YL-939

YL939 binds to prohibitin 2 (PHB2) with a Kd value of 3.43 μM as determined by surface plasmon resonance (SPR) assay. The binding induces a thermal shift (ΔTm) of 2.65°C in differential scanning fluorimetry (DSF) assay. Molecular docking predicted that YL939 forms two hydrogen bonds: one between the nitrogen atom of the pyrazole ring and residue D82, and another between the nitrogen atom of the piperidine ring and residue D127. The distal phenyl group forms hydrophobic interactions with residues V43 and I80. Mutation of D82A and D127A almost abolished the binding of YL939 to PHB2. [1]
YL-939 targets the Prohibitin 2 (PHB2) protein. It binds directly to PHB2 with a Kd of 3.43 microM as determined by surface plasmon resonance (SPR) assays. PHB2 is a multifunctional scaffold protein involved in various cellular processes, including mitochondrial function, cell cycle regulation, and apoptosis. YL-939 specifically protects cells from ferroptosis by modulating the PHB2/ferritin/iron axis, distinguishing it from inhibitors of other cell death pathways.

YL939 能保护细胞免受 erastin 诱导的铁死亡，其 EC50 值分别为：ES-2 细胞 0.09 μM，HT1080 细胞 0.14 μM，Miapaca-2 细胞 0.25 μM，Calu-1 细胞 0.16 μM，HCT116 细胞 0.16 μM，以及 SHSYSY 细胞 0.24 μM。[1] YL939 还能保护细胞免受其他铁死亡诱导剂（包括 RSL3 和 ML210）的诱导。[1] YL939 不能挽救硼替佐米诱导的细胞凋亡、TNFα/Smac 模拟物/zVAD-FMK (TSZ) 诱导的坏死性凋亡、尼日利亚菌素诱导的细胞焦亡或 elesclomol/CuCl2 诱导的铜死亡，表明其对铁死亡具有特异性。 [1]透射电镜结果显示，YL939（5 μM，10 h）可保护线粒体嵴免受erastin诱导的线粒体外膜破裂和线粒体嵴消失。[1]YL939处理不影响GSH水平，但显著降低了丙二醛（MDA）水平。YL939处理显著降低了erastin诱导的胞质ROS（H2DCFDA）、脂质ROS（C11-BODIPY）和线粒体ROS（MitoSox）。[1]YL939处理呈剂量依赖性地上调铁蛋白（FTH1和FTL）及其mRNA表达，并呈剂量依赖性地降低erastin处理引起的细胞内铁水平升高。YL939处理以浓度依赖的方式增加erastin处理细胞中NCOA4和铁蛋白水平，表明其抑制了铁蛋白自噬。 [1]
YL939在浓度低于3 μM时对六种正常细胞系（L02、LX-2、Beas-2b、HUVEC、Arpe和hTERT-HPNE）未显示出明显的细胞毒性，但在浓度高于3 μM时则显示出明显的细胞毒性。[1]

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YL-939（0.01-10 μM）可显著保护HT-1080、Miapaca-2、Calu-1、HCT116和SHSY5Y细胞免受铁死亡（IC50值分别为0.14 μM、0.25 μM、0.16 μM和0.16 μM）。0.24微克/毫克[1]。YL-939（5 μM；10小时；ES-2细胞）可降低胞质溶胶和膜脂中的活性氧（ROS）水平[1]。 PHB2 是 YL-939（5 μM；1-10 小时；ES-2 细胞）的生物靶点 [1]。YL-939（3 μM；10 小时；ES-2 细胞）通过提高铁蛋白表达和阻断自噬体/溶酶体，实现浓度依赖性的铁蛋白自噬抑制。

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体外实验表明，YL-939 能特异性地保护多种细胞系免受 erastin 诱导的铁死亡。它在 HT1080 细胞中表现出强效的保护作用，EC50 值为 0.14 uM，在 ES-2 细胞中为 0.09 uM。YL-939 不抑制细胞凋亡、坏死性凋亡、细胞焦亡或铜死亡，凸显了其对铁死亡的选择性。它以剂量依赖的方式降低 erastin 升高的细胞内铁水平，上调铁蛋白及其 mRNA 的表达，并阻断自噬体/溶酶体，从而抑制铁蛋白自噬。YL-939 不影响目前已知的调控铁死亡的信号通路。

