COX-2; IL-1;βCaspase-3; Caspase-8; Caspase-9
Dopaminergic neurons - 6-OHDA is a neurotoxin that selectively destroys dopaminergic neurons by entering cells via dopamine transporters. It is widely used to induce Parkinson's disease (PD) symptoms in experimental models [1]
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- Cyclooxygenase-2 (COX-2) - 6-OHDA induces COX-2 expression and nuclear translocation in neuronal cells, leading to PGE2 synthesis and pro-inflammatory cytokine production [1]
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- EC50 values for cytotoxicity:
- Neuro-2a cells (mouse neuroblastoma): 111 μM (24 h incubation); 109 μM (48 h incubation) [1]
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- SH-SY5Y cells (human neuroblastoma): 118 μM (24 h incubation); 107 μM (48 h incubation) [1]
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氢溴酸（0-500 μM，24 小时）氧化多巴胺可浓度依赖性地降低 Neuro-2a 细胞的存活率和 SH-SY5Y 细胞的活力 [1]。氢溴酸（75-150 μM，0-24 小时）氧化多巴胺可刺激 COX-2 的表达，并促进 IL-1β 等促炎细胞因子的产生和 PGE₂ 的生物合成 [1]。氢溴酸（0-150 μM，12 小时）可氧化多巴胺并促进其核转位 [1]。氢溴酸（75 μM，0-12 小时）氧化多巴胺可诱导 p38 的磷酸化 [3]。

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神经元细胞系中的细胞毒性：MTT 还原法测定显示，6-OHDA 浓度依赖性地降低小鼠 Neuro-2a 细胞和人 SH-SY5Y 细胞的活力。处理24小时后，EC50值约为110-118 μM。将孵育时间延长至48小时并未显著增加细胞毒性[1]。
- COX-2诱导：6-OHDA以时间依赖性方式快速且显著地诱导COX-2 mRNA表达。在Neuro-2a细胞中，75 μM和150 μM的6-OHDA在24小时时显著增加了COX-2 mRNA的表达（分别为P<0.05和P<0.01）。在 SH-SY5Y 细胞中，两种浓度均在 24 小时显著增加 COX-2 mRNA（分别为 P<0.05 和 P<0.001）[1]
。
- COX-2 核转位：免疫化学显示，6-OHDA 处理导致 Neuro-2a 和 SH-SY5Y 细胞中 COX-2 蛋白从细胞质转位到细胞核。核内COX-2的百分比从对照细胞的约25%显著增加到6-OHDA处理细胞的40-45%（P<0.001）[1]。
- PGE2生成：6-OHDA刺激显著增加了培养基中PGE2的水平：在Neuro-2a细胞中增加了近5倍（75 μM，24 h，P<0.01），在SH-SY5Y细胞中增加了3倍（150 μM，24 h，P<0.01）。这种增加可被COX-2抑制剂塞来昔布（10 μM）或mPGES-1抑制剂MPO-0057（10 μM）预处理所阻断[1]。
- IL-1β诱导：6-OHDA处理显著上调了促炎细胞因子IL-1β mRNA的水平。在Neuro-2a细胞中，75 μM 6-OHDA在6小时时可增加IL-1β的表达（P<0.05），150 μM 6-OHDA在24小时时可增加IL-1β的表达（P<0.001）。在SH-SY5Y细胞中，150 μM 6-OHDA在6小时时可增加IL-1β的表达（P<0.05）[1]。- PGE2/EP2信号通路：在两种细胞系中，EP2受体拮抗剂TG4-155和TG6-10-1均能显著降低6-OHDA诱导的细胞毒性（P<0.05至P<0.001），而EP4拮抗剂GW627368X则无此作用。 EP2 拮抗剂也降低了 6-OHDA 诱导的 PGE2 分泌 [1]
。
- 与塞来昔布的比较：COX-2 抑制剂塞来昔布 (10-20 μM) 可阻断高达 35% 的 6-OHDA 诱导的细胞毒性，与 EP2 拮抗剂提供的保护作用相似，表明 COX-2 介导的损伤主要归因于 EP2 受体的激活 [1]
。

