MK8722

AMPK; pan-AMPK

MK-8722 比 AMP 更强大、更显着地激活 pAMPK 复合物。 MK-8722 会导致原代小鼠肝细胞、HepG2 细胞或原代人肌细胞中许多其他已知的 pAMPK 靶标磷酸化。 MK-8722 最有效的脱靶活性是针对血清素 5-HT2A 受体。 [1]

除了减少胰岛素抵抗和高血糖之外，MK-8722 药理学泛 AMPK 激活还可改善长期可持续的葡萄糖稳态。 MK-8722（30 mpk）急性治疗可显着降低血糖和胰岛素水平。小鼠长期服用 MK-8722 也会提高肌肉中 Glut4 蛋白的水平。随着心肌糖原和骨骼肌糖原的增加，MK8722 会导致恒河猴心脏肥大。 [1]

AMPK活性测定和活化剂EC50值的测定[1]
酶促反应分三个阶段进行。在阶段1中，将感兴趣的AMPK复合物在含有20mM HEPES、pH 7.3、10mM MgCl2、6mM DTT、0.01%Brij 35、200mM ATP的AMPK反应缓冲液中适当稀释（至最终酶反应中所需浓度的两倍），然后通过添加GST标记的截短CaMKK2（最终约20nM）进行磷酸化/活化（30），并在室温下孵育30分钟，得到pAMPK。对于含有γ3的AMPK酶，使用的缓冲液为100mM Tris-HCl、pH 7.5、100mM KCl、10mM MgCl2、6mM DTT、0.02%BSA和200uM ATP。在第二阶段，通过向含有pAMPK的反应缓冲液（每孔15mL；384孔板）中加入适当稀释的DMSO（共1.2mL）中的AMPK激活剂（例如，MK-8722或AMP）来预孵育化合物和pAMPK，将板短暂涡旋，然后在室温下孵育30分钟。最后，通过在缺乏ATP的AMPK反应缓冲液中加入荧光素标记的SAMS肽5-FAM-HMRSAMSGLFKRR-COOH（15mL；1.5mM终浓度肽底物）来启动pAMPK反应阶段3。将板密封并在室温下孵育60分钟，此时通过加入由100 mM HEPES、pH 7.3、0.015%Brij 35和40 mM EDTA组成的淬灭缓冲液来停止反应。将反应板离心（2000 rpm，4分钟），使用以下参数在LabChip EZ读数器上读取上清液：-550下游电压、-2250上游电压、-1.5 psi压力、40 s样品后取样时间和110 s最终延迟。通过取底物和产物峰高的比率并乘以100来计算形成的产物百分比。使用4参数逻辑斯谛曲线拟合分析，根据%产物与活化剂浓度图计算EC50和%活化参数。Eurofins在广泛的药理学相关靶点（120项Panlabs检测，包括各种酶、受体、离子通道和转运蛋白）中评估了MK-8722的选择性。

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MK-8722和AMP对AMPK活性的协同作用[1]
在这项研究中，pAMPK活性是通过使用ADP-Glo激酶检测试剂盒测量激酶反应中ADP的形成速率来确定的。pAMPK12（2 nM；使用CAMKK2生成）在室温下与饱和水平的活化剂、25 mM的AMP和/或195 nM的MK-8722在含有100 mM Tris-HCl、pH 7.5、10 mM MgCl2、100 mM KCl、I mM DTT、0.015%Brij 35和0.02%BSA的反应缓冲液中预孵育30分钟。然后通过加入100mM ATP和10mM肽底物（序列：HMRSAMSGLH）引发反应。根据孵育时间终止反应，并按照制造商的说明使用ADP-Glo™试剂测定ADP的形成。使用SpectraMax M5微孔板读数器测量发光。数据来自两项独立研究。

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MK-8722血浆蛋白结合[1]
使用96孔RED平衡透析板测定与C57BL/6小鼠、Wistar汉族大鼠、恒河猴和人血浆的血浆蛋白结合。用等渗磷酸盐缓冲液（PBS）对掺有MK-8722（10mM）的血浆进行平衡透析。由于MK-8722高度结合蛋白质，因此还包括稀释（10%）血浆，以估计MK-8722在未稀释（100%）血浆中的结合。在透析结束时（4-6小时），通过LC-MS/MS分析血浆和磷酸盐缓冲液的等分试样，以在使用乙腈进行蛋白质沉淀后定量每个隔室中的MK-8722（见下文）。

