CSF-1R (IC50 = 1 nM); c-Kit (IC50 = 3.2 μM); PDGFRβ (IC50 = 4.8 μM); Flt3 (IC50 = 9.1 μM)

在骨髓源性巨噬细胞 (BMDM) 中，sotuletinib HydroHClide 抑制 CSF-1 悬浮液增殖 (EC50=67 nM) 并降低 CSF-1R 磷酸化，这同样受到 CSF-1R 抑制剂的抑制。至关重要的是，培养物中的盐酸索图替尼不影响任何 PDG 衍生肿瘤细胞系（全部 Csf-1r 阴性）、U-87 MG 人神经星瘤细胞的缺血，也不影响肿瘤细胞形成 PDG 球体。它还降低了 CRL-2467 星形胶质细胞、Ink4a/Arf/BMDM（PDG 遗传背景）和 NOD/SCID BMDM 的活力。 ..因此，盐酸索鲁替尼直接影响神经星瘤细胞缺血并预防 CSF-1R 破坏的巨噬细胞缺血 [1]。

在使用媒介物治疗的队列中，中位生存期为 5.7 周。盐酸索图替尼显着提高了长期生存率； 64.3% 接受媒介物治疗的患者达到了 26 周试验终点。选择这个终点是因为Ink4a/Arf/EGFR在大约30周时开始自发生成肿瘤，包括肉瘤和严重肿瘤。根据组织学研究，盐酸索鲁替尼长期耐受性良好，没有明显的副作用。根据组织学分级，所有接受媒介物治疗的小鼠的肿瘤均具有高级别神经星瘤。另一方面，盐酸索鲁替尼治疗的动物总体上表现出明显较小的肿瘤，并且55.6%的无症状小鼠在实验结束时没有可见的病变[1]。盐酸索图替尼治疗的肿瘤及其周围基质表现出 CSF1R 染色减少，且 CSF1R+ 基质巨噬细胞显着低于载体治疗的肿瘤（P<0.05）[2]。

BLZ945 是一种有效的、口服生物活性的、选择性的 CSF-1R（集落刺激因子 1 受体）抑制剂，IC50 为 1 nM，对其最接近的受体酪氨酸激酶同源物的选择性超过 1000 倍。
BLZ945， CSF-1R酪氨酸激酶的高选择性小分子抑制剂（比其他酪氨酸激酶高3200倍）；参考文献27)。在体外阻断实验中，将BLZ945和GW2580分别溶于10 mmol/L和1 mmol/L的DMSO中制备原液。在体内治疗方面，根据先前的研究，BLZ945溶解在20% Captisol中，剂量为16 mg/mL，每日灌胃剂量为200 mg/kg。[3]

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细胞因子分析：在卡罗林斯卡大学医院的核心设施中，通过27参数Luminex多路试验 分析从SK-N-BE(2)、SK-N-AS或SK-N-FI神经母细胞瘤细胞系中收集的培养基或上清液中的细胞因子含量。采用ELISA法测定中药中人或鼠M-CSF （CSF-1）的浓度。[3]

CD34+造血祖细胞的分化[3]
采用含有50 ng/mL GM-CSF和5 ng/mL tnf - α的900 μL培养基，24孔板培养CD34+细胞。或者，从上述三种人类神经母细胞瘤细胞系中收集的上清液以2:1的比例添加到祖细胞中。以培养液中维持的CD34+细胞为对照。为了阻断CSF-1R信号，将Sotuletinib (BLZ945) (500 nmol/L)添加到细胞因子成熟的细胞中或细胞因子与SK-N-BE(2)结合的上清液中。7天后，通过清洗和轻轻刮拭收集所有细胞，并通过流式细胞术或基于cfse的t细胞增殖试验评估细胞的表型和功能。

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人单核细胞-肿瘤共培养[3]
原代人单核细胞与人神经母细胞瘤细胞系共培养。简而言之，将单核细胞与4×105 SK-N-BE(2)、SK-N-AS或6×105 SK-N-FI神经母细胞瘤细胞在3ml培养基中的6孔板中共培养。未培养肿瘤细胞的单核细胞作为对照。64小时后，通过大力清洗细胞，然后轻轻刮板收获细胞。流式细胞术评价细胞表型变化，用微珠和质谱柱对HLA-DR+细胞进行分选。为了研究CSF-1R的作用，将500 μmol/L Sotuletinib (BLZ945) 或1 μmol/L GW2580加入到单核细胞或共培养中。

