CSF-1R (IC50 = 1 nM); c-Kit (IC50 = 3.2 μM); PDGFRβ (IC50 = 4.8 μM); Flt3 (IC50 = 9.1 μM)
Colony-Stimulating Factor 1 Receptor (CSF1R) (IC50 = 1.2 nM for recombinant human CSF1R kinase); no activity against EGFR, MET, VEGFR2 (IC50 > 1000 nM) [1]
- Confirmed CSF1R as primary target (cervical/breast cancer model; no additional IC50 values) [2]
- Confirmed CSF1R targeting (neuroblastoma model; consistent with [1]’s IC50) [3]

在骨髓源性巨噬细胞 (BMDM) 中，BLZ945 特异性抑制 CSF-1 依赖性增殖，EC50 为 67nM，并降低 CSF-1R 磷酸化。 BLZ945 阻断巨噬细胞和神经胶质瘤细胞之间对彼此存活、增殖和/或极化的相互作用，从而促进肿瘤发生。激酶测定：BLZ945 是一种有效的、口服生物活性的、选择性的 CSF-1R（集落刺激因子 1 受体）抑制剂，IC50 为 1 nM，对其最接近的受体酪氨酸激酶同源物的选择性超过 1000 倍。细胞测定：使用MTT细胞增殖试剂盒测定细胞生长速率。简而言之，将细胞一式三份接种在 96 孔板中：神经胶质瘤细胞系每孔 1,000 个细胞，BMDM 和 CRL-2467 每孔 5 x 1,000 个细胞，HUVEC 和 HBMEC 细胞系每孔 2.5 x 1,000 个细胞。对于所有实验，介质每 48 小时更换一次。细胞在存在或不存在 6.7–6,700 nM BLZ945 或 8 μg/mL CSF-1R 中和抗体的情况下生长。 BMDM 和 CRL-2467 细胞分别补充 10 ng/mL 和 30 ng/mL 重组小鼠 CSF-1。根据制造商的方案，使用读板器通过比色分析检测 MTT 底物的还原，并在 SpectraMax 340pc 读板器上在 595 nm 和 750 nm 处进行测量。

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抑制巨噬细胞向M2型极化：10 nM Sotuletinib (BLZ945)处理人单核细胞48小时，M2型标志物（CD206）表达降低85%；M1型标志物（iNOS）表达升高2.3倍[1]
- 抑制肿瘤相关巨噬细胞（TAM）活力：从乳腺癌中分离的小鼠TAM（IC50 = 9.8 nM）；50 nM Sotuletinib处理24小时，TAM介导的胶质瘤细胞迁移减少72%（Transwell实验）[1][2]
- 增强CD8+T细胞活化：200 nM Sotuletinib处理后，与TAM共培养的CD8+T细胞IFN-γ分泌量升高3.5倍（ELISA检测）[2]
- 与抗PD-1联用增强神经母细胞瘤疗效：150 nM Sotuletinib + 10 μg/mL抗PD-1使神经母细胞瘤细胞活力降低80%（单药分别降低42%/38%）；协同指数=0.56[3]

在患有神经胶质瘤的小鼠中，BLZ945 通过抑制 CSF-1R 来阻止肿瘤进展并显着提高生存率。 BLZ945 还在体内抑制患者源性原神经肿瘤球和细胞系的原位肿瘤生长。 BLZ945（200 mg/kg，口服）可降低小鼠乳腺肿瘤病毒驱动的多瘤病毒中 T 抗原 (MMTV-PyMT) 乳腺癌模型和表达角蛋白 14 的人乳头瘤病毒 16 型 (K14-HPV- 16）宫颈癌转基因模型。

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原位GL261胶质瘤小鼠模型：口服Sotuletinib（30 mg/kg/天）持续21天，M2型TAM浸润减少78%；中位生存期从溶剂组25天延长至48天[1]
- 携带E0771乳腺癌的小鼠：口服Sotuletinib（25 mg/kg/天）持续28天，肿瘤生长抑制率（TGI）达75%；CD8+T细胞浸润增加2.8倍（流式细胞术）[2]
- TH-MYCN神经母细胞瘤小鼠：Sotuletinib（20 mg/kg/天，口服）+ 抗PD-1（10 mg/kg/3天，腹腔注射）持续35天，肿瘤体积减少83%（单药分别减少45%/40%）；50%小鼠实现肿瘤完全消退[3]
- 携带SiHa宫颈癌的小鼠：口服Sotuletinib（30 mg/kg/天）持续24天，TAM周转减少65%（BrdU标记）；肿瘤重量较溶剂组减少70%[2]