AMPK激活剂对细胞pACC和pAMPK的影响[1]
将HepG2肝癌细胞和Hela细胞（每孔50000个细胞）加入96孔板中，在含有10%胎牛血清、青霉素/链霉素和非必需氨基酸的DMEM中在37℃、5%CO2气氛下培养过夜。将新鲜分离的小鼠和大鼠原代肝细胞（每孔25000个细胞）加入到含有10%胎牛血清、青霉素/链霉素的IHAMC培养基中的I型胶原包被的96孔板中，并在37℃、5%CO2气氛中培养过夜。第二天早上，将培养基换成不含血清的DMEM（每孔99 mL），再培养2小时。在检查化合物C效果的研究中，在添加AMPK激活剂之前，将细胞与或不与指定终浓度的化合物C预孵育1小时。然后加入单独的DMSO或DMSO（1mL，1%DMSO终浓度）中的AMPK激活剂（MK-8722、AICAR或离子霉素），以达到所需的终浓度，并使用MK-8722和AICAR继续培养1小时，或使用离子霉素继续培养5分钟。对照研究表明，DMSO控制结果在5至60分钟的孵育时间内没有变化。在适当的孵育后，通过抽吸轻轻取出培养基，并加入60微升含有PhosStop磷酸酶抑制剂和完整蛋白酶的冷冻细胞裂解缓冲液。。。

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MK-8722和胰岛素对人骨骼肌细胞2-脱氧-D-葡萄糖摄取的影响[1]
使用原代人骨骼肌细胞和培养基。将未分化的肌肉细胞以30000个细胞的密度接种在96孔胶原涂层白色/不透明板上的100 mL生长培养基中。在37℃和5%CO2气氛下培养4-6小时后，将培养基换成基础培养基+0.1%牛血清白蛋白。加入终浓度为30mM的DMSO（含或不含化合物C）并孵育培养物1小时。此时，添加终浓度为3或10mM的DMSO，含或不带MK-8722，并继续孵育过夜（终浓度为2%）。第二天，加入Humulin至终浓度为100nM，然后孵育1小时。然后用PBS洗涤该板两次，然后加入含有100 mM 2-脱氧-D-葡萄糖和0.5 mCi/mL[14C]-2-脱氧-D葡萄糖的PBS/Ca+2/Mg+2/0.1%BSA。孵育10分钟后，将平板置于冰上，取出培养基，然后用冰冷的PBS洗涤孔三次。剩余的细胞在室温下用50 mL细胞裂解缓冲液裂解1小时，加入150 mL Microscint 40，并使用微孔板闪烁和发光计数器测定放射性。

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MK-8722对细胞ATP的影响[1]
小鼠3T3-L1成纤维细胞（传代#2-11）和大鼠肝癌H4IIE细胞在单层中生长。在BioCoat T-150培养瓶中接种后5-7天，3T3-L1成纤维细胞开始分化。细胞与分化培养基一起孵育8-12天（2天加IBMX，2天加胰岛素，4-8天加胎牛血清）。将完全分化的3T3-L1脂肪细胞胰蛋白酶化，并以每孔约6-8x104个细胞的密度重新接种在胶原涂层的96孔板上。细胞用饥饿培养基（DMEM加25 mM D-葡萄糖、0.1μM地塞米松和1μM胰岛素）饥饿60分钟，然后用DMSO（1%终浓度）处理60分钟，可加或不加MK-8722。H4IIE细胞生长至约90%融合，用DMSO（1%终浓度）加或不含MK-8722处理3小时。

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MK-8722细胞通透性[1]
在24孔透孔培养板中培养的LLC-PK1细胞中测定MK-8722的细胞通透性。在含有10mM HEPES、pH7.4的Hank's平衡盐溶液中，以0.1、0.5或1μM的终浓度制备含有[3H]-MK-8722的溶液。将这些溶液分别添加到培养板的顶端（A）或基底外侧（B）隔室中，并将缓冲液添加到与含有化合物的隔室相对的隔室中。在t=3小时时，从两侧取出样品（50毫升）并计数放射性。

Mice: Lean Housing Both C57BL/6 eDIO mice and C57BL/6 mice between the ages of 10 and 12 weeks are employed. 7-week-old db/db mice are employed. With free access to food and water and a constant temperature of 22°C, animals are kept on a 12/12-hour light-dark cycle. In a typical cage, four thin C57BL/6 mice are kept. eDIO mice are housed in individual cages. In a sizable rodent cage, eight db/db mice are kept. Before receiving compound treatments, C57BL/6 mice and db/db mice are kept on the regular rodent chow diet 7012 (5% dietary fat; 3.75 kcal/g). A diet high in fat (60 kcal%) is used to maintain eDIO mice. Use 10 mL/kg body weight when administering MK8722 orally in a standard vehicle or by the vehicle alone. By contrasting MK8722's effects with those of animals that had been given vehicles as treatments, various metabolic parameters are determined[1].