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小鼠骨髓细胞的分化[3]
抑制性骨髓细胞是根据先前描述的方案，从负基因型TH-MYCN小鼠的骨髓细胞中诱导的。简言之，将1×106分离的骨髓细胞在NHO2A肿瘤条件培养基（中药，1:1稀释至新鲜培养基）存在的6孔板中培养。作为对照，细胞在新鲜培养基或M-CSF （20 ng/mL）中培养。为了阻断CSF-1R信号，在培养物中加入1 μmol/L的Sotuletinib (BLZ945) 或GW2580，并加入DMSO作为对照。4天后，通过收集浮细胞和仔细刮拭孔贴壁细胞的方法收获细胞，随后进行流式细胞术分析或t细胞抑制实验。

小鼠：使用游标卡尺测量肿瘤体积，计算公式为：体积 = (宽度)² × 长度/2。在 MMTV-PyMT 小鼠研究中，56-63 日龄雌性小鼠分别接受 200 mg/kg 的 sotuletinib 或 20% Captisol 溶剂。根据肿瘤大小将小鼠随机分组。每周测量两次肿瘤体积，每日灌胃给药一次。每五天腹腔注射一次大鼠 IgG 对照或 5A1 大鼠抗小鼠 CSF1 中和抗体，剂量为 10 mg/kg。将 MMTV-PyMT 转基因小鼠的福尔马林固定石蜡包埋肺组织进行连续切片，并用苏木精-伊红染色，以确定肺转移情况。肿瘤区域的评估基于肿瘤大小（肿瘤直径）、肿瘤负荷（肿瘤总面积除以肺总面积）以及以单盲方式计数的单个转移灶总数。最终值取自整个肺深度的平均值。

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原位同种异体移植模型[2]
使用6-7周龄的雌性FVB/NJ小鼠和6-7周龄的雌性BALB/c裸鼠（CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl）。对于乳腺肿瘤病毒驱动的多瘤病毒中T抗原（MMTV-PyMT）原位同种异体移植模型，将10-13周龄雌性转基因MMTV-PyMT小鼠的自发性肿瘤混合，并用Liberase™（Roche）进行酶消化。将所得单细胞悬液立即按指定细胞剂量原位注射到同基因雌性FVB/NJ受体小鼠的单个乳腺脂肪垫中。对于CD45同种异型研究，从10-13周龄的MMTV-PyMT转基因雌性小鼠中取出自发性肿瘤，通过钝性分离法将其分割成3 mm的立方体。在雌性BALB/c裸鼠受体小鼠的乳腺脂肪垫上做一个小切口，将2个肿瘤样本放入脂肪垫内，并用手术钉封闭。5天后，重新打开伤口取出肿瘤样本。肿瘤按以下所述进行消化和分析。供体和受体小鼠在切除和植入前5天分别接受Sotuletinib (BLZ945)或载体处理，具体方法如下所述。

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CSF1信号拮抗剂在自发性肿瘤模型中的药理学研究[2]
使用游标卡尺测量肿瘤大小，并根据公式：体积 = (宽度)² × 长度/2 计算肿瘤体积。在MMTV-PyMT小鼠研究中，将56-63日龄的雌性小鼠根据肿瘤体积随机分组，并分别给予20% Captisol®溶剂或200 mg/kg的Sotuletinib (BLZ945)。每日一次灌胃给药，每周两次测量肿瘤体积。每5天腹腔注射10 mg/kg的5A1大鼠抗小鼠CSF1中和抗体或大鼠IgG对照。为了计算MMTV-PyMT转基因小鼠的肺转移情况，将福尔马林固定、石蜡包埋的肺组织进行连续切片，并用苏木精-伊红（H&E）染色。肿瘤区域的评分依据肿瘤负荷（肿瘤总面积除以肺总面积）、大小（肿瘤直径）以及以单盲方式计数的单个转移灶总数。将这些值在整个肺组织深度范围内取平均值，得到最终值。在K14-HPV16小鼠研究中，每2个月给雌性小鼠植入缓释17β-雌二醇颗粒，以诱导宫颈和阴道上皮发生鳞状细胞癌。^43,44 小鼠在6月龄时（即报道的宫颈癌发病年龄）进行随机分组，并用Sotuletinib (BLZ945)治疗1个月。为了确定 K14-HPV16 转基因小鼠的宫颈肿瘤体积，将福尔马林固定石蜡包埋的宫颈组织和肿瘤进行连续切片，以单盲方式对肿瘤面积进行评分，并将这些值乘以肿瘤深度。

[1]. SF-1R inhibition alters macrophage polarization and blocks glioma progression. Nat Med. 2013 Oct;19(10):1264-72.

