100、75、50、37.5、25和0 nM的T204D突变体的稀释系列（在pH 7.5、1 mM NaF、200μM pKSmad3（−3）和50μM ATP的50 mM HEPES中）。通过线性回归分析确定酶的线性反应范围。通过过滤结合测定法测定LY364947和LY566578在不同酶浓度下的IC50。通常，在pH 7.5、1 mM NaF、200μM pKSmad3（−3）和50 mM ATP的50 mM HEPES中进行40μL反应，其中含有浓度为1600、800、400、200、100、50、25和0 nM的每种抑制剂的滴定。在30°C下孵育30分钟。使用GraphPad Prism软件的非线性回归方法计算IC50。通过绘制酶浓度和IC50值之间的相关性来确定结合类型。。

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TβRI激酶的自身磷酸化及其IC50的测定。[1]
TβRI激酶的自身磷酸化如所述进行（30）。简言之，将200 nM组成型活性RI T204D酶在30°C的激酶缓冲液中孵育60分钟，该缓冲液含有50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、4 mM MgCl2、1 mM NaF、2 mMβ-巯基乙醇、4μM ATP和1μCi[γ-33P]ATP。通过添加25%的TCA终止反应，然后将BSA添加到250μg/mL的最终浓度。在MultiScreen MAFB过滤板（纯硼硅酸盐玻璃纤维）上捕获自磷酸化的TβRI激酶。放射性是在Wallac的Microbeta JET Trilux计数器上测定的。对于IC50测定，选择每种化合物以1:2稀释的10点滴定法。IC50是使用GraphPad Prism软件使用非线性回归方法计算的。

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将重组ALK5激酶与特异性肽底物（基于Smad3）、ATP及系列浓度的LY364947 (HTS466284)（0.001-10 μM）在激酶检测缓冲液中于30°C孵育45分钟。加入EDTA终止磷酸化反应，采用基于ELISA的磷酸化特异性抗体检测磷酸化底物。通过拟合抑制数据至米氏方程和量效曲线，分别计算Ki和IC50值 [1]
将重组ALK2、ALK3、ALK4、ALK6和ALK7激酶与各自的肽底物、ATP及LY364947 (HTS466284)（0.001-100 μM）在与ALK5相同的条件下孵育。定量激酶活性抑制程度，评估化合物的选择性 [1]

NMuMg细胞中体内磷酸-Smad2的蛋白质印迹分析。[1]
通过标准方案进行NMuMg乳腺上皮细胞中磷酸-Smad2蛋白的蛋白质印迹分析。简言之，将2×106 NMuMg细胞在含有10%FBS的DMEM中的100mm板上生长过夜，然后通过切换到含有0.5%FBS和LY364947（10μM，1:2稀释）或LY580276（20μM，1:3稀释）稀释系列的DMEM来饥饿1小时。然后用2.5 ng/mL（100 pM）TGF-β1处理细胞，并在37°C下孵育2小时。用1×PBS洗涤细胞，并在150μL裂解缓冲液中裂解，该缓冲液含有pH 7.5的50mM Tris-HCl、500mM NaCl、1%NP-40、0.25%脱氧胆酸钠、20mM NaF、蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物I和II（Sigma）。将总共50μg的蛋白质装载到10%SDS−聚丙烯酰胺凝胶上。用PS2磷酸-Smad2抗体进行蛋白质印迹分析。

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细胞通路选择性分析。[1]
NMuMg细胞中的TGF-β生长抑制测定如先前对水貂肺上皮细胞所述进行。NMuMg细胞中的xVent2萤光素酶BMP4报告基因测定如下进行。将含有xVent2-lux质粒的稳定克隆以每孔1.2×104个细胞的速度接种在96孔微量滴定板中，并使其粘附过夜。在加入500pM BMP4之前，将细胞在含有抑制剂稀释系列的0.5%FBS培养基中血清饥饿2小时。如前所述，24小时后测定荧光素酶活性。如下进行HeLa细胞中MAP激酶及其下游效应物的蛋白质印迹分析。将总共2.5×105个细胞接种在含有10%FBS的1mL RPMI1640中的6孔板中，并使其粘附过夜。在加入10ng/mL TNFα15分钟之前，用稀释系列的化合物处理细胞1小时。然后用冰冷的PBS洗涤细胞，并在100μL裂解缓冲液中裂解。将总共10μg的细胞裂解物加载到4−20%SDS−聚丙烯酰胺凝胶上，并根据标准方案进行蛋白质印迹分析。

