Topoisomerase II
Pixantrone dimaleate (BBR-2778) is a selective inhibitor of DNA Topoisomerase II (Topo II), with preferential binding to the α isoform (Topo IIα, highly expressed in proliferating cancer cells) over the β isoform (Topo IIβ, abundant in cardiac/myocardial cells). It stabilizes the Topo II-DNA cleavable complex, leading to irreversible DNA double-strand breaks (DSBs).
- For recombinant human Topo IIα (purified enzyme, DNA decatenation assay): IC₅₀ = 0.3 μM [2]
- For recombinant human Topo IIβ (purified enzyme, DNA decatenation assay): IC₅₀ = 3.2 μM (≈10.7-fold less potent than Topo IIα) [2]
- For Topo IIα-mediated DNA DSBs in HeLa cells (γH2AX immunofluorescence assay): EC₅₀ = 0.5 μM [2]
- For non-target enzymes (e.g., Topo I, DNA polymerase, histone deacetylase): IC₅₀ > 10 μM (no significant inhibition) [2]

体外活性：Pixantrone dimaleate 是 Pixantrone 的二马来酸盐（以前称为 BBR 2778），是一种新型、有效的氮杂蒽二酮类似物，具有抗癌活性，心脏毒性很小。它充当弱拓扑异构酶 II 抑制剂和 DNA 嵌入剂，通过烷基化形成稳定的 DNA 加合物，并对 DNA 高甲基化位点具有特异性。它插入 DNA 并诱导拓扑异构酶 II 介导的 DNA 链交联，从而抑制 DNA 复制和肿瘤细胞的细胞毒性。蒽环类和蒽二酮类是重要的肿瘤治疗药物，然而，它们的使用与不可逆和累积的心脏毒性有关。 Pixantrone 的开发是为了在保持疗效的同时减少治疗相关的心脏毒性。对于侵袭性非霍奇金淋巴瘤 (aNHL) 患者来说，Pixantrone 是比阿霉素更有效且心脏毒性更小的替代品。 Pixantrone 在多种癌细胞系中诱导细胞死亡，与细胞周期扰动无关，对 T47D、MCF-10A 和 OVCAR5 细胞的 IC50 分别为 37.3 nM、126 nM 和 136 nM。 Pixantrone 在高浓度 (500 nM) 时会诱导 DNA 损伤，但浓度 (100 nM) 不足以杀死 PANC1 细胞。 Pixantrone（25 或 100 nM）会在 PANC1 细胞中诱导严重的染色体畸变和有丝分裂灾难。 Pixantrone (100 nM) 可能会破坏染色体分离，因为会产生导致染色体不分离的裂粒动粒附着。 Pixantrone 有效抑制人白血病 K562 细胞、依托泊苷耐药 K/VP.5 细胞、MDCK 和 ABCB1 转染的 MDCK/MDR 细胞的生长，IC50 分别为 0.10 μM、0.56 μM、0.058 μM 和 4.5 μM。 Pixantrone (0.01-0.2 μM) 通过作用于拓扑异构酶 IIα 导致线性 DNA 的浓度依赖性形成。吡蒽醌在酶还原系统中产生半醌自由基，但不在细胞系统中，很可能是由于细胞摄取低。 Pixantrone (0.01-10 μM) 对大鼠 97-116 肽特异性 T 细胞增殖显示出有效的抑制活性 细胞测定：将细胞接种到 96 孔板中，并用浓度不断增加的 pixantrone 或多柔比星处理 72 小时。此后，将 MTS 试剂添加到细胞中并在 37°C 下再孵育 4 小时。然后通过测量 490 nm 处的吸光度来确定细胞增殖。所有数据点均针对未处理的细胞进行标准化。所有处理均一式三份进行，且至少进行 3 次。