[2]. CSF1R inhibition delays cervical and mammary tumor growth in murine models by attenuating the turnover of tumor-associated macrophages and enhancing infiltration by CD8+ T cells. Oncoimmunology. 2013 Dec 1;2(12):e26968.

[3]. Targeting Suppressive Myeloid Cells Potentiates Checkpoint Inhibitors to Control Spontaneous Neuroblastoma. Clin Cancer Res (2016) 22 (15): 3849–3859.

盐酸索妥替尼是一种口服生物利用度高的集落刺激因子1受体（CSF-1R；CSF1R）抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。CSF1R抑制剂BLZ945选择性地与肿瘤相关巨噬细胞（TAM）表面表达的CSF1R结合，阻断CSF1R的活性，并抑制CSF1R介导的信号转导通路。这抑制了TAM的活性和增殖，并重塑了现有TAM的免疫抑制特性。总之，这降低了肿瘤微环境中TAM介导的免疫抑制，重新激活了免疫系统，并增强了T细胞介导的抗肿瘤细胞反应。 CSF1R，又称巨噬细胞集落刺激因子受体 (M-CSFR) 和 CD115（分化簇 115），是其配体集落刺激因子 1 (CSF1) 的细胞表面受体；该受体在肿瘤微环境中由肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 过度表达，并在免疫抑制和诱导肿瘤细胞增殖中发挥重要作用。

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目的：神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤，高危患者即使接受积极的多模式治疗，预后仍然很差。神经母细胞瘤引起的炎症会导致抑制性髓系细胞的诱导，从而阻碍有效的抗肿瘤免疫反应。因此，我们试图通过消除髓系细胞介导的免疫抑制来增强抗肿瘤免疫力。
实验设计：通过分析神经母细胞瘤患者的基因组数据集来验证髓系细胞的预后价值。本研究利用新鲜分离的人类CD34+造血干细胞、原代人单核细胞和鼠骨髓细胞，通过体外培养模型，深入剖析了肿瘤来源因子对髓系造血和局部诱导抑制性髓系细胞的影响。为了检验BLZ945作为单药疗法或与免疫检查点抑制剂联合疗法的疗效，我们使用了一种可自发形成侵袭性神经母细胞瘤的转基因小鼠模型（TH-MYCN）。
结果：我们发现，浸润的CSF-1R+髓系细胞预示着神经母细胞瘤患者预后不良。体外实验表明，神经母细胞瘤来源因子会干扰髓系细胞的早期发育，并通过M-CSF/CSF-1R相互作用赋予人单核细胞抑制功能。在一种类似于高危人类神经母细胞瘤的转基因小鼠模型（TH-MYCN）中，使用选择性抑制剂（BLZ945）拮抗CSF-1R可以调节人和小鼠抑制性髓系细胞的诱导，并有效限制肿瘤进展。虽然免疫检查点抑制剂不足以控制肿瘤生长，但将BLZ945与PD-1/PD-L1阻断抗体联合使用可获得更佳的肿瘤控制效果。
结论：我们的研究结果表明CSF-1R信号在抑制性髓系细胞诱导过程中发挥着关键作用，并强调了其作为人类癌症免疫疗法的临床潜力。[3]