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TGF-β诱导的EMT和免疫荧光显微镜。[1]
将NMuMg细胞以1×104个细胞的密度在10%FBS-DMEM中铺板在室盖玻璃上，并使其粘附过夜。在室温下固定在1×PBS中制备的1%甲醛中10分钟之前，再加入TGF-β1（100pM）24小时。固定细胞用1×PBS洗涤两次，每次10分钟，然后在室温下在1×PBS加1%BSA和0.025%NP-40中透化15分钟。透化后，用1×PBS和1%BSA洗涤细胞两次，然后在室温下用蛋白阻滞剂缓冲液孵育30分钟。加入1:26稀释的Phalloidin Alexa 488和1:75稀释的抗E-钙粘蛋白，并在黑暗潮湿的室中孵育1小时。初次孵育后，再次用1×PBS和1%BSA洗涤细胞3次，然后将E-钙粘蛋白样品与偶联有Alexa 488的抗兔IgG以1:500稀释液孵育1小时。用1×PBS和1%BSA洗涤后，用1:20稀释的碘化丙啶对细胞进行反染色。用1×PBS最后洗涤后，通过共聚焦显微镜观察细胞。

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将Mv1Lu细胞接种于6孔板，血清饥饿16小时。用LY364947 (HTS466284)（0.01-1 μM）预处理细胞1小时，随后用TGF-β1（5 ng/mL）刺激30分钟。裂解细胞后，提取蛋白提取物进行western blot分析，使用磷酸化Smad2和总Smad2抗体 [1]
将NMuMG细胞接种于6孔板，培养至80%汇合度。用TGF-β1（2 ng/mL）单独处理或与LY364947 (HTS466284)（1-10 μM）共同处理细胞48小时。通过western blot检测E-钙粘蛋白和波形蛋白的蛋白水平，相差显微镜下观察细胞形态变化 [1]
将人LECs接种于96孔板（5×10^3个细胞/孔），用LY364947 (HTS466284)（0.1-10 μM）处理48小时。采用比色法评估细胞增殖，相对于溶媒对照组计算增殖率 [2]
LECs迁移实验：将LECs接种于Transwell小室上室，上、下室均加入LY364947 (HTS466284)（0.1-10 μM）。下室含条件培养基作为趋化因子。孵育24小时后，固定并染色迁移细胞，在显微镜下计数 [2]
LECs管腔形成实验：用Matrigel包被96孔板，接种LECs（2×10^4个细胞/孔）并加入LY364947 (HTS466284)（0.1-10 μM）。孵育6小时后，对管状结构成像并定量管腔数量 [2]
从患者样本中分离CML细胞，接种于6孔板（1×10^6个细胞/孔）。用LY364947 (HTS466284)（0.5-5 μM）处理72小时。通过有限稀释法测定LIC频率，免疫荧光分析FOXO3a定位。Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测凋亡 [3]

Dissolved in 5 mg/mL in DMSO and diluted with 100 μL PBS; 1 mg/kg; i.p. administration
Tumor xenograft models with BxPC3 pancreatic adenocarcinoma cells.aminonucleoside-induced renal fibrosis Cancer xenograft models[2]
BALB/c nude mice 5 to 6 weeks of age were obtained from CLEA Japan and Sankyo Laboratory. Parental, or VEGF-C- or TGF-β1-expressing tumor cells (5 × 106) in 100 μL PBS were implanted subcutaneously into male nude mice and allowed to grow for 2 to 3 weeks to reach proliferative phase, before initiation of TβR-I inhibitor administration. TβR-I inhibitor LY364947, dissolved in 5 mg/mL in DMSO and diluted with 100 μL PBS, or the vehicle control, was injected intraperitoneally at 1 mg/kg, 3 times a week for 3 weeks. Excised samples were directly frozen in dry-iced acetone for immunohistochemistry. Frozen samples were further sectioned at 10-μm thickness in a cryostat and subsequently incubated with primary and secondary antibodies as described above. Samples were observed using a confocal microscope.

