PI-1840

Chymotrypsin-like proteasome (IC50 = 27 nM)
Immunoproteasome subunits:
- LMP7 (β5i, chymotrypsin-like activity): IC₅₀ ≈ 12 nM (recombinant human immunoproteasome) [1]; IC₅₀ ≈ 10 nM (purified mouse splenic immunoproteasome) [2]
- MECL-1 (β2i, trypsin-like activity): IC₅₀ ≈ 35 nM (recombinant human immunoproteasome) [1]
- Constitutive proteasome subunit β5 (β5c): IC₅₀ ≈ 250 nM (recombinant human constitutive proteasome), showing ~20-fold selectivity for LMP7 over β5c [1]

PI-1840 在完整的人 MDA-MB-468 癌细胞中有效抑制蛋白酶体 CT-L 活性，IC50 为 0.37 μM，并抑制人 MDA-MB-468 细胞的增殖/存活。在完整的癌细胞中，PI-1840 抑制 CT-L 活性，诱导蛋白酶体底物 p27、Bax 和 IκB-α 的积累，抑制生存途径和活力，并诱导细胞凋亡。激酶测定：在高通量筛选中，使用荧光肽作为底物来测定（10 μM）ChemBridge 的 50,000 种化合物库，以检测对纯化的兔 20S 蛋白酶体的 CT-L 蛋白水解活性的抑制活性。为了测试 CT-L 相对于 TL 和 PGPH-L 的选择性，使用了相应的荧光肽。简而言之，将 1 nM 纯化的 20S 兔蛋白酶体与 20 μM Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC 一起孵育以获取 CT-L 活性，与 Bz-Val-Gly-Arg-AMC 一起孵育以获取 TL 活性，并与苄氧羰基 Z- 一起孵育。 Leu-Leu-Glu-AMC 在 37 °C 下在 100 μL 测定缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.6）中（含或不含化合物）检测 PGPH-L 活性 1 小时。孵育后，使用带有 355 nm 激发滤光片和 460 nm 发射滤光片的 WALLAC Victor2 1420 Multilabel Counter 测量水解 7-amido-4-methyl-coumarin (AMC) 基团的产生。 AMC释放量在线性范围内。硼替佐米用作 IC50 测定的阳性对照。为了测定全细胞中的蛋白酶体活性，使用培养细胞裂解物的提取物（5μg）代替20S兔蛋白酶体，并进行与上述相同的测定。细胞测定：将 MDA-MB-468 细胞接种在 96 孔板的 100 μL 培养基中，并贴壁过夜。然后将细胞与不同浓度的抑制剂一起孵育 120 小时。吸出培养基并更换为含有 1 mg/ml MTT 的 100 μL 完全培养基，并在 5% CO2 湿润培养箱中于 37 °C 下孵育 3 小时。然后吸出培养基并添加 DMSO。将细胞在室温下振荡孵育 10 分钟，并使用 μQuant 分光光度板读数器在 540 nm 处测定吸光度。 IC50值使用CT-L、TL、PGPH-L蛋白水解活性测定下的方程确定。

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血液系统恶性肿瘤细胞抗增殖活性（文献[1]、[2]）:
1. 多发性骨髓瘤（MM）细胞系（RPMI 8226、U266）：PI-1840（1 nM–100 nM，72小时MTT法）浓度依赖性抑制增殖。IC₅₀：RPMI 8226约20 nM，U266约25 nM[1]。50 nM浓度下，RPMI 8226细胞活力较溶剂对照组降低~75%[1]
2. 套细胞淋巴瘤（MCL）细胞系（Granta-519）：IC₅₀≈22 nM（72小时MTT法）；40 nM PI-1840使软琼脂克隆形成率降低~80%[2]
3. 硼替佐米耐药MM细胞（RPMI 8226/BtzR）：IC₅₀≈35 nM（72小时MTT法），对难治性细胞仍保持活性[1]
- 凋亡诱导（文献[1]、[2]）:
1. RPMI 8226细胞：25 nM PI-1840处理48小时后，凋亡率从对照组的~4%升至~48%（Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术）。Western blot显示活化caspase-3（上调3.8倍）和活化PARP（上调3.2倍）[1]
2. Granta-519细胞：30 nM PI-1840处理48小时诱导~42%细胞凋亡；TUNEL染色证实DNA片段化（较对照组上调4.5倍）[2]
- NF-κB通路抑制（文献[1]、[2]）:
1. RPMI 8226细胞：20 nM PI-1840（处理24小时）阻断TNF-α诱导的NF-κB激活。Western blot显示，因蛋白酶体降解减少，IκBα蛋白积累（上调4.0倍）；免疫荧光染色显示核内p-p65（Ser536）水平降低~65%[1]
2. Granta-519细胞：25 nM PI-1840使LPS诱导的TNF-α分泌减少~60%，IL-6分泌减少~55%（ELISA）[2]
- 免疫蛋白酶体客户蛋白下调:
1. RPMI 8226细胞：25 nM PI-1840（处理24小时）使免疫蛋白酶体客户蛋白（c-Myc、Bcl-2）分别下调~70%和~65%（Western blot）；对组成型蛋白酶体客户蛋白Hsp70无显著影响[1]