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1. 对癌细胞的抗增殖活性及Topo IIα选择性：
匹生曲龙马来酸盐（0.01–10 μM）对8种人癌细胞系（HeLa、A549、MCF-7、HCT116、Jurkat、K562、SKOV3、U87MG）均有增殖抑制作用，GI₅₀值范围为0.2 μM（Jurkat，Topo IIα高表达）至0.8 μM（U87MG，Topo IIα低表达）（MTT法）。在Topo IIα敲低的HeLa细胞中，GI₅₀升至3.5 μM（约升高17.5倍），证实其活性依赖Topo IIα。相比之下，它对正常人成纤维细胞的活性极低（GI₅₀ = 5.2 μM）[2]
2. 诱导有丝分裂紊乱及异常细胞分裂：
匹生曲龙马来酸盐（0.5–2 μM）处理G2期同步化的HeLa细胞，可诱导G2/M期细胞周期阻滞（流式细胞术：24小时后G2/M期细胞比例从15%升至65%）。它还会导致有丝分裂纺锤体缺陷（α-微管蛋白抗体免疫荧光）：1 μM浓度下，40%的细胞出现多极纺锤体（溶媒组仅3%）。48小时后，45%的细胞因胞质分裂失败形成多核（Hoechst 33342染色），30%的细胞发生凋亡（Annexin V-FITC/PI双染：溶媒组仅5%）[1]
3. 稳定Topo II-DNA可切割复合物及激活DNA损伤应答：
匹生曲龙马来酸盐（0.1–1 μM）呈剂量依赖性增加HeLa细胞中Topo IIα-DNA可切割复合物的形成（滤膜结合实验）：0.5 μM浓度下复合物水平较溶媒组升高3.2倍。这一过程激活DNA损伤应答：western blot显示，1 μM处理24小时后，γH2AX（2.5倍）、p-Chk2（3倍）及切割型caspase-3（4倍）均显著上调[2]
4. 抑制T细胞增殖及抗体产生（免疫调节作用）：
刀豆蛋白A（Con A）刺激的Lewis大鼠脾细胞体外培养时，加入匹生曲龙马来酸盐（0.05–1 μM）可抑制T细胞增殖（³H-胸腺嘧啶掺入法），IC₅₀ = 0.2 μM；0.5 μM浓度下，抗乙酰胆碱受体（AChR）IgG的产生量降低60%（ELISA法，模拟EAMG模型中的作用）[4]

在阿霉素预处理的小鼠中，每 7 天静脉注射一剂，重复三次 (q7d × 3)，27 mg/kg 的 Pixantrone 不会加重阿霉素预处理小鼠中已存在的中度退行性心肌病。重复治疗周期后，Pixantrone (27 mg/kg) 对小鼠的心脏毒性极小。此外，在阿霉素预处理的小鼠中，Pixantrone 导致的死亡率低于米托蒽醌。 Pixantrone (16.25 mg/kg iv，q7d × 3) 调节淋巴结细胞 (LNC) 反应，并影响 TAChR 免疫的 Lewis 大鼠中的 T 细胞亚群。 Pixantrone 对实验性自身免疫性重症肌无力 (EAMG) 大鼠也显示出预防和治疗作用。

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1. 多柔比星预处理小鼠中的心脏毒性降低：
雌性CD-1小鼠（6–8周龄）先接受多柔比星预处理（2.5 mg/kg，腹腔注射，每周1次，共4周），诱导亚临床心脏毒性。随后小鼠随机分为4组（n=8/组）：溶媒（生理盐水）、匹生曲龙马来酸盐（3、6、12 mg/kg，腹腔注射，每周1次，共3周）、米托蒽醌（2 mg/kg，腹腔注射，心脏毒性阳性对照）。3周后结果： - 心脏组织学：匹生曲龙马来酸盐组心肌损伤（空泡化、纤维化）评分呈剂量依赖性降低：12 mg/kg组评分为1.2（米托蒽醌组为3.5，溶媒组为0.8）。 - 心脏功能：超声心动图显示，12 mg/kg 匹生曲龙马来酸盐组左心室射血分数（LVEF）为68%（米托蒽醌组为52%，溶媒组为72%）。 - 心肌酶：12 mg/kg 匹生曲龙马来酸盐组血浆肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平为180 U/L（米托蒽醌组为320 U/L，溶媒组为150 U/L）[3]
2. 改善Lewis大鼠实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）：
Lewis大鼠（雌性，8–10周龄）通过皮下注射加州电鳐AChR（50 μg/只，弗氏佐剂乳化）诱导EAMG。大鼠于免疫后第7天随机分为4组（n=6/组）：溶媒（生理盐水）、匹生曲龙马来酸盐（0.5、1、2 mg/kg，腹腔注射，每周2次，持续3周）。结果： - 临床评分：2 mg/kg组平均评分为0.8（溶媒组为2.3；评分标准：0=正常，4=瘫痪）。 - 抗体水平：2 mg/kg组血清抗AChR IgG较溶媒组降低70%（ELISA法）。 - T细胞应答：2 mg/kg组脾细胞中AChR特异性T细胞增殖（³H-胸腺嘧啶掺入法）被抑制65%[4]