在对乙酰氨基酚 (APAP) 诱导的急性肝损伤模型中，YL939 可减轻肝损伤。雄性 C57BL/6 小鼠在腹腔注射 APAP (500 mg/kg) 前 2 小时预先腹腔注射 YL939 (3 mg/kg)。APAP 注射 6 小时后，与单独使用 APAP 相比，YL939 治疗显著降低了血清 AST 和 ALT 水平。YL939 还降低了血清和肝脏 MDA 水平。YL939 治疗增加了肝脏铁蛋白（FTH1 和 FTL）及其 mRNA 的表达。组织学分析（H&E 染色）显示，YL939 可减轻 APAP 诱导的肝损伤。[1] 在对乙酰氨基酚 (APAP) 诱导的急性肝损伤模型中，YL-939 (3 mg/kg；腹腔注射；单次注射) 可减轻肝损伤。[1]

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在体内，YL-939（3 mg/kg）可减轻对乙酰氨基酚（APAP）诱导的急性肝损伤模型中的肝损伤，而铁死亡已知与该模型相关。它能保护PHB2免受蛋白酶的降解，表明二者之间存在直接相互作用。YL-939对PHB2的同工酶PHB1以及VDAC1和VDAC2均无影响，表明其对PHB2具有特异性。其在体内减轻急性肝损伤的疗效凸显了其作为治疗铁死亡相关疾病的潜在价值。

YL939表面等离子共振(SPR)检测：将PHB2¹⁻¹⁹⁴蛋白固定在CMS传感器芯片上。将不同浓度的YL939溶液流过芯片。流速为10 μL/min，接触时间为120秒，解离时间为100秒。YL939与PHB2结合的Kd值为3.43 μM。使用YL447（一种无活性类似物）作为阴性对照，未观察到结合。[1]
差示扫描荧光法(DSF)检测：每个孔中加入9.8 μL蛋白和SYPRO Orange混合物，并与0.2 μL化合物混合（最终浓度为200 μM化合物，10 μM蛋白，溶于20 mM Hepes pH 7.5、150 mM NaCl缓冲液中）。通过从 25°C 升温至 95°C（升温速率为 1°C/分钟）实现热变性。YL939 诱导的热转变温度 (ΔTm) 为 2.65°C。[1]
DPPH 自由基清除试验：YL939 (50 μM) 未显示抗氧化活性。[1]
基于菲罗嗪的比色法铁螯合试验：YL939 (50 μM) 未显示铁螯合能力。[1]

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利用表面等离子共振 (SPR) 检测方法评估 YL-939 与 PHB2 的直接结合。将重组 PHB2 蛋白固定在传感器芯片上。向芯片表面注入不同浓度的 YL-939（例如，0.1-100 uM）。利用所得的传感器图谱计算平衡解离常数 (Kd)。该检测方法证实 YL-939 与 PHB2 相互作用的 Kd 值为 3.43 uM，量化了该化合物与其靶标的直接结合亲和力。