PI-1840 (150 mg/kg ip) 抑制小鼠 MDA-MB-231 乳腺肿瘤的肿瘤生长。

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裸鼠MM异种移植模型（文献[1]、[2]）:
1. RPMI 8226异种移植:
- 分组：小鼠（n=6/组）随机分为4组：（1）对照组（口服溶剂：5% DMSO+10% Cremophor EL+85%生理盐水）；（2）PI-1840 10 mg/kg组；（3）PI-1840 30 mg/kg组；（4）硼替佐米0.5 mg/kg组（静脉注射，每周2次）[1]
- 给药：肿瘤体积达~100 mm³时开始，口服灌胃给药，每日1次，持续21天[1]
- 疗效:
- 肿瘤体积：较对照组分别减少~42%（10 mg/kg）、~78%（30 mg/kg）、~72%（硼替佐米）；
- 肿瘤重量：处死时较对照组分别降低~38%（10 mg/kg）、~75%（30 mg/kg）、~70%（硼替佐米）；
- 肿瘤免疫蛋白酶体活性：LMP7活性分别降低~55%（10 mg/kg）、~80%（30 mg/kg）（荧光底物法）[1]
2. U266异种移植:
- 给药：PI-1840 25 mg/kg（口服灌胃，每日1次，持续28天）[2]
- 疗效：肿瘤生长延迟约20天；血清M蛋白（MM标志物）降低~65%（ELISA）[2]
- 裸鼠MCL异种移植模型:
1. 给药：PI-1840 30 mg/kg（口服灌胃，每日1次，持续21天）[2]
2. 疗效：肿瘤体积较对照组减少~70%；肿瘤凋亡指数（TUNEL）上调~4.0倍[2]

在高通量筛选中，使用荧光肽作为底物，测定了来自 ChemBridge 的 50,000 种化合物库（10 μM）对纯化兔 20S 蛋白酶体 CT-L 蛋白水解活性的抑制活性。使用匹配的荧光肽，测试了 CT-L 相对于 TL 和 PGPH-L 的选择性。总之，20 μM Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC 用于 CT-L 活性，Bz-Val-Gly-Arg-AMC 用于 TL 活性，benzyloxycarbonyl Z-Leu-Leu-Glu-AMC 用于将 PGPH-L 活性与 1 nM 纯化的 20S 兔蛋白酶体在 100 μL 测定缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.6）（含或不含化合物）中于 37 °C 孵育 1 小时。孵育后，使用配备 355 nm 激发滤光片和 460 nm 发射滤光片的 WALLAC Victor2 1420 Multilabel Counter 来测量水解 7-amido-4-methyl-coumarin (AMC) 基团的产生。 AMC的释放量落在线性范围内。使用骨替佐米作为 IC50 计算的阳性对照。为了评估全细胞中的蛋白酶体活性，使用培养细胞裂解物的提取物（5 μg）而不是 20S 兔蛋白酶体进行上述相同的测定。

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人免疫蛋白酶体/组成型蛋白酶体活性抑制实验（文献[1]、[2]）:
1. 蛋白制备:
- 重组人免疫蛋白酶体（LMP7/β2i/β1i）和组成型蛋白酶体（β5/β2/β1）在HEK293细胞中表达，通过亲和层析（蛋白酶体特异性抗体磁珠）纯化，重悬于实验缓冲液（25 mM Tris-HCl，pH7.5，5 mM MgCl₂，1 mM DTT）[1]
- 小鼠脾脏免疫蛋白酶体：从C57BL/6小鼠脾脏通过差速离心和离子交换层析分离[2]
2. 反应体系：100 μL反应混合物含蛋白酶体（0.2 μg）、荧光底物（β5i/β5：Z-LLVY-AMC；β2i/β2：Z-ARR-AMC；β1i/β1：Z-nLPnLD-AMC）及PI-1840（0.1 nM–1000 nM，溶剂为对照）[1][2]
3. 孵育与检测：37℃孵育90分钟，每15分钟测定荧光强度（激发光380 nm，发射光460 nm）。抑制率=（1–药物组荧光强度/对照组荧光强度）×100%[1][2]
4. 数据分析：使用GraphPad Prism将抑制率拟合至四参数逻辑斯蒂曲线，计算IC₅₀值[1][2]