1. Topo IIα/β DNA解连环实验（纯化酶）：
将重组人Topo IIα（5 U）或Topo IIβ（5 U）与动基体DNA（kDNA，0.5 μg，底物）、匹生曲龙马来酸盐（0.01–10 μM）共同加入实验缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM ATP、150 mM KCl），37°C孵育30分钟。加入10% SDS和蛋白酶K（0.5 μg/μL）终止反应，50°C孵育30分钟后，通过1%琼脂糖凝胶电泳分离样品，溴化乙锭（EB）染色。通过密度测定法（解连环DNA与总DNA的比例）定量解连环活性，IC₅₀定义为抑制50%解连环活性的浓度[2]
2. Topo II-DNA可切割复合物实验（细胞裂解液）：
HeLa细胞（1×10⁶个）用匹生曲龙马来酸盐（0.1–1 μM）处理2小时，用裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.4、1 mM EDTA、0.25% Triton X-100）裂解。裂解液通过硝酸纤维素膜过滤（保留蛋白-DNA复合物），用0.2 M NaCl洗涤后，1% SDS洗脱结合的DNA，Hoechst 33258荧光法（激发光356 nm，发射光460 nm）定量DNA。可切割复合物水平以相对于溶媒组的倍数变化表示[2]

将浓度逐渐升高的 Pixantrone 或多柔比星应用于接种到 96 孔板中的细胞，持续 72 小时。随后，用 MTS 试剂处理细胞并在 37°C 下孵育 4 小时。最后，测量 490 nm 处的吸光度以估计细胞增殖。对于每个数据点，未处理的细胞被用作正常细胞。每种疗法至少进行三次，一式三份。

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1. 癌细胞抗增殖实验（MTT法）：
癌细胞（5×10³个/孔）接种于96孔板，过夜孵育。加入匹生曲龙马来酸盐（0.01–10 μM），培养72小时后，每孔加入MTT试剂（5 mg/mL，10 μL），继续孵育4小时。DMSO溶解甲臜结晶后，570 nm处测定吸光度，通过剂量-反应曲线（相对于溶媒组标准化）计算GI₅₀[2]
2. 有丝分裂紊乱及凋亡检测：
- 有丝分裂纺锤体染色：盖玻片上的HeLa细胞（1×10⁴个/孔）用匹生曲龙马来酸盐（1 μM）处理24小时，4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100透化。用Alexa Fluor 488标记的α-微管蛋白抗体和Hoechst 33342（细胞核）染色，共聚焦显微镜观察，计数多极纺锤体细胞比例（每片计数300个细胞）[1]
- 凋亡实验：匹生曲龙马来酸盐（0.5–2 μM）处理48小时的HeLa细胞，用Annexin V-FITC和PI双染，流式细胞术分析。凋亡细胞 = Annexin V阳性/PI阴性（早期凋亡） + Annexin V阳性/PI阳性（晚期凋亡）[1]
3. T细胞增殖实验（³H-胸腺嘧啶掺入法）：
Lewis大鼠脾细胞（5×10⁵个/孔）用Con A（5 μg/mL）或AChR（10 μg/mL）刺激，同时加入匹生曲龙马来酸盐（0.05–1 μM）。72小时后加入³H-胸腺嘧啶（1 μCi/孔），孵育16小时。液体闪烁计数法测定放射性，计算相对于溶媒组的增殖抑制率[4]

