PRMT5
MRTX-1719 targets the PRMT5•MTA complex, which is formed when methylthioadenosine (MTA) accumulates in cells lacking MTAP (methylthioadenosine phosphorylase). PRMT5 is a protein arginine methyltransferase that symmetrically dimethylates arginine residues on histones and other proteins, regulating gene expression and RNA splicing. By selectively binding to the PRMT5/MTA complex with high affinity (Kd = 0.14 pM), MRTX-1719 inhibits PRMT5 methyltransferase activity specifically in MTAP-deleted cancer cells.

在MTAP缺失的HCT116分裂野生型细胞中，MRTX-1719（10天）抑制PRMT5活性，IC50值为8 nM [1]。在缺乏MTAP的HCT116细胞中，MRTX-1719（10天）的IC50值为12 nM，但在具有野生型表型的HCT116细胞中，其IC50值为890 nM [1]。体外实验表明，MRTX-1719是PRMT5/MTA复合物的强效抑制剂，对PRMT5•MTA的IC50值为3.6 nM，对PRMT5的IC50值为20.5 nM。它与PRMT5/MTA复合物的解离常数Kd为0.14 pM。该化合物能有效抑制人HCT-116细胞（MTAP敲除）中的PRMT5甲基转移酶活性，IC50约为8.0 nM。在MTAP缺失的癌症模型中，该化合物表现出很强的选择性和抗肿瘤活性。

MRTX1719（12.5-100 mg/kg/天，面部给药，21天）可抑制Lu-99原位异种移植瘤的生长[2]。药代动力学分析[2] 模型 给药途径 剂量（mg/kg） 总血药浓度（mL/min/kg） 分布容积（L/kg） 半衰期（h） CD-1小鼠 静脉注射 3 83 6.3 1.5 比格犬 静脉注射 2 14 3.4 4.8 食蟹猴 静脉注射 2 15 2.3 6.1 模型 给药途径 剂量（mg/kg） 最大血药浓度（μg/mL） 注射后曲线下面积（h*μg/mL） 药物浓度（%） CD-1微型小鼠。口服 30 1.16 4.85 80 比格犬 口服 10 1.40 7.47 59 食蟹猴 口服 10 / / 41
体内实验表明，MRTX-1719 具有良好的口服生物利用度，并在 MTAP 缺失的癌症模型中表现出很强的选择性和抗肿瘤活性。其解离半衰期较长（约 14 天）。该化合物正被开发用于治疗 MTAP 缺失的癌症。然而，现有文献中尚未详细描述具体的体内疗效数据和给药细节。

PRMT5 的生化研究是在 Reaction Biology Corporation 公司利用 FlashPlate 系统进行的，所用蛋白为 PMRT5/MEP50 复合物（#HMT-22-148：人重组 PRMT5 [GenBank 登录号 NM_006109；氨基酸 2–637（末端）]，带有 N 端 Flag 标签；人重组 MEP50 [基因 GenBank 登录号 NM_024102；氨基酸 2–342（末端）]，带有 N 端 His 标签，在 Sf9 细胞表达系统中共表达）。FlashPlate 底物为生物素标记的组蛋白 H4 (1–15) 肽段。甲基供体为 S-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸。反应缓冲液为 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)、0.002% Tween20、0.005% 牛血清白蛋白 (BSA)、1 mmol/L TCEP 和 1% 二甲基亚砜 (DMSO)[1]。最终反应条件为：3 nmol/L PRMT5/MEP50、40 nmol/L 组蛋白 H4-生物素肽和 1 μmol/L SAM。底物用反应缓冲液配制。酶以 40 μL/孔的量加入底物溶液中。化合物用 DMSO 溶解后加入反应混合物中，并在室温下预孵育 20 分钟。氚标记的 SAM 以 10 μL/孔的量加入反应混合物中以启动反应，并在室温下孵育 2 小时。为终止反应，向每个孔中加入 10 μL 浓度为 600 μmol/L 的冷 SAM，并将每个孔中 50 μL 终止反应液转移至 FlashPlate 中，室温孵育 1 小时。用 PBS 洗涤微孔板，并在 TopCount HTS 微孔板闪烁和发光计数器上进行计数。在有或无 2 μmol/L MTA 的情况下，进行 10 倍浓度递增（起始浓度为 1 μmol/L）的 IC50 实验。[1]