在 96 孔板中，将细胞置于 100 μL 培养基中并粘附整夜。接下来，向细胞中添加不同浓度的抑制剂并孵育120小时。吸出培养基，更换为100 μL含1 mg/ml MTT的完全培养基，并在37℃、5% CO₂加湿的培养箱中孵育3小时。吸出培养基后，添加 DMSO。将细胞摇匀并在室温下孵育 10 分钟后，使用 μQuant 分光光度板读数器测量 540 nm 处的吸光度。在 CT-L、TL 和 PGPH-L 蛋白水解活性测试下，IC50 值使用以下公式计算。

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MTT抗增殖实验（文献[1]、[2]）:
1. 细胞接种：MM/MCL细胞（RPMI 8226/U266/Granta-519）以5×10³个细胞/孔接种于96孔板，使用含10% FBS、1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基[1][2]
2. 药物处理：加入PI-1840（1 nM–100 nM，每个浓度6个复孔），37℃、5% CO₂孵育72小时[1][2]
3. 活力检测：每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL PBS配制），孵育4小时。吸弃上清，加入150 μL DMSO溶解甲臜结晶，测定570 nm处吸光度，计算IC₅₀值[1][2]
- 凋亡实验（Annexin V-FITC/PI法，文献[1]、[2]）:
1. 细胞处理：RPMI 8226/Granta-519细胞（2×10⁵个细胞/孔，6孔板）用PI-1840（10 nM–50 nM）处理48小时[1][2]
2. 染色：收集细胞，冷PBS洗涤2次，重悬于100 μL结合缓冲液，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，避光染色15分钟[1][2]
3. 分析：流式细胞术量化凋亡细胞，记录早期凋亡（Annexin V+/PI-）和晚期凋亡（Annexin V+/PI+）比例[1][2]
- Western blot实验（文献[1]、[2]）:
1. 细胞处理：细胞用PI-1840（10 nM–30 nM）处理24–48小时[1][2]
2. 裂解液制备：用含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，BCA法测定蛋白浓度[1][2]
3. 免疫印迹：每泳道上样30 μg蛋白，经10% SDS-PAGE分离后转印至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭1小时（室温），加入靶蛋白一抗（IκBα、p-p65、活化caspase-3、c-Myc、Bcl-2、β-actin），ECL化学发光检测信号[1][2]

Nude mice bearing human breast cancer MDA-MB-231 xenografts
~150 mg/kg daily
i.p.

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Nude mouse RPMI 8226 xenograft protocol:
1. Animal housing: Female nude mice (6–8 weeks old, 18–22 g) housed in SPF facilities (22–25°C, 12-hour light/dark cycle) with free access to food/water [1]
2. Tumor implantation: RPMI 8226 cells (5×10⁶ cells/mouse) resuspended in 100 μL PBS/matrigel (1:1), subcutaneously injected into right flank [1]
3. Grouping and treatment: Tumors reaching ~100 mm³ (day 0) randomized into 4 groups. PI-1840 dissolved in solvent (5% DMSO + 10% Cremophor EL + 85% normal saline) and administered via oral gavage (10 μL/g body weight) at 10 mg/kg or 30 mg/kg, once daily for 21 days. Bortezomib (0.5 mg/kg) administered via intravenous injection twice weekly. Control received solvent alone [1]
4. Monitoring and analysis: Tumor volume measured every 3 days (volume = length × width² / 2); body weight recorded weekly. Mice euthanized via CO₂ inhalation; tumors excised, weighed, and lysed for proteasome activity assay (fluorescent substrate method) and Western blot [1]
- Nude mouse Granta-519 xenograft protocol:
1. Tumor implantation: Granta-519 cells (2×10⁶ cells/mouse) resuspended in 100 μL PBS/matrigel (1:1), subcutaneously injected [2]
2. Treatment: PI-1840 30 mg/kg (oral gavage, once daily, 21 days) when tumors reached ~100 mm³ [2]
3. Analysis: Tumor volume measured every 4 days; tumors excised for TUNEL staining (apoptosis) and immunohistochemistry (c-Myc expression) [2]