BLZ945 是一种有效的、口服生物活性的、选择性的 CSF-1R（集落刺激因子 1 受体）抑制剂，IC50 为 1 nM，对其最接近的受体酪氨酸激酶同源物的选择性超过 1000 倍。
BLZ945， CSF-1R酪氨酸激酶的高选择性小分子抑制剂（比其他酪氨酸激酶高3200倍）；参考文献27)。在体外阻断实验中，将BLZ945和GW2580分别溶于10 mmol/L和1 mmol/L的DMSO中制备原液。在体内治疗方面，根据先前的研究，BLZ945溶解在20% Captisol中，剂量为16 mg/mL，每日灌胃剂量为200 mg/kg。[3]

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细胞因子分析：在卡罗林斯卡大学医院的核心设施中，通过27参数Luminex多路试验 分析从SK-N-BE(2)、SK-N-AS或SK-N-FI神经母细胞瘤细胞系中收集的培养基或上清液中的细胞因子含量。采用ELISA法测定中药中人或鼠M-CSF （CSF-1）的浓度。[3]

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CSF1R激酶活性实验[1]：重组人CSF1R激酶结构域（50 ng/孔）与Sotuletinib（0.01-100 nM）在反应缓冲液（25 mM HEPES pH 7.5，10 mM MgCl₂，1 mM DTT，0.1 mM 钒酸钠）中于37°C孵育20分钟。加入10 μM ATP和荧光肽底物，30°C继续孵育60分钟。通过均相时间分辨荧光（HTRF，激发光340 nm，发射光665 nm）检测激酶活性；非线性回归计算IC50[1]

MTT细胞增殖试剂盒用于计算细胞生长速率。简而言之，96 孔板用于将细胞一式三份铺板：神经胶质瘤细胞系 1 ×10 3 细胞，BMDM 和 CRL-5 ×10 3 细胞2467 和 2.5 ×10 3 细胞（适用于 HUVEC 和 HBMEC 细胞系）。每 48 小时，所有实验中使用的培养基都会更换一次。细胞在有或没有 8 μg/mL CSF-1R 中和抗体或 6.7–6,700 nM sotuletinib 的情况下培养。 PDGC 系在 10,000 nM PTK787 或 10,000 nM STI571（用 10 mM DMSO 储备液稀释）存在下培养，以测试对 PDGFR 抑制的敏感性。除非另有说明，否则将制造商提供的 ECGF 添加到 HUVEC 和 HBMEC 细胞中。通过读板器和比色分析，遵循制造商的方案来检测 MTT 底物的还原。在加入 100 μL MTT 增溶试剂并在 37°C 下静置过夜之前，向每孔中加入 10 μL MTT 标记试剂并孵育 4 小时。使用 SpectraMax 340pc 酶标仪，轻轻地重悬混合物，并在 595 和 750 nm 处测量吸光度[1]。

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巨噬细胞极化实验[1]：人单核细胞接种于6孔板（2×10⁵个/孔），用Sotuletinib（1-100 nM）+ 20 ng/mL CSF-1处理48小时。细胞用CD206/iNOS抗体染色，流式细胞术分析；qPCR检测基因表达[1]
- TAM-胶质瘤共培养实验[1]：小鼠TAM（1×10⁴个/上室）用Sotuletinib（50-200 nM）处理2小时，与GL261胶质瘤细胞（5×10³个/下室）在Transwell板中共培养。24小时后，固定并计数迁移的胶质瘤细胞[1]
- CD8+T细胞活化实验[2]：从小鼠脾脏分离CD8+T细胞，与经Sotuletinib（100-200 nM）处理的TAM共培养72小时。收集上清液，ELISA检测IFN-γ水平[2]
- 神经母细胞瘤联用实验[3]：SK-N-SH神经母细胞瘤细胞接种于96孔板（5×10³个/孔），用Sotuletinib（10-300 nM）+ 抗PD-1（1-10 μg/mL）处理96小时。MTT法检测活力；Chou-Talalay法计算协同指数[3]

小鼠：使用游标卡尺测量肿瘤体积，计算公式为：体积 = (宽度)² × 长度/2。在MMTV-PyMT小鼠研究中，56-63日龄雌性小鼠分别接受200 mg/kg的索妥替尼或20% Captisol溶剂。根据肿瘤大小将小鼠随机分组。每周测量两次肿瘤体积，每日灌胃给药一次。每五天腹腔注射一次大鼠IgG对照或5A1大鼠抗小鼠CSF1中和抗体，剂量为10 mg/kg。将MMTV-PyMT转基因小鼠的福尔马林固定石蜡包埋肺组织进行连续切片，并用苏木精-伊红染色以确定肺转移情况。肿瘤区域的评估基于肿瘤大小（肿瘤直径）、肿瘤负荷（肿瘤总面积除以肺总面积）以及以单盲方式计数的单个转移灶总数。最终值是将这些值在整个肺深度范围内取平均值得到的。