YL939 细胞活力检测（MTT/CCK-8）：将细胞接种于96孔板中，用化合物处理48小时，然后加入MTT或CCK-8试剂，孵育2-4小时。分别在490 nm（MTT）或450 nm（CCK-8）处测量吸光度。使用GraphPad Prism计算EC50值。[1]
细胞钙黄绿素450（活细胞）和7-AAD（死细胞）双重染色：用或不用erastin（10 μM）和YL939处理ES-2和HT1080细胞10小时，然后染色并成像。 [1] 透射电镜：将ES-2细胞用DMSO、erastin（10 μM）或erastin加YL939（5 μM）处理10小时，用3%戊二醛固定，再用1%四氧化锇固定，包埋于环氧树脂中，切片（50 nm），用醋酸铀和柠檬酸铅染色，并进行观察。[1] 细胞内ROS检测：处理10小时后收集细胞，重悬于HBSS中，分别用H2DCFDA（5 μM）染色以检测胞质ROS，用C11-BODIPY（2 μM）染色以检测脂质ROS，或用MitoSOX（5 μM）染色以检测线粒体ROS，在37°C孵育10分钟，并通过流式细胞术进行分析（≥10,000个细胞）。 [1]
细胞内MDA检测：裂解细胞，与MDA工作液（0.37% TBA加抗氧化剂）混合，100℃加热15分钟，冷却，离心，并在532 nm处测定吸光度。[1]
细胞内GSH检测：裂解细胞，并根据制造商说明使用GSH检测试剂盒测定GSH水平。[1]
Western blot分析：在含有蛋白酶抑制剂混合物和PMSF的NP-40裂解缓冲液中裂解细胞。蛋白质经12% SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭，4℃孵育一抗（1:1000）过夜，37℃孵育HRP标记的二抗（1:5000）1小时，最后用ECL显色。所用抗体：PHB2、VDAC1、VDAC2、PHB1、α-微管蛋白、β-肌动蛋白、SLC7A11、GPX4、TFR1、FPN、DMT1、铁蛋白、NCOA4、FTH1、FTL。[1]
RT-qPCR：提取总RNA，反转录为cDNA，并使用SYBR Green进行qPCR。所用引物：PHB2、FTH1、FTL、DMT1、TFR1、FSP1、DHODH、GCH1、GAPDH。表达量以GAPDH进行标准化。[1]
siRNA转染：使用Lipofectamine 2000将50 nM siPHB2转染至ES-2细胞中，转染24小时。PHB2 siRNA#1序列：5'-CUACAGAUGGUAGAAUUCUTT-3'； siRNA#2：5'-CUUGAGAAGCCAAAACCAGUTT-3'；siRNA#3：5'-CACAGAAGCUGAUCUAUUCUTT-3'。[1]
慢病毒转染：shPHB2#1序列：5'-CCAGAATATCTCCAAGACGAT-3'；shPHB2#2序列：5'-AAGAACCCTGGCTACATAAA-3'。为实现PHB2过表达，将PHB2序列插入pLVX-IRES-Zsgreen1载体。[1]
Fe²⁺检测：根据制造商说明，使用Fe²⁺检测试剂盒或荧光成像探针（BioTracker 575 Red Fe2+ Dye）检测细胞内铁。 [1]

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： ES-2 细胞
测试浓度： 5 μM
孵育时间： 1、5、7.5 和 10 小时
实验结果： 探针可下拉 PHB2 蛋白。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： ES-2 细胞
测试浓度： 3 μM
孵育时间： 10 小时
实验结果： 以剂量依赖的方式增加核受体共激活因子 4 (NCOA4) 的表达。

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在铁死亡保护实验中，将HT1080（纤维肉瘤）或ES-2（卵巢透明细胞癌）等细胞接种于96孔板中。细胞预先用不同浓度的YL-939（例如0.001-10 uM）处理1小时，然后用致死浓度的erastin（例如5-10 uM）诱导铁死亡。孵育24-48小时后，使用标准的MTT或CellTiter-Glo法检测细胞活力。通过拟合剂量反应曲线计算保护作用的EC50值。关键指标包括脂质ROS水平（例如使用C11-BODIPY 581/591染料）和细胞内铁水平。

YL939对乙酰氨基酚（APAP）诱导的急性肝损伤模型：采用4-5周龄雄性C57BL/6小鼠。将YL939溶于溶剂（5% DMSO + 3% HS-15 Solutol + 92%生理盐水）中，以3 mg/kg的剂量腹腔注射给药。两小时后，腹腔注射APAP（500 mg/kg，溶于生理盐水）。APAP注射六小时后处死小鼠。分离血清，使用全自动生化分析仪检测AST和ALT。取肝脏组织：一部分迅速置于液氮中冷冻，用于蛋白质和mRNA表达分析；另一部分用4%多聚甲醛固定，用于HE染色和免疫组织化学分析。每组使用8只小鼠（血清AST/ALT检测n=4，MDA检测n=6，蛋白质和mRNA表达分析n=2-3）。 [1]