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生化甲基转移酶测定[2]
该测定使用纯化的人类 PRMT5 酶，将 S-腺苷-L-[甲基-3H]蛋氨酸和组蛋白 H4 L-精氨酸转化为 S-腺苷-L-高半胱氨酸和组蛋白 H4 [甲基-3H]-L-精氨酸。该检测采用链霉亲和素包被的FlashPlates进行，该FlashPlates的塑料板中嵌入了闪烁剂。组蛋白H4肽底物与生物素偶联，生物素可结合到FlashPlates的链霉亲和素包被孔中，使H4肽紧邻孔壁和闪烁剂。S-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸上的氚标记甲基转移至结合的组蛋白H4肽上，生成放射性标记的组蛋白H4。通过闪烁计数器测量放射性来定量，从而确定在有无化合物存在下PRMT5酶的活性。此外，还在有无MTA存在下进行检测反应，以确定化合物是否具有MTA协同活性。简而言之，将化合物溶解于100% DMSO中，最高浓度为10 mM。为测定IC50值，各化合物系列稀释的初始浓度均为50 μM。同时制备不含化合物、PRMT5/MEP50复合物或各种反应组分的对照样品，并与化合物测试样品平行处理。SAH用作检测方法验证的阳性对照。为测定PRMT5抑制活性，将3 nM PRMT5/MEP50复合物（Reaction Biology Corporation）与测试化合物在含有40 nM组蛋白H4肽（氨基酸1-15）-生物素偶联物的检测缓冲液中于室温预孵育20分钟。加入1 μM氚标记的SAM（终浓度）启动酶促反应，反应进行20分钟。终止反应后，使用闪烁计数器测定各样品中结合的氚标记H4肽的量。使用 GraphPad Prism 软件，根据添加和不添加 MTA 的样品的 10 点剂量-反应曲线计算每种化合物的 IC50 值。
对于体外酶活性测定，将重组 PRMT5•MTA 或 PRMT5•SAM 复合物与肽底物和 S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 在测定缓冲液中孵育。加入不同浓度 (0.001-1000 nM) 的待测化合物。通过放射性、荧光或质谱法检测甲基化产物来测定甲基转移酶活性。通过拟合剂量-反应曲线计算 IC50 值。

HCT116 MTAP-WT 和 MTAP-del 细胞活力检测[2]
使用 HCT116 MTAP-WT 和 HCT116 MTAP-del 细胞系进行细胞活力检测。同时分析对照样品。第 0 天，将 250 个 HCT116 MTAP-WT 或 HCT116 MTAP-del 细胞接种于 96 孔板中，培养基为添加了 10% 胎牛血清和青霉素/链霉素的 McCoy's 5A 培养基，并在 37 °C、5% CO2 条件下培养过夜。第二天，用 DMSO 溶剂对照或不同剂量的测试化合物处理细胞，并在 37 °C、5% CO2 条件下培养 5 天。第6天，用胰蛋白酶消化细胞，并以1:20的比例分装到含有相同浓度测试化合物的新鲜培养基的96孔板中，在37℃、5% CO2条件下继续培养5天。第11天，使用CTG检测试剂盒，按照制造商的说明测定细胞活力。使用GraphPad PRISM软件计算每种化合物处理10天后的IC50值。