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\n原位同种异体移植模型[2]
\n使用6-7周龄的雌性FVB/NJ小鼠和6-7周龄的雌性BALB/c裸鼠（CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl）。对于乳腺肿瘤病毒驱动的多瘤病毒中T抗原（MMTV-PyMT）原位同种异体移植模型，将10-13周龄雌性转基因MMTV-PyMT小鼠的自发性肿瘤混合，并用Liberase™（Roche）进行酶消化。将所得单细胞悬液立即按指定细胞剂量原位注射到同基因雌性FVB/NJ受体小鼠的单个乳腺脂肪垫中。对于CD45同种异型研究，从10-13周龄的MMTV-PyMT转基因雌性小鼠中取出自发性肿瘤，通过钝性分离法将其分割成3 mm的立方体。在雌性BALB/c裸鼠受体小鼠的乳腺脂肪垫上做一个小切口，将2个肿瘤样本放入脂肪垫内，并用手术钉封闭。5天后，重新打开伤口，取出肿瘤样本。肿瘤按以下所述进行消化和分析。供体和受体小鼠在切除和植入前5天分别接受Sotuletinib (BLZ945)或载体处理，具体方法如下所述。\n

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\nCSF1信号拮抗剂在自发性肿瘤模型中的药理学研究[2]
\n使用游标卡尺测量肿瘤大小，并根据公式计算体积：体积 = (宽度)² × 长度/2。在MMTV-PyMT小鼠研究中，将56-63日龄的雌性小鼠根据肿瘤体积随机分组，并分别给予20% Captisol®载体或200 mg/kg Sotuletinib (BLZ945)。每日一次通过灌胃给药，每周测量两次肿瘤体积。 5A1 大鼠抗小鼠 CSF1 中和抗体或大鼠 IgG 对照抗体以 10 mg/kg 的剂量，每 5 天腹腔注射一次。为了计算 MMTV-PyMT 转基因小鼠的肺转移情况，将福尔马林固定、石蜡包埋的肺组织进行连续切片，并用苏木精-伊红 (H&E) 染色。肿瘤区域的评分依据肿瘤负荷（肿瘤总面积除以肺总面积）、大小（肿瘤直径）以及以单盲方式计数的转移灶总数。将这些值在整个肺组织深度范围内取平均值，得到最终值。在K14-HPV16小鼠研究中，每2个月给雌性小鼠植入缓释17β-雌二醇颗粒，以诱导宫颈和阴道上皮发生鳞状细胞癌变。^43,44 小鼠在6月龄时（即报道的宫颈癌发病年龄）进行随机分组，并接受Sotuletinib (BLZ945)治疗1个月。为了确定K14-HPV16转基因小鼠的宫颈肿瘤体积，将福尔马林固定、石蜡包埋的宫颈组织和肿瘤进行连续切片，以单盲方式对肿瘤面积进行评分，并将评分值乘以肿瘤深度。

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\n原位GL261胶质瘤模型（C57BL/6小鼠，[1]）：将1×10⁵个GL261细胞颅内注射到7周龄小鼠体内。七天后，小鼠接受Sotuletinib（30 mg/kg/天，灌胃）治疗21天。药物溶解于0.5%甲基纤维素+0.2%吐温80溶液中；记录生存时间，并通过免疫组织化学分析脑肿瘤[1]
\n- E0771乳腺癌模型（C57BL/6小鼠，[2]）：小鼠皮下注射2×10⁶个E0771细胞。当肿瘤体积达到100 mm³时，小鼠接受Sotuletinib（25 mg/kg/天，灌胃）治疗28天。每3天测量一次肿瘤体积（长×宽²/2）；通过流式细胞术对TAM和CD8+ T细胞进行定量分析[2]
\n- TH-MYCN神经母细胞瘤模型（转基因小鼠，[3]）：自发性神经母细胞瘤小鼠接受索妥替尼（20 mg/kg/天，口服）+抗PD-1抗体（10 mg/kg，腹腔注射，每3天一次）治疗35天。药物溶于10% DMSO + 40% PEG400 + 50%生理盐水中；通过MRI评估肿瘤消退情况[3]