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动物/疾病模型：对乙酰氨基酚（APAP）诱导的雄性C57BL/6J小鼠[1]
剂量： 3 mg/kg
给药途径：腹腔注射（ip）；单次注射
实验结果：抑制了接受APAP的雄性C57BL/J6小鼠肝组织中的细胞死亡和炎症浸润。

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对于对乙酰氨基酚（APAP）诱导的急性肝损伤模型，雄性C57BL/6小鼠禁食过夜。腹腔注射YL-939，剂量为3 mg/kg。一小时后，腹腔注射肝毒性剂量的APAP（例如300 mg/kg）诱导肝毒性。在APAP注射后6-24小时处死小鼠。收集血清以检测肝损伤标志物，如丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）。采集肝组织进行组织病理学分析（HE染色），并检测铁死亡标志物，如脂质过氧化（丙二醛水平）和铁含量。

公开文献中关于YL-939的详细药代动力学(PK)数据有限。作为一种分子量为426.52 g/mol的小分子，预计其性质适合体内给药。根据其溶解度，该化合物通常配制成10% DMSO生理盐水等溶剂用于体内研究。研究人员应进行初步PK研究，以确定其特定实验模型中的血浆半衰期、Cmax和生物利用度等参数。

在浓度低于 3 μM 时，YL939 对六种正常细胞系（L02、LX-2、Beas-2b、HUVEC、Arpe 和 hTERT-HPNE）未显示出明显的细胞毒性，但在浓度高于 3 μM 时则显示出明显的细胞毒性。[1] 在对乙酰氨基酚 (APAP) 诱导的急性肝损伤模型中，腹腔注射 3 mg/kg 剂量未报告死亡或显著不良反应。未具体报告体重变化。[1]

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目前已发表的YL-939毒理学数据仅限于体外细胞活力研究。在基于细胞的检测中，YL-939在通常用于铁死亡保护的浓度（例如0.09-0.14 μM）下无毒。在较高浓度下，可评估细胞活力以确定治疗窗口。在3 mg/kg剂量的急性肝损伤动物研究中，未报告明显的全身毒性症状。全面的毒理学分析尚未公开。

[1]. Non-classical ferroptosis inhibition by a small molecule targeting PHB2. Nat Commun. 2022 Dec 3;13(1):7473.

YL939 是通过从先导化合物 Cpd-015 开始的逐步优化过程发现的。优化过程主要集中在三个亚基上：4-甲氧基苯 (R1)、3,6-二氢-2H-吡喃 (R2) 和 1-甲基-4-苯基哌嗪 (R3)。[1]
从机制上讲，YL939 与 PHB2 结合可促进铁储存蛋白铁蛋白的表达，从而降低铁含量，进而降低铁死亡的易感性。PHB2 敲低或 YL939 处理可阻断自噬体/溶酶体并抑制铁蛋白自噬。[1]
YL939 不影响 GPX4 信号通路关键组分（SLC7A11、GPX4）的表达，也不影响 FSP1、GCH1 和 DHODH（其他三个铁死亡防御通路的核心组分）的 mRNA 表达。 [1]四川大学已就YL939及其相关化合物申请了中国专利。[1]

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YL-939 是一种研究级化学探针，尚未获准用于临床。目前没有正在进行的临床试验。其作用机制与经典的铁死亡抑制剂不同，它靶向的是 PHB2/铁蛋白/铁轴，而非 GPX4。这种独特的机制使其成为解析 PHB2 和铁蛋白自噬在铁死亡中作用的宝贵工具。该化合物通常储存在 -20℃ 的环境中，避光防潮。仅供研究使用。

C25H26N6O

426.513544559479

426.216809

C, 70.40; H, 6.14; N, 19.70; O, 3.75

3023925-68-7

Off-white to light yellow solid powder

O1CC=C(CC1)C1C2=NC(C3C=CC=CC=3)=CN2C=C(C2C=NN(C=2)C2CCNCC2)N=1

YL-939; YL939; orb1744106; SCHEMBL31339950;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO :~100 mg/mL (~234.46 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.86 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。