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HCT116 MTAP-WT和MTAP-del SYM11细胞内Western印迹分析[2]
使用HCT116 MTAP-WT和HCT116 MTAP-del细胞系进行细胞内Western印迹分析，通过测量PRMT5依赖的对称二甲基精氨酸（SDMA）信号。同时分析对照样品。在第0天，将2000个HCT116 MTAP-WT和HCT116 MTAP-del细胞接种于96孔板中，培养基为添加了10%胎牛血清和青霉素/链霉素的McCoy's 5A培养基，并在37℃、5% CO₂条件下培养过夜。第二天，用DMSO溶剂对照或不同剂量的测试化合物处理细胞，并在37℃、5% CO₂条件下培养4天。处理4天后，向每个孔中加入50 μL 4%多聚甲醛溶液固定细胞，并在室温下孵育20分钟。然后移除多聚甲醛溶液，加入150 μL冰甲醇，并将培养板置于-20℃保存10分钟。之后，移除甲醇，加入150 μL含0.05% Tween-20的Odyssey封闭缓冲液，室温振荡孵育1小时。向每个测试孔中加入50 μL用含0.05% Tween-20的Odyssey封闭缓冲液稀释1:500的SYM11抗体（Millipore 07-413），4℃过夜。吸除SYM11一抗溶液，用含0.1% Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤3次。向孔板中加入50 μL稀释度为1:800的山羊抗兔IRDye 800CW二抗和稀释度为1:10000的核染料DRAQ5（溶于Odyssey封闭缓冲液+DRAQ5+0.05% Tween-20），并在室温下避光孵育2小时。吸除二抗溶液后，用PBST洗涤孔板3次。使用Li-Cor Odyssey仪器分别在800 nm和700 nm处检测SYM11和DRAQ5信号。 SYM11/DRAQ5 比值用于计算 SDMA 抑制率，以 DMSO 对照组的百分比表示。
对于基于细胞的检测，将 MTAP 缺失的癌细胞系（例如 HCT-116 MTAP 敲除细胞）用浓度范围为 0.001-10 µM 的 MRTX-1719 处理。通过蛋白质印迹法检测对称性二甲基精氨酸 (SDMA) 水平来评估 PRMT5 活性。使用 CellTiter-Glo 或 MTT 法检测细胞活力和增殖。

动物/疾病模型： Lu-99（MTAP/CDKN2A 缺失的人肺癌细胞系）异种移植瘤模型[2]
剂量： 12.5、25、50 和 100 mg/kg/d，持续 21 天
给药途径： 口服管饲
实验结果： 肿瘤体积缩小，50 mg/kg 剂量组的肿瘤生长抑制率 (TGI) 为 86%，100 mg/kg 剂量组的肿瘤生长抑制率为 88%。

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体内研究[1]
所有小鼠实验均已获得机构动物护理和使用委员会的批准，并符合美国国立卫生研究院 (NIH) 的指导原则。小鼠饲养于无病原体条件下，并自由摄取食物和水。[1]
将6至8周龄的雌性Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu小鼠右后侧皮下注射肿瘤细胞，每只小鼠注射100 μL PBS和Matrigel基质混合液，注射剂量为5×10⁶个LU99细胞或1×10⁶个HCT116亲代细胞和HCT116 MTAP缺失细胞，细胞与Matrigel的比例为50:50。每日监测小鼠健康状况，当肿瘤可触及时开始使用游标卡尺测量肿瘤体积。肿瘤体积的计算公式为0.5 × L × W²，其中L代表肿瘤的长度，W代表肿瘤的宽度。当肿瘤达到预期的平均研究起始肿瘤体积（LU99：179 mm³ 或 116 mm³；HCT116 MTAP WT：140 mm³；HCT116 MTAP del：185 mm³）时，将小鼠随机分组。MRTX1719 配制于 0.5% 甲基纤维素（4,000 cps）+ 0.2% Tween80 的水溶液中，每周一次，并在室温下避光保存。GSK3326595 配制于 0.5% 甲基纤维素（4,000 cps）+ 0.2% Tween80 的水溶液中，每周一次，并于 4°C 下避光保存。JNJ-64619178 配制于 20% HP-β-CD 的水溶液中，每周一次，并在室温下避光保存。小鼠按指定剂量和给药方案经口给予赋形剂、MRTX1719、GSK3326595 或 JNJ-64619178。每日监测小鼠，每周测量 2 或 3 次肿瘤体积和体重。[1]
PXF 537、PXF 2197、PXF 1118、PXF 541 和 PXF 2442 间皮瘤 PDX 模型实验在 Charles River 公司进行，研究设计与 LU99 和 HCT116 肿瘤模型类似。简而言之，将 2 至 3 mm³ 的 PDX 碎片皮下接种到 NMRI nu/nu 小鼠体内，并在平均肿瘤体积达到约 120 至 140 mm³ 时随机分组开始治疗。小鼠按指定剂量和持续时间接受载体或 MRTX1719 处理（每组 n = 3）。[1]