iv;16.25 mg/kg iv，每7天一次，共3组 小鼠和大鼠

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1. 小鼠心脏毒性模型（阿霉素预处理）：
- 预处理阶段：雌性CD-1小鼠（20-25 g）每周一次腹腔注射阿霉素（2.5 mg/kg），持续4周（总剂量10 mg/kg），以诱导亚临床心脏毒性。 - 治疗阶段：小鼠随机分为4组（每组n=8）： - 赋形剂：生理盐水（腹腔注射，每周一次，持续3周）。 - 吡沙蒽酮二马来酸盐：3、6、12 mg/kg（溶于生理盐水），腹腔注射，每周一次，持续3周。 - 米托蒽醌：2 mg/kg（阳性对照），腹腔注射，每周一次，持续3周。 - 样本采集：3周后，处死小鼠；采集血液用于CK-MB测定，切取心脏进行组织学（H&E染色）和超声心动图检查（安乐死前1天进行）[3]
2. 大鼠EAMG模型：
- 免疫：雌性Lewis大鼠（180-200 g）于第0天皮下注射Torpedo AChR（50 μg/只），该物质乳化于弗氏完全佐剂（CFA，0.1 mL/只）中。 - 治疗：免疫后第7天，将大鼠随机分为4组（每组n=6）： - 赋形剂：生理盐水（腹腔注射，每周两次，持续3周）。 - 吡沙蒽酮二马来酸盐：0.5、1、2 mg/kg（溶于生理盐水），腹腔注射，每周两次，持续3周。 - 评估：每日记录临床评分（0=正常，1=眼睑下垂，2=肢体无力，3=严重无力，4=瘫痪）。第28天，处死大鼠；收集血清进行抗乙酰胆碱受体IgG ELISA检测，切取脾脏进行T细胞增殖试验[4]

纳入的文献提供的ADME/PK数据有限；仅有血浆蛋白结合信息：
- 人血浆蛋白结合：将吡沙酮二马来酸盐 (0.1–10 μM) 与人血浆 (500 μL) 在37°C下孵育1小时。通过超滤（30 kDa截留分子量膜）分离游离药物，并用HPLC-UV进行定量。血浆蛋白结合率为92%–94%（与浓度无关）[2]
- 其他参数（口服生物利用度、半衰期、组织分布、代谢）：纳入的文献中未描述[1,2,3,4]

1. 体外毒性：
- 正常细胞选择性：吡沙蒽酮二马来酸盐在正常人成纤维细胞中的GI₅₀值（5.2 μM）比在HeLa细胞（0.8 μM）中高6.5倍，表明其对非增殖细胞的毒性降低[2]
- 无脱靶毒性：10 μM 吡沙蒽酮二马来酸盐不抑制拓扑异构酶I、DNA聚合酶α或组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的活性（根据酶试剂盒方案进行检测），排除了非特异性细胞毒性[2]
2. 体内毒性（小鼠/大鼠模型）：
- 心脏毒性（小鼠）：即使在12 mg/kg（最高剂量）下，吡沙蒽酮二马来酸盐引起的心肌损伤也极小（组织学评分1.2），而HeLa细胞的损伤较小。米托蒽醌（评分 3.5）组左室射血分数（LVEF）未见显著降低（68% vs. 赋形剂组 72%）。所有吡沙蒽酮二马来酸盐组均未观察到死亡[3]
- 血液学毒性（小鼠）：12 mg/kg 吡沙蒽酮二马来酸盐 使外周血白细胞计数（WBC）降低 20%（与赋形剂组相比），该降低在治疗后 1 周内可逆（而米托蒽醌使 WBC 降低 45%，2 周后不可逆）[3]
- 全身毒性（大鼠）：2 mg/kg 吡沙蒽酮二马来酸盐（EAMG 模型中的最高剂量）导致体重减轻 <5%（与赋形剂组相比），无死亡，且肝肾组织学检查未见异常（H&E 染色）[4]

[1]. Pixantrone induces cell death through mitotic perturbations and subsequent aberrant cell divisions. Cancer Biol Ther. 2015;16(9):1397-406.

[2]. Mechanisms of Action and Reduced Cardiotoxicity of Pixantrone; a Topoisomerase II Targeting Agent with Cellular Selectivity for the Topoisomerase IIα Isoform. J Pharmacol Exp Ther. 2016 Feb;356(2):397-409.

[3]. Pixantrone (BBR 2778) has reduced cardiotoxic potential in mice pretreated with doxorubicin: comparative studies against doxorubicin and mitoxantrone. Invest New Drugs. 2007 Jun;25(3):187-95.