黑质多巴胺能神经元的退化是由氢溴酸氧化多巴胺（5 μg/2 μL，单侧注射到右侧纹状体）引起的[2]。

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环氧合酶-2 (COX-2) 可触发促炎过程，加剧多种神经系统疾病中的神经元退行性变和功能障碍，其主要机制是通过产生前列腺素E2 (PGE2) 来激活四种膜受体EP1-EP4。然而，究竟是哪种EP受体介导了COX-2/PGE2介导的神经元炎症和退行性变，目前尚不清楚，这可能取决于损伤类型和响应成分。本文中，我们证实，在用神经毒素6-羟基多巴胺 (6-OHDA) 处理后，小鼠Neuro-2a和人SH-SY5Y两种神经元细胞系中COX-2表达上调，并发生核转位，进而导致PGE2的生物合成和促炎细胞因子白细胞介素-1β的表达上调。抑制COX-2或微粒体前列腺素E合酶-1可抑制这些细胞中6-OHDA诱导的PGE2生成。用PGE2或EP2选择性激动剂布他前列素（butaprost）处理，而非EP4激动剂CAY10598处理，可增加两种细胞系中的cAMP反应。我们近期开发的新型选择性EP2拮抗剂TG4-155和TG6-10-1可阻断这些细胞中PGE2启动的cAMP生成，而EP4选择性拮抗剂GW627368X则无此作用。TG4-155、TG6-10-1或COX-2选择性抑制剂塞来昔布可显著阻断6-OHDA促进的细胞毒性，而GW627368X则无此作用。我们的研究结果表明，在6-OHDA处理后，PGE2受体EP2是Neuro-2a和SH-SY5Y细胞中COX-2活性启动的cAMP信号传导的关键介质，并参与氧化多巴胺介导的神经毒性[1]。

细胞活力检测[1]
细胞类型： Neuro-2a 细胞和 SH-SY5Y 细胞
测试浓度： 0-500 µM
孵育时间： 24 或 48 小时
实验结果： 以浓度依赖的方式诱导 Neuro-2a 细胞和 SH-SY5Y 细胞的神经毒性。对 SY5Y 细胞产生细胞毒性。在 Neuro-2a 细胞中，EC50 为 111 µM（孵育 24 小时）和 109 µM（孵育 48 小时）；在 SH-SY5Y 细胞中，EC50 为 118 µM（孵育 24 小时）和 107 µM（孵育 48 小时）。

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RT-PCR[1]
细胞类型： Neuro-2a 细胞和 SH-SY5Y 细胞
测试浓度： 75 或 150 µM
孵育时间： 0、6 或 24 小时
实验结果： COX-2 以时间依赖性方式快速且显著地诱导表达。诱导 COX-2 活化，其特征是表达诱导和核转位。培养基中 PGE2 的含量在 Neuro-2a 细胞 (75 µM) 中显著增加近 5 倍，在 SH-SY5Y 细胞 (150 µM) 中显著增加 3 倍。促炎细胞因子白细胞介素 1β (IL-1β) 在 Neuro-2a 细胞和 SH-SY5Y 细胞中均显著上调。

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细胞凋亡分析[3]
细胞类型：PC12细胞
测试浓度：0、25、50、75和150 μM
孵育时间：0、2、4、6、12和20小时
实验结果：诱导PC12细胞凋亡。以时间和浓度依赖的方式增加PC12细胞中caspase-3、-8和-9的活性。这些caspase活性在2-4小时增加，并在12小时达到最大值。以时间和浓度依赖的方式减少具有高线粒体膜电位（JC-1聚集体）的细胞。

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蛋白质印迹分析[3]
细胞类型：PC12细胞
测试浓度：75 μM
孵育时间：0、3、5、6、8、10和12小时
实验结果：p-p38水平随时间增加。