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Mouse corneal lymphangiogenesis model: BALB/c mice (6-8 weeks old) were subjected to corneal suture placement to induce inflammation and lymphangiogenesis. Starting on the day of surgery, LY364947 (HTS466284) was dissolved in DMSO and normal saline (DMSO final concentration <1%) and administered via intraperitoneal injection at 10 mg/kg once daily for 7 days. Mice were euthanized, corneas were excised, and immunofluorescence staining for lymphatic vessel marker LYVE-1 was performed [2]
CML mouse model: C57BL/6 mice were intravenously injected with BCR-ABL-transduced bone marrow cells to establish CML. Seven days after cell injection, LY364947 (HTS466284) was dissolved in 0.5% methylcellulose and administered orally at 5 mg/kg once daily for 21 days. Survival rate was recorded daily. At the end of the experiment, bone marrow and spleen cells were collected for LIC frequency analysis and molecular biology detection [3]

LY364947 (HTS466284) had a plasma protein binding rate of 92% in mouse plasma [1]
In mice treated with LY364947 (HTS466284) (up to 10 mg/kg, i.p./oral, for 21 days), no significant weight loss or abnormal clinical signs were observed [2,3]
Serum levels of ALT, AST, BUN, and Cr in LY364947 (HTS466284)-treated mice were within the normal range, with no significant difference from the vehicle group [2,3]

[1]. Kinetic characterization of novel pyrazole TGF-beta receptor I kinase inhibitors and their blockade of the epithelial-mesenchymal transition. Biochemistry, 2005, 44(7), 2293-2304.

[2]. Inhibition of endogenous TGF-beta signaling enhances lymphangiogenesis. Blood, 2008, 111(9), 4571-4579.

[3]. TGF-beta-FOXO signalling maintains leukaemia-initiating cells in chronic myeloid leukaemia. Nature, 2010, 463(7281), 676-680.

LY 364947 is a member of the class of pyrazoles carrying pyridin-2-yl and quinolin-4-yl substituents at positions 3 and 4 respectively. It has a role as a TGFbeta receptor antagonist. It is a member of pyrazoles, a member of pyridines and a member of quinolines.
4-(3-Pyridin-2-YL-1H-pyrazol-4-YL)quinoline has been reported in Exserohilum rostratum with data available.

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LY364947 (HTS466284) is a novel pyrazole-derived small molecule inhibitor of TGF-beta type I receptor (ALK5) [1]
LY364947 (HTS466284) exerts its inhibitory effect through competitive binding to the ATP-binding pocket of ALK5, preventing ATP binding and subsequent activation of the TGF-β/Smad signaling pathway [1]
LY364947 (HTS466284) regulates lymphangiogenesis by inhibiting endogenous TGF-β signaling, which normally suppresses LEC proliferation and migration [2]
LY364947 (HTS466284) targets the TGF-beta-FOXO signaling axis to eliminate LICs in CML, providing a potential therapeutic strategy for eradicating minimal residual disease [3]
LY364947 (HTS466284) has potential applications in the treatment of diseases associated with impaired lymphangiogenesis and chronic myeloid leukaemia [2,3]

C17H12N4

272.3

272.106

C, 74.98; H, 4.44; N, 20.58

396129-53-6

447966

Typically exists as off-white to yellow solids at room temperature

1.3±0.1 g/cm3

490.8±45.0 °C at 760 mmHg

268.7±15.1 °C

0.0±1.2 mmHg at 25°C

1.700

2.35

54.46

1

3

2

21

348

0

N1([H])C(C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=N2)=C(C([H])=N1)C1=C([H])C([H])=NC2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12

IBCXZJCWDGCXQT-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H12N4/c1-2-6-15-13(5-1)12(8-10-19-15)14-11-20-21-17(14)16-7-3-4-9-18-16/h1-11H,(H,20,21)

4-(3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)quinoline

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (4.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 12.5 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (4.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 12.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。