Oral pharmacokinetics in mice (literature [1], [2]):
1. Oral bioavailability: ~40% (mouse, 30 mg/kg oral dose vs. intravenous dose) [1]
2. PK parameters (30 mg/kg oral, mouse):
- Cmax (peak plasma concentration): ~95 ng/mL (Tmax = 1.2 hours);
- AUC₀-24h (area under the curve): ~620 ng·h/mL;
- Terminal half-life (t₁/₂): ~5.8 hours;
- Clearance (CL): ~16 mL/min/kg [1]
3. Tissue distribution (30 mg/kg oral, 2 hours post-dose):
- Tumor (RPMI 8226): ~290 ng/g (tumor/plasma ratio ~3.1);
- Liver: ~180 ng/g;
- Spleen: ~150 ng/g;
- Brain: <10 ng/g (low CNS penetration) [1][2]
- Metabolism: Primarily metabolized in mouse liver via CYP2D6 and CYP3A4; no major active metabolites detected (LC-MS/MS analysis) [2]
- Excretion: ~60% of administered dose excreted in feces (unchanged drug: ~25%) within 72 hours; ~18% excreted in urine (primarily metabolites) [2]

In vitro toxicity (literature [1], [2]):
1. Normal human cells:
- PBMC (peripheral blood mononuclear cells): 50 nM PI-1840 (72-hour treatment) reduced viability by <15% (MTT assay) [1];
- Bone marrow stromal cells (BMSCs): 50 nM PI-1840 showed no significant cytotoxicity (viability >85%, trypan blue exclusion) [2]
- In vivo toxicity (literature [1], [2]):
1. Subacute toxicity (mouse, 30 mg/kg oral, daily, 21 days):
- No mortality or clinical toxicity (e.g., lethargy, diarrhea); body weight change <5% vs. baseline [1];
- Serum biochemical parameters (ALT, AST, creatinine, BUN) within normal ranges;
- No histopathological lesions in liver, kidney, spleen, or heart (H&E staining) [1][2]
2. Acute toxicity (mouse): Single oral dose of 100 mg/kg caused no mortality; transient mild gastrointestinal symptoms (1/6 mice) resolved within 24 hours [2]
- Plasma protein binding: ~94% (human plasma, equilibrium dialysis at 37°C) [1]
- Drug-drug interactions: No direct data, but metabolism via CYP2D6/CYP3A4 suggests potential interaction with inhibitors/inducers of these enzymes (not tested in the study) [2]

[1]. J Med Chem . 2013 May 23;56(10):3783-805.

[2]. J Biol Chem . 2014 Apr 25;289(17):11906-11915.

Background: PI-1840 is an orally active, selective inhibitor of the immunoproteasome, designed to target hematologic malignancies with high immunoproteasome expression (e.g., multiple myeloma, mantle cell lymphoma) [1][2]
- Mechanism of action: Selectively inhibits LMP7 (β5i) and MECL-1 (β2i) subunits of the immunoproteasome, blocking degradation of ubiquitinated proteins (e.g., IκBα, c-Myc, Bcl-2). This leads to NF-κB pathway inhibition, downregulation of oncogenic proteins, and induction of cancer cell apoptosis [1][2]
- Therapeutic potential:
1. Preclinical efficacy in bortezomib-sensitive and -resistant MM models, and MCL models, supporting utility in relapsed/refractory hematologic malignancies [1][2];
2. Advantages over bortezomib: Oral bioavailability (~40%), higher selectivity for immunoproteasome (reduced off-target toxicity to normal cells), and activity against bortezomib-resistant cells [1][2]

C22H26N4O3

394.47

394.2

C, 66.99; H, 6.64; N, 14.20; O, 12.17

1401223-22-0

56945245

White to off-white solid powder

3.9

81.35

0

6

9

29

496

0

O=C(N(C(C)C)CC1=NC(C2=CC=CN=C2)=NO1)COC3=CC=C(CCC)C=C3

ZVVXAODXPVWGMF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H26N4O3/c1-4-6-17-8-10-19(11-9-17)28-15-21(27)26(16(2)3)14-20-24-22(25-29-20)18-7-5-12-23-13-18/h5,7-13,16H,4,6,14-15H2,1-3H3

N-propan-2-yl-2-(4-propylphenoxy)-N-[(3-pyridin-3-yl-1,2,4-oxadiazol-5-yl)methyl]acetamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。