VEGFR1 (IC50 = 34 nM); VEGFR2 (IC50 = 13 nM); VEGFR3 (IC50 = 13 nM); FGFR1 (IC50 = 69 nM); FGFR2 (IC50 = 37 nM); FGFR3 (IC50 = 108 nM); PDGFRα (IC50 = 59 nM); VEGFR1 (IC50 = 34 nM); PDGFRβ (IC50 = 65 nM)

体外活性：BIBF1120 抑制 PDGFR α 和 PDGFR β 型的 PDGFR 激酶活性，IC50 值分别为 59 nM 和 65 nM。此外，BIBF1120 抑制 FGFR 亚型，FGFR1、FGFR2 和 FGFR3 的 IC50 分别为 60 nM、37 nM 和 108 nM。 BIBF1120 与激酶结构域氨基端叶和羧基端叶之间缝隙中的 ATP 结合位点结合。吲哚酮支架与铰链区的 Cys919 的主链氮和 Glu917 的主链羰基氧形成两个氢键。 BIBF 1120 抑制 PDGF-BB 刺激的 BRP 增殖，在细胞测定中 EC50 为 79 nM。用 5% 血清加 PDGF-BB 刺激后，浓度低至 100 nM 的 BIBF1120 可阻断 MAPK 的激活。在人血管平滑肌细胞 (HUASMC) 培养物中，BIBF1120 可防止 PDGF-BB 刺激的增殖，EC50 为 69 nM。激酶测定：将 VEGFR2 的细胞质酪氨酸激酶结构域（根据数据库 SWISS-PROT P35968 中保存的序列，残基 797-1355）克隆到与 GST 融合的 pFastBac 中并提取。在存在或不存在 BIBF1120 在 25% DMSO 中进行系列稀释的情况下测定酶活性。每个微量滴定板都包含内部对照，例如空白、最大反应和历史参考化合物。所有孵育均在室温下在旋转摇床上进行。将 10 μL 每种 BIBF1120 稀释液添加到 10 μL 稀释激酶（0.8 μg/mL VEGFR2、10 mM Tris pH 7.5、2 mM EDTA 和 2 mg/mL BSA）中，并预孵育 1 小时。通过添加 30 μL 底物混合物开始反应，其中包含 62.4 mM Tris pH 7.5、2.7 mM DTT、5.3 mM MnCl2、13.3 mM 乙酸镁、0.42 mM ATP、0.83 mg/mL Poly-Glu-Tyr(4:1 ）和 1.7 μg/mL Poly-Glu-Tyr(4:1)-生物素并孵育 1 小时。添加 50 μL 250 mM EDTA、20 mM HEPES、pH 7.4 终止反应。将 90 μL 反应混合物转移至链霉亲和素板并孵育 1-2 小时。用 PBS 洗涤 3 次后，添加 EU 标记抗体 PY20（建议在 DELFIA 测定缓冲液中按 1:2000 稀释 0.5 mg/mL 标记抗体）。 DELFIA 洗涤缓冲液洗涤 3 次即可去除过量的检测抗体。然后，在多标签阅读器上测量前 10 分钟，将每个孔与 100 μL DELFIA 增强溶液一起孵育。细胞测定：细胞系（HUVEC、HUASMC 和 BRP）用于测定。在添加配体前两小时将 BIBF1120 添加到培养物中。产生细胞裂解物。蛋白质印迹使用标准 SDS-PAGE 方法进行，每泳道上样 50 至 75 μg 蛋白质。增强的化学发光有助于检测。使用单克隆抗体 M3807 和 M8159 分析总丝裂原激活蛋白激酶 (MAPK) 和磷酸化丝裂原激活蛋白激酶 (MAPK)。使用相应的多克隆抗体检测总 Akt，并使用其单克隆抗体分析磷酸化 Akt (Ser473)。单克隆抗体也用于检测裂解的 caspase-3，而 KDR (VEGFR2) 蛋白则使用相应的抗体进行检测。

在迄今为止测试的所有肿瘤模型中，包括在裸鼠中生长的人类肿瘤异种移植物和同基因大鼠肿瘤模型，BIBF1120在耐受良好的剂量（每天口服25-100 mg/kg）下具有高度活性。这在 3 天后肿瘤灌注的磁共振成像、5 天后血管密度和血管完整性降低以及深度生长抑制中显而易见。