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异种移植研究[2]
Lu-99 细胞系 (RCB1900) 购自日本理化学研究所生物资源研究中心（筑波），并在含有 10% 胎牛血清、10 mM HEPES、1 mM 丙酮酸钠和 1% 抗生素-抗真菌剂的 RPMI 1640 培养基中培养。小鼠实验严格遵守美国国立卫生研究院 (NIH) 机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的所有适用法规和指南。小鼠饲养于无病原体 (SPF) 条件下，并自由摄取食物和水。将6-8周龄的雌性Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu小鼠（Envigo公司，圣地亚哥）皮下注射100 μL PBS和Matrigel基质混合液（5.0 × 10⁶个Lu-99肿瘤细胞），注射部位为每只小鼠的右后侧腹部（细胞：Matrigel比例为50:50）。每日监测小鼠健康状况，当肿瘤可触及时开始使用游标卡尺测量肿瘤体积。肿瘤体积的计算公式为0.5 × L × W²，其中L代表肿瘤的长度，W代表肿瘤的宽度。当肿瘤平均体积达到约180 mm³时，将小鼠随机分组进行治疗。MRTX1719制剂配制于0.5%甲基纤维素（4000 cps）+ 0.2% Tween 80的水溶液中，每周一次，并于室温避光保存。小鼠按指定剂量和给药方案口服给予赋形剂或MRTX1719。每日监测小鼠，每周测量2或3次肿瘤体积和体重。肿瘤生长抑制率（%TGI）采用以下公式计算：（1 –（最终药物治疗肿瘤体积 – 初始药物治疗肿瘤体积）/（最终赋形剂治疗肿瘤体积 – 初始赋形剂治疗肿瘤体积））× 100。[2]
在给药后特定时间点采集全血，以测量血浆中MRTX1719的浓度并评估MRTX1719的药代动力学特性。通过颌下静脉抽血采集约50 μL血液至肝素化试管中，并立即颠倒混匀。然后将肝素化血液以4000 rpm离心6分钟，以分离血浆和细胞成分。分离出的血浆被转移至聚丙烯96孔板中，并立即储存于−20 °C直至分析。研究结束时，对小鼠实施安乐死，手术切除肿瘤并立即将其切成两半。一半转移至溶菌基质A管中，另一半转移至螺旋盖微量离心管中。这些离心管立即浸入液氮中进行速冻。冷冻的肿瘤组织碎片储存于−80 °C直至分析。
在体内疗效研究中，将MTAP缺失的肿瘤异种移植瘤植入免疫缺陷小鼠体内。当肿瘤达到预定大小时，将小鼠随机分组，并通过灌胃给予MRTX-1719治疗，剂量根据药代动力学研究确定。每周测量两次肿瘤体积。在研究终点，收集肿瘤组织用于分析SDMA水平和PRMT5抑制情况。

MRTX-1719 具有口服生物利用度。在犬 MDCKII-MDR1 细胞中，其表观渗透性低，外排率高。建议在 -20°C 下储存以保持长期稳定性。更详细的药代动力学参数，包括半衰期、Cmax、AUC 和组织分布，可从原始文献中获取。该化合物仅供研究使用。

MRTX-1719的毒理学数据可从临床前研究中获得。作为一种临床阶段化合物，它已完成安全性评估。作为一种研究性化合物，在处理该化合物时应遵循标准安全预防措施。临床开发需要进行全面的毒理学研究。

[1]. MRTX1719 is an MTA-cooperative PRMT5 inhibitor that exhibits synthetic lethality in preclinical models and patients with MTAP deleted cancer. Cancer Discov. 2023 Aug 8;CD-23-0669.

