CSF-1R (IC50 = 1 nM); c-Kit (IC50 = 3.2 μM); PDGFRβ (IC50 = 4.8 μM); Flt3 (IC50 = 9.1 μM)

体外活性：在骨髓源性巨噬细胞 (BMDM) 中，BLZ945 特异性抑制 CSF-1 依赖性增殖，EC50 为 67nM，并降低 CSF-1R 磷酸化。 BLZ945 阻断巨噬细胞和神