含有 VEGFR2 胞质酪氨酸激酶结构域（残基 797-1355，基于数据库 SWISS-PROT P35968 中存储的序列）的 pFastBac 克隆与 GST 融合并提取。酶活性测定在含有或不含连续稀释的 BIBF1120 的 25% DMSO 中进行。每个微量滴定板上都有内部对照，包括空白、最大反应和历史参考化合物。在旋转摇床上，所有孵育均在室温下进行。将 10 μL 稀释激酶（0.8 μg/mL VEGFR2、10 mM Tris pH 7.5、2 mM EDTA 和 2 mg/mL BSA）与 10 μL 每种 BIBF1120 稀释液预孵育一小时。添加 30 μL 底物混合物，其中含有 13.3 mM 乙酸镁、6.2.4 mM Tris pH 7.5、2.7 mM DTT、5.3 mM MnCl₂、0.42 mM ATP、0.83 mg/mL Poly-Glu- Tyr(4:1) 和 1.7 μg/mL Poly-Glu-Tyr(4:1)-生物素引发反应，然后孵育一小时。将 90 μL 反应混合物置于链霉亲和素板上并孵育 1 至 2 小时。添加 50 μL 250 mM EDTA、20 mM HEPES 和 pH 7.4 终止反应。用 EU 标记抗体用 PBS 洗涤 3 次后，添加 PY20（建议在 DELFIA 测定缓冲液中按 1:2000 稀释 0.5 mg/mL 标记抗体）。使用 3 次 DELFIA 洗涤缓冲液洗涤以除去多余的检测抗体。然后将 DELFIA 增强溶液 (100 μL) 在每个孔中孵育 10 分钟，然后在多标签阅读器上进行测量。

该测定使用细胞系 BRP、HUASMC 和 HUVEC。在添加配体之前两小时向培养物补充 BIBF1120。产生细胞裂解物。标准 SDS-PAGE 技术用于蛋白质印迹，每泳道上样 50–75 μg 蛋白质。改进的化学发光有助于检测。单克隆抗体 M3807 和 M8159 用于分析总丝裂原激活蛋白激酶 (MAPK) 和磷酸化丝裂原激活蛋白激酶 (MAPK)。使用磷酸化 Akt (Ser473) 的单克隆抗体对其进行分析，而相应的多克隆抗体则用于检测总 Akt。虽然相应的抗体用于检测 KDR (VEGFR2) 蛋白，但单克隆抗体也用于检测裂解的 caspase-3。

For the assay, athymic NMRI-nu/nu female mice weighing between 21 and 33 grams are five to six weeks old. Following their acclimation, mice are injected with 1 to 5×10⁶ (in 100 μL) of SKOV-3, FaDu, Caki-1, H460, HT-29, or PAC-120 cells subcutaneously into their right flank. Following their acclimation, 5×10⁶ (in 100 μL) GS-9L cells are subcutaneously injected into the right flank of F344 Fischer rats. Blood is extracted from the retroorbital plexus of mice at predetermined intervals for pharmacokinetic analysis, and plasma is examined using high performance liquid chromatography-mass spectrometry methodology[1].

[1]. BIBF 1120: triple angiokinase inhibitor with sustained receptor blockade and good antitumor efficacy. Cancer Res, 2008, 68(12), 4774-4782.

[2].Effect of a novel oral chemotherapeutic agent containing a combination of trifluridine, tipiracil and the novel triple angiokinase inhibitor nintedanib, on human colorectal cancer xenografts. Oncol Rep. 2016 Dec;36(6):3123-3130.

[3]. Design, synthesis, and evaluation of indolinones as triple angiokinase inhibitors and the discovery of a highly specific 6-methoxycarbonyl-substituted indolinone (BIBF 1120). J Med Chem, 2009, 52(14), 4466-4480.

C33H39N5O7S

649.763

649.25701977

C, 61.00; H, 6.05; N, 10.78; O, 17.24; S, 4.93

656247-18-6

Nintedanib;656247-17-5

Yellow solid powder

CCS(=O)(=O)O.CN1CCN(CC1)CC(=O)N(C)C2=CC=C(C=C2)N=C(C3=CC=CC=C3)C4=C(NC5=C4C=CC(=C5)C(=O)OC)O

ZNMRDZZRAFJOKY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C31H33N5O4.C2H6O3S/c1-34-15-17-36(18-16-34)20-27(37)35(2)24-12-10-23(11-13-24)32-29(21-7-5-4-6-8-21)28-25-14-9-22(31(39)40-3)19-26(25)33-30(28)38;1-2-6(3,4)5/h4-14,19,33,38H,15-18,20H2,1-3H3;2H2,1H3,(H,3,4,5)

ethanesulfonic acid;methyl 2-hydroxy-3-[N-[4-[methyl-[2-(4-methylpiperazin-1-yl)acetyl]amino]phenyl]-C-phenylcarbonimidoyl]-1H-indole-6-carboxylate

BIBF1120; BIBF 1120 BIBF-1120; Nintedanib esylate; Nintedanib ethanesulfonate salt; Intedanib; Brand name: OFEV; Vargatef

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~41.7 mg/mL (~64.1 mM)
H2O: ~16.7 mg/mL (~25.7 mM)
Ethanol: ~3.1 mg/mL (~4.7 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.85 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: 5% DMSO+40% PEG 300+2% Tween 80+ddH2O: 0.25mg/mL

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配方 5 中的溶解度: 10 mg/mL (15.39 mM) in 50% PEG300 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 6 中的溶解度: 20 mg/mL (30.78 mM) in 20% HP-β-CD in Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。