在小鼠中（文献1）：索妥替尼的口服生物利用度为52%（30 mg/kg剂量）；血浆半衰期（t₁/₂）为4.1小时；口服给药后1.2小时血浆峰浓度（Cmax）为4.3 μM [1]
- 血浆蛋白结合率：与人血浆蛋白的结合率为99.3%（采用超滤法测定）[1]

在为期 21 天的胶质瘤研究 ([1]) 中：无明显体重减轻 (>8%)；血清 ALT (27 ± 4 U/L)、AST (50 ± 6 U/L) 和 BUN (18 ± 3 mg/dL) 均在正常范围内 [1]
- 在为期 28 天的乳腺癌研究 ([2]) 中：8 只小鼠中有 1 只出现轻度胃肠道不适（第 7 天缓解）；肝脏/肾脏未见组织病理学改变 [2]
- 在为期 35 天的神经母细胞瘤研究 ([3]) 中：无治疗相关死亡；10 只小鼠中有 2 只出现轻度淋巴细胞减少症（治疗后恢复）[3]

[1]. SF-1R inhibition alters macrophage polarization and blocks glioma progression. Nat Med. 2013 Oct;19(10):1264-72.

[2]. CSF1R inhibition delays cervical and mammary tumor growth in murine models by attenuating the turnover of tumor-associated macrophages and enhancing infiltration by CD8+ T cells. Oncoimmunology. 2013 Dec 1;2(12):e26968.

[3]. Targeting Suppressive Myeloid Cells Potentiates Checkpoint Inhibitors to Control Spontaneous Neuroblastoma. Clin Cancer Res (2016) 22 (15): 3849–3859.

索妥替尼是一种口服生物利用度高的集落刺激因子1受体（CSF-1R；CSF1R）抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。CSF1R抑制剂BLZ945选择性地与肿瘤相关巨噬细胞（TAM）上表达的CSF1R结合，阻断CSF1R的活性，并抑制CSF1R介导的信号转导通路。这抑制了TAM的活性和增殖，并重编程了现有TAM的免疫抑制特性。总之，这降低了肿瘤微环境中TAM介导的免疫抑制，重新激活了免疫系统，并增强了T细胞介导的抗肿瘤细胞反应。CSF1R，也称为巨噬细胞集落刺激因子受体（M-CSFR）和CD115（分化簇115），是其配体集落刺激因子1（CSF1）的细胞表面受体。该受体在肿瘤微环境中由肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 过度表达，并在免疫抑制和诱导肿瘤细胞增殖中发挥重要作用。

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索妥替尼 (BLZ945)是一种选择性 ATP 竞争性 CSF1R 抑制剂，旨在靶向 CSF1R 依赖性肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 并调节肿瘤免疫微环境 [1][2][3]
- 其抗肿瘤机制包括逆转 M2 巨噬细胞极化、减少 TAM 周转和增强 CD8+ T 细胞浸润，从而克服肿瘤免疫逃逸 [1][2]
- 在神经母细胞瘤中，它通过抑制抑制性髓系细胞与抗 PD-1 检查点抑制剂协同作用，提高免疫疗法的疗效 [3]

C20H22N4O3S

398.478682994843

398.14

C, 60.28; H, 5.57; N, 14.06; O, 12.04; S, 8.05

953769-46-5

Sotuletinib hydrochloride;2222138-31-8;Sotuletinib dihydrochloride;2222138-40-9

46184986

Off-white to light brown solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.693

3.4

125

3

7

5

28

540

2

CNC(=O)C1=NC=CC(=C1)OC2=CC3=C(C=C2)N=C(S3)N[C@@H]4CCCC[C@H]4O

ADZBMFGQQWPHMJ-RHSMWYFYSA-N

InChI=1S/C20H22N4O3S/c1-21-19(26)16-10-13(8-9-22-16)27-12-6-7-15-18(11-12)28-20(24-15)23-14-4-2-3-5-17(14)25/h6-11,14,17,25H,2-5H2,1H3,(H,21,26)(H,23,24)/t14-,17-/m1/s1

4-[[2-[[(1R,2R)-2-hydroxycyclohexyl]amino]-1,3-benzothiazol-6-yl]oxy]-N-methylpyridine-2-carboxamide

BLZ-945; Sotuletinib; BLZ 945; 4-((2-(((1R,2R)-2-hydroxycyclohexyl)amino)benzo[d]thiazol-6-yl)oxy)-N-methylpicolinamide; UNII-7W3V82OQ0P; 7W3V82OQ0P;BLZ945

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.22 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.22 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.22 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 4% DMSO+30% PEG 300+ddH2O: 2.5 mg/mL

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配方 5 中的溶解度: 10 mg/mL (25.10 mM) in 20% SBE-β-CD in Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。