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细胞培养：Neuro-2a细胞培养于含10% FBS、1% MEM非必需氨基酸和青霉素/链霉素的DMEM培养基中。SH-SY5Y细胞培养于含10% FBS和青霉素/链霉素的50% EMEM + 50% Ham's F-12培养基中。两者均在37°C、5% CO₂条件下培养[1]。
- 细胞活力检测（MTT）：将细胞接种于96孔板（5,000个细胞/孔）。用不同浓度的6-OHDA处理24或48小时后，加入MTT（0.5 mg/mL），并在37°C下孵育4小时。将生成的甲臜溶解于DMSO中，并在540 nm处测定吸光度（参考波长为630 nm）。使用 OriginPro 软件 [1] 生成剂量反应曲线并计算 EC50 值。
- 免疫细胞化学：细胞用 4% 多聚甲醛固定，用 0.2% Triton X-100 透化，用 10% 马血清封闭，并与针对 NeuN、酪氨酸羟化酶 (TH) 或 COX-2 的一抗孵育过夜，随后与 Alexa Fluor 标记的二抗孵育，并用 DAPI 染色。使用 EVOS FL Auto Cell Imaging System 获取图像。使用 ImageJ 软件 [1] 对荧光强度进行定量。
- 定量 PCR (qPCR)：使用 Trizol 和 PureLink RNA mini kit 分离总 RNA。使用 SuperScript III One-Step RT-PCR System 从 1 μg 总 RNA 合成 cDNA。使用 SYBR Green PCR Master Mix 和 COX-2、IL-1β 和 GAPDH 的引物进行 qPCR。循环条件：95°C 2 分钟，95°C 15 秒，60°C 1 分钟，共 40 个循环。相对定量以 GAPDH 为内参进行标准化 [1]。
- PGE2 测定：将细胞培养于 24 孔板中（Neuro-2a 细胞每孔 90,000 个细胞；SH-SY5Y 细胞每孔 150,000 个细胞）。处理后，收集 50 μL 培养基，并根据制造商的方案使用 ELISA 法测定 PGE2 水平。在 450 nm 处测量吸光度 [1]。
- TR-FRET cAMP 检测：将细胞接种于 384 孔板中（每孔 4,000 个细胞），过夜培养。将培养基替换为含有 20 μM 罗利普兰的 HBSS 缓冲液。孵育 30 分钟后，用化合物处理细胞，然后用 EP 激动剂处理 40 分钟。用 cAMP-d2 和抗 cAMP 隐蔽物裂解细胞。在 340 nm 激发波长下，分别以 665 nm 和 590 nm 的双发射波长测量 FRET 信号。FRET 信号表示为 F665/F590 × 10⁴ [1]。

本研究旨在探讨白藜芦醇对6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的大鼠帕金森病的神经保护作用。6-OHDA诱导的帕金森病大鼠模型涉及慢性炎症、线粒体功能障碍和氧化应激，其中黑质多巴胺能神经元的丢失是主要病变。白藜芦醇已被证实具有抗炎作用，因此本研究采用6-OHDA诱导的帕金森病大鼠模型来检验其有益作用。成年Sprague-Dawley（SD）大鼠单侧纹状体注射6-OHDA（5 μg/2 μl），并通过旋转试验、超微组织病理学和分子改变分析来评估纹状体损伤。随后，研究人员对帕金森病大鼠每日口服给予不同剂量（10、20 和 40 mg/kg）的白藜芦醇，持续 10 周，以考察其保护作用。旋转试验（大鼠转圈次数）显示，在 6-羟基多巴胺 (6-OHDA) 损伤的帕金森病大鼠模型中，白藜芦醇给药两周后即可显著减轻阿扑吗啡诱导的大鼠转圈行为。超微结构分析表明，白藜芦醇减轻了 6-OHDA 诱导的大鼠黑质多巴胺能神经元染色质浓缩、线粒体肿胀和空泡化。此外，实时 RT-PCR 检测显示，白藜芦醇治疗还显著降低了黑质中 COX-2 和 TNF-α mRNA 的表达水平。Western blotting 也证实，黑质中 COX-2 蛋白的表达水平降低。这些结果表明，白藜芦醇对6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的帕金森病大鼠模型具有神经保护作用，这种保护作用与炎症反应的减轻有关。[2]

细胞毒性特征：6-OHDA可导致神经元细胞系浓度依赖性细胞死亡，暴露24-48小时后EC50值为107-118 μM。Neuro-2a和SH-SY5Y细胞均表现出相似的敏感性[1]
。
- 毒性机制：6-OHDA通过诱导COX-2促进神经元炎症，进而导致PGE2合成、IL-1β上调以及EP2受体介导的cAMP信号通路激活。这些炎症过程是6-OHDA诱导神经毒性的原因[1]
。

[1]. Cyclooxygenase-2 contributes to oxidopamine-mediated neuronal inflammation and injury via the prostaglandin E2 receptor EP2 subtype. Sci Rep. 2017 Aug 25;7(1):9459.

[2]. Neuroprotective effect of resveratrol on 6-OHDA-induced Parkinson's disease in rats. Eur J Pharmacol. 2008 Dec 14;600(1-3):78-82.