[1]. Science. 2017 Aug 4;357(6350):507-511.

5'-Adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) is a master regulator of energy homeostasis in eukaryotes. Despite three decades of investigation, the biological roles of AMPK and its potential as a drug target remain incompletely understood, largely because of a lack of optimized pharmacological tools. We developed MK-8722, a potent, direct, allosteric activator of all 12 mammalian AMPK complexes. In rodents and rhesus monkeys, MK-8722-mediated AMPK activation in skeletal muscle induced robust, durable, insulin-independent glucose uptake and glycogen synthesis, with resultant improvements in glycemia and no evidence of hypoglycemia. These effects translated across species, including diabetic rhesus monkeys, but manifested with concomitant cardiac hypertrophy and increased cardiac glycogen without apparent functional sequelae.[1]

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Our results show that systemic, pharmacological pan-AMPK activation by MK-8722 leads to chronically sustainable improvements in glucose homeostasis, including the amelioration of insulin resistance and hyperglycemia. No evidence of hypoglycemia was found in any study using MK-8722, including high-dose 6- to 8-month studies in normoglycemic rats and rhesus monkeys. These effects appear to be mediated predominantly by insulin-independent skeletal muscle glucose uptake. Glucose lowering without a requirement for increased insulin levels should reduce the demand on the pancreatic β cell for insulin and, as a consequence, may increase the durability of antihyperglycemic action. This profile is both unique and highly desirable for patients with T2DM, differing from all currently available therapeutic agents. On the other hand, MK-8722 treatment induced reversible cardiac hypertrophy that was not associated with notable functional sequelae or ECG abnormalities in the time frames studied. Our data suggest that this hypertrophy is not due to the observed cardiac glycogen accumulation. Rather, the effect is reminiscent of the physiological cardiac hypertrophy observed in elite athletes. It is well established that exercise can activate cardiac AMPK (29). Whether this effect is tolerable in humans having the pathophysiology of metabolic syndrome, obesity, and overt diabetes remains to be determined. While this manuscript was in the final stages of review, Cokorinos et al. reported that a close analog of MK-8722 (PF-739) was able to activate skeletal muscle AMPK and lower glucose in preclinical species independent of hepatic AMPK activation. [1]

C24H20CLN3O4

449.886304855347

449.114

C, 64.07; H, 4.48; Cl, 7.88; N, 9.34; O, 14.22

1394371-71-1

1394371-71-1

89558344

White to off-white solid powder

3.8

89.5

2

6

4

32

645

4

C1[C@H]([C@@H]2[C@H](O1)[C@@H](CO2)OC3=NC4=NC(=C(C=C4N3)Cl)C5=CC=C(C=C5)C6=CC=CC=C6)O

XQMNBTZLYOOAGA-UGESXGAOSA-N

InChI=1S/C24H20ClN3O4/c25-19-16(15-8-6-14(7-9-15)13-4-2-1-3-5-13)10-26-23-20(19)27-24(28-23)32-18-12-31-21-17(29)11-30-22(18)21/h1-10,17-18,21-22,29H,11-12H2,(H,26,27,28)/t17-,18-,21-,22-/m1/s1

(3R,3aR,6R,6aR)-6-[[6-chloro-5-(4-phenylphenyl)-1H-imidazo[4,5-b]pyridin-2-yl]oxy]-2,3,3a,5,6,6a-hexahydrofuro[3,2-b]furan-3-ol

MK8722; MK 8722; 1394371-71-1; CHEMBL4167177; (3R,3aR,6R,6aR)-6-[[6-chloro-5-(4-phenylphenyl)-1H-imidazo[4,5-b]pyridin-2-yl]oxy]-2,3,3a,5,6,6a-hexahydrofuro[3,2-b]furan-3-ol; 1,4:3,6-Dianhydro-2-O-(5-[1,1'-biphenyl]-4-yl-6-chloro-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-2-yl)-D-mannitol; (3R,3aR,6R,6aR)-6-[(5-{[1,1'-biphenyl]-4-yl}-6-chloro-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-2-yl)oxy]-hexahydrofuro[3,2-b]furan-3-ol; RW3ZG69SHT; MK-8722

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~90 mg/mL (~115.1 mM)
Ethanol: ~2 mg/mL (~4.5 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.08 mg/mL (4.62 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.62 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.62 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。