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肿瘤浸润巨噬细胞数量的增加与多种癌症（包括乳腺癌和前列腺癌）患者的不良预后相关。集落刺激因子1受体（CSF1R）信号通路驱动肿瘤相关巨噬细胞（TAM）募集至肿瘤微环境，并促进TAM向促肿瘤表型分化。目前有12项临床试验正在评估靶向CSF1/CSF1R信号通路的药物，用于治疗包括乳腺癌、白血病和胶质母细胞瘤在内的多种恶性肿瘤。研究表明，阻断CSF1R信号通路能够以组织特异性的方式显著减少巨噬细胞的数量。然而，仍需进一步研究其机制，以了解巨噬细胞的减少机制以及CSF1R抑制对其他肿瘤浸润免疫细胞的整体影响。我们使用高选择性小分子CSF1R抑制剂BLZ945，发现CSF1R抑制可降低肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的周转率，同时增加浸润宫颈癌和乳腺癌的CD8+ T细胞数量。具体而言，我们发现BLZ945可抑制小鼠乳腺肿瘤病毒驱动的多瘤病毒中T抗原（MMTV-PyMT）乳腺癌模型中恶性细胞的生长。此外，我们还发现BLZ945可抑制表达角蛋白14的人乳头瘤病毒16型（K14-HPV-16）转基因宫颈癌模型中的肿瘤进展。我们的研究结果表明，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）以CSF1R依赖的方式持续更新，并提示持续抑制CSF1R通路可能是维持有效巨噬细胞清除作为抗癌疗法的关键。[2]胶质母细胞瘤（GBM）包含多种分子亚型，包括前神经型GBM。大多数靶向胶质瘤细胞的治疗方法均告失败。一种替代策略是靶向胶质瘤微环境中的细胞，例如肿瘤相关巨噬细胞和小胶质细胞（TAM）。巨噬细胞的分化和存活依赖于集落刺激因子-1（CSF-1）。我们使用CSF-1受体（CSF-1R）抑制剂在小鼠前神经型GBM模型中靶向TAM，结果显著延长了小鼠的生存期并使已形成的肿瘤消退。此外，CSF-1R阻断还减缓了患者来源的胶质瘤异种移植瘤的颅内生长。出乎意料的是，经治疗的小鼠体内肿瘤相关巨噬细胞（TAM）并未减少。相反，胶质瘤分泌的因子，包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和干扰素-γ（IFN-γ），在CSF-1R抑制的情况下促进了TAM的存活。存活的TAM中替代激活的M2标志物的表达降低，这与肿瘤促进功能的受损相一致。这些基因特征与神经前体型胶质母细胞瘤（GBM）患者的生存期延长相关。我们的研究结果表明，TAM是神经前体型胶质瘤的一个有前景的治疗靶点，并证实了CSF-1R抑制在GBM治疗中的转化潜力。[1]

C20H23CLN4O3S

434.94

434.117

C, 55.23; H, 5.33; Cl, 8.15; N, 12.88; O, 11.04; S, 7.37

2222138-31-8

Sotuletinib;953769-46-5;Sotuletinib dihydrochloride;2222138-40-9

141759984

Light yellow to brown solid powder

125

4

7

5

29

540

2

N([C@@H]1CCCC[C@H]1O)C1=NC2=CC=C(C=C2S1)OC1=CC=NC(=C1)C(=O)NC.Cl

IHWOVMRZEIHNGY-SATBOSKTSA-N

InChI=1S/C20H22N4O3S.ClH/c1-21-19(26)16-10-13(8-9-22-16)27-12-6-7-15-18(11-12)28-20(24-15)23-14-4-2-3-5-17(14)25;/h6-11,14,17,25H,2-5H2,1H3,(H,21,26)(H,23,24);1H/t14-,17-;/m1./s1

4-((2-(((1R,2R)-2-hydroxycyclohexyl)amino)benzo[d]thiazol-6-yl)oxy)-N-methylpicolinamide hydrochloride

Sotuletinib HCl; Sotuletinib hydrochloride, Sotuletinib monohydrochloride; QJE0UTG9TS; BLZ-945 dihydrochloride; SOTULETINIB DIHYDROCHLORIDE; UNII-QJE0UTG9TS; 2222138-40-9; Sotuletinib (dihydrochloride); 2-Pyridinecarboxamide, 4-((2-(((1R,2R)-2-hydroxycyclohexyl)amino)-6-benzothiazolyl)oxy)-N-methyl-, hydrochloride (1:2); Sotuletinib dihydrochloride?; BLZ945; BLZ 945; BLZ-945;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~100 mg/mL (~229.92 mM)
DMSO : ~100 mg/mL (~229.92 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.75 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.75 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.75 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。