[3]. Cell-permeable cAMP analog suppresses 6-hydroxydopamine-induced apoptosis in PC12 cells through the activation of the Akt pathway. Brain Res. 2006 Oct 3;1113(1):10-23.

[4]. Autoxidation and neurotoxicity of 6-hydroxydopamine in the presence of some antioxidants: potential implication in relation to the pathogenesis of Parkinson's disease. J Neurochem. 2000 Apr;74(4):1605-12.

6-羟基多巴胺（6-OHDA）是一种神经递质类似物，它会耗竭神经末梢的去甲肾上腺素储备，导致大脑中多巴胺水平降低。其作用机制与细胞溶原性自由基的产生有关。

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化学特性和背景：6-OHDA（2,4,5-三羟基苯乙胺）是一种合成的多巴胺类似物。它是一种神经毒素，由于其能够通过多巴胺转运体介导的摄取选择性地破坏多巴胺能神经元，因此被广泛用于在实验动物中诱导帕金森病症状。其神经毒性的分子机制在很大程度上仍不清楚[1]
。
- 在帕金森病研究中的应用：6-OHDA常用于体外和体内帕金森病模型的构建。神经母细胞瘤细胞系 Neuro-2a（小鼠来源）和 SH-SY5Y（人来源）保留了黑质致密部 (SNpc) 神经元的许多特征，并被广泛用作体外模型来研究多巴胺能神经元中的炎症、氧化应激和细胞凋亡 [1]。
- 本研究的作用机制：本研究表明，6-OHDA 可快速诱导神经元细胞中 COX-2 的表达和核转位，从而导致 PGE2 的生物合成和促炎细胞因子 (IL-1β) 的产生。该神经毒素主要通过 PGE2 受体 EP2 亚型激活 cAMP 信号通路，而 EP2 受体抑制剂可对 6-OHDA 诱导的细胞毒性提供神经保护作用 [1]。
- 细胞培养中的给药：本研究在大多数实验中使用了 75 μM 和 150 μM 的 6-OHDA，这大致对应于基于细胞毒性曲线的 EC25 和 EC75 值。对于 Neuro-2a 细胞，使用 75 μM 的浓度；对于 SH-SY5Y 细胞，由于其在该浓度下 COX-2 诱导作用更强，因此使用 150 μM 的浓度 [1]。
- 时间进程：在 6 小时和 24 小时时间点检测了 6-OHDA 的作用。在两个时间点均观察到 COX-2 诱导、PGE2 生成和 IL-1β 上调，最大效应通常在 24 小时达到 [1]
。
- 来源：本研究中使用的 6-OHDA 购自 Sigma-Aldrich [1]
。

C8H12BRNO3

250.09

249

C, 38.42; H, 4.84; Br, 31.95; N, 5.60; O, 19.19

636-00-0

Oxidopamine hydrochloride;28094-15-7; 1199-18-4; 636-00-0 (HBr)

176170

Light brown to gray solid

406ºC at 760 mmHg

216-220 °C(lit.)

199.3ºC

1.963

86.71

5

4

2

13

142

0

OC1=CC(CCN)=C(O)C=C1O.[H]Br

MLACDGUOKDOLGC-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C8H11NO3.BrH/c9-2-1-5-3-7(11)8(12)4-6(5)10;/h3-4,10-12H,1-2,9H2;1H

2,4,5-Trihydroxyphenethylamine hydrobromide

6-Hydroxydopamine hydrobromide; 6-OHDA hydrobromide; 6-OHDA HBr; 6 OHDA HBr; 6OHDA HBr; 6-OHDA Hydrobromide; 6 OHDA Hydrobromide; 6OHDA Hydrobromide; 6-Hydroxydopamine hydrobromide; 636-00-0; Oxidopamine hydrobromide; Oxidopamine (hydrobromide); 6-hydroxydopamine hbr; 6-OHDA; 2,4,5-Trihydroxyphenethylamine hydrobromide; 5-(2-aminoethyl)benzene-1,2,4-triol hydrobromide; 6-Hydroxydopamine Hydrobromide; 6Hydroxydopamine Hydrobromide; 6 Hydroxydopamine Hydrobromide; 6-Hydroxydopamine HBr; 6 Hydroxydopamine HBr

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： (1). 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。  (2). 该产品在溶液状态不稳定，请现配现用。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~199.93 mM)
H2O : ~20 mg/mL (~79.97 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.00 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (8.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 50 mg/mL (199.93 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。