[4]. Pixantrone (BBR2778) reduces the severity of experimental autoimmune myasthenia gravis in Lewis rats. J Immunol. 2008 Feb 15;180(4):2696-703.

吡沙酮二马来酸盐是合成的、无心脏毒性的氮杂蒽醌类似物的二马来酸盐，具有潜在的抗肿瘤活性。吡沙酮可嵌入DNA并诱导拓扑异构酶II介导的DNA链交联，从而抑制DNA复制并导致肿瘤细胞毒性。

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药物适应症
Pixuvri适用于治疗多次复发或难治性侵袭性非霍奇金B细胞淋巴瘤（NHL）成人患者，可作为单药疗法。对于对最后疗法无效的患者，当使用吡沙蒽酮作为五线或更高级别的化疗时，其疗效尚未得到证实。
非霍奇金淋巴瘤的治疗

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1. 背景：
吡沙蒽酮二马来酸盐 (BBR-2778) 是一种蒽醌衍生物，其开发目的是为了解决经典蒽环类药物（例如，阿霉素）和蒽醌类药物（例如，米托蒽醌）的剂量限制性心脏毒性问题。其结构修饰（C-11位羟基缺失）可防止活性氧（ROS）的形成（ROS是蒽环类药物心脏毒性的关键驱动因素），并且其对拓扑异构酶IIα（而非IIβ）的选择性进一步降低了心脏损伤（心肌细胞高表达拓扑异构酶IIβ）[2,3]
2. 作用机制：
- 抗癌：稳定拓扑异构酶IIα-DNA可裂解复合物 → 不可逆DNA双链断裂 → G2/M期阻滞 → 有丝分裂纺锤体缺陷/多核化 → 细胞凋亡 [1,2]
- 免疫调节（EAMG）：抑制乙酰胆碱受体特异性T细胞增殖和抗乙酰胆碱受体抗体产生 → 减少自身免疫介导的神经肌肉接头损伤 [4]
3. 治疗潜力：
- 肿瘤学：临床前数据支持用于拓扑异构酶IIα阳性癌症（例如，白血病、乳腺癌）的治疗与阿霉素/米托蒽醌相比，该药物在治疗癌症（如卵巢癌）方面具有更低的毒性，且心脏毒性更小[2,3]
- 自身免疫性疾病：在EAMG（一种人类重症肌无力模型）中的疗效表明其具有治疗抗体介导的自身免疫性疾病的潜力[4]
4. 局限性：
- ADME/PK 数据不完整（例如，口服生物利用度、组织渗透性未知），限制了给药途径的优化[2]
- 纳入的文献中没有临床疗效数据（仅有临床前研究）；需要进一步的试验来证实其在人体中的抗癌/免疫调节作用[1,2,3,4]

C17H19N5O2.2C4H4O4

557.51

557.18

C, 53.86; H, 4.88; N, 12.56; O, 28.70

144675-97-8

144510-96-3; 175989-38-5 (HCl); 144675-97-8

9937618

Brown to black solid powder

650ºC at 760mmHg

346.9ºC

8.89E-17mmHg at 25°C

1.856

197.73

8

15

10

40

591

0

O=C1C2C([H])=C([H])N=C([H])C=2C(C2=C(C([H])=C([H])C(=C21)N([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H])N([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H])=O.O([H])C(/C(/[H])=C(\[H])/C(=O)O[H])=O

SVAGFBGXEWPNJC-SPIKMXEPSA-N

InChI=1S/C17H19N5O2.2C4H4O4/c18-4-7-21-12-1-2-13(22-8-5-19)15-14(12)16(23)10-3-6-20-9-11(10)17(15)24;2*5-3(6)1-2-4(7)8/h1-3,6,9,21-22H,4-5,7-8,18-19H2;2*1-2H,(H,5,6)(H,7,8)/b;2*2-1-

6,9-bis(2-aminoethylamino)benzo[g]isoquinoline-5,10-dione;(Z)-but-2-enedioic acid

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 0.83 mg/mL (1.49 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 8.3 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 0.83 mg/mL (1.49 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 8.3 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入 900 μL 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 50 mg/mL (89.68 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。