[2]. Fragment-Based Discovery of MRTX1719, a Synthetic Lethal Inhibitor of the PRMT5•MTA Complex for the Treatment of MTAP-Deleted Cancers. J Med Chem. 2022 Feb 10;65(3):1749-1766.

[3]. Targeting the genetic and immunological drivers of cancer.

MRTX1719 是一种 PRMT5-MTA 抑制剂，具有口服生物利用度，可抑制蛋白精氨酸甲基转移酶 5 (PRMT5)-甲基硫代腺苷 (MTA) 复合物，并具有潜在的抗肿瘤活性。口服后，MRTX1719 可选择性地与 MTAP 缺陷型癌细胞中高表达的 PRMT5-MTA 复合物结合，特异性地抑制这些细胞中的 PRMT5 功能，而不影响正常健康细胞。通过抑制 PRMT5 甲基转移酶活性，组蛋白 H2A、H3 和 H4 中单甲基化和二甲基化精氨酸残基的水平降低。这可调节参与多种细胞过程（包括细胞增殖）的基因表达。这可能导致抗增殖基因表达增加和/或促增殖基因表达减少，从而减缓快速增殖的癌细胞的生长。 MRTX1719还能诱导RNA剪接失调和pRb水平降低。这些因素共同作用，特异性地抑制MTAP缺陷型癌细胞的增殖并促进其凋亡。PRMT5是一种II型甲基转移酶，催化组蛋白和其他参与信号转导和细胞转录的蛋白质底物上ω-N单甲基精氨酸（MMA）和对称二甲基精氨酸（sDMA）的形成。它对癌细胞和正常细胞的存活都至关重要。PRMT5在多种肿瘤中过表达。PRMT5水平升高与患者生存期缩短相关。在某些癌细胞中，MTAP缺失，导致代谢物MTA的积累。 MTA 与 PRMT5 结合并部分抑制其活性。
MRTX-1719（Navlimetostat）是一种强效、口服生物利用度高、选择性的 PRMT5•MTA 复合物抑制剂，其 Kd 值分别为 0.14 pM (PRMT5/MTA) 和 9.4 pM (PRMT5/SAM)。其对 PRMT5•MTA 的 IC50 值为 3.6 nM。MRTX-1719 在 MTAP 缺失的癌症模型中表现出强大的抗肿瘤活性。它是一种研究性化合物，尚未获准用于临床。

C23H18CLFN6O2

464.87942647934

464.12

C, 59.42; H, 3.90; Cl, 7.63; F, 4.09; N, 18.08; O, 6.88

2630904-45-7

(S)-MRTX-1719;2630904-44-6;MRTX-1719 hydrochloride

156151242

White to light yellow solid powder

2.7

118Ų

2

7

5

33

846

0

CN1C(=C(C=N1)C2=CC3=C(C=C2)C(=O)NN=C3CN)C4=C(C(=CC(=C4F)Cl)OC5CC5)C#N

BZKIOORWZAXIBA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H18ClFN6O2/c1-31-22(20-15(8-26)19(33-12-3-4-12)7-17(24)21(20)25)16(10-28-31)11-2-5-13-14(6-11)18(9-27)29-30-23(13)32/h2,5-7,10,12H,3-4,9,27H2,1H3,(H,30,32)

2-(4-(4-(aminomethyl)-1-oxo-1,2-dihydrophthalazin-6-yl)-1-methyl-1H-pyrazol-5-yl)-4-chloro-6-cyclopropoxy-3-fluorobenzonitrile

MRTX1719; Navlimetostat; MRTX 1719; BMS-986504; BMS986504; BMS 986504; (R)-Navlimetostat; (R)-MRTX-1719; BMS-986,504; MRTX-1719;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~215.11 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2 mg/mL (4.30 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2 mg/mL (4.30 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.0mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2 mg/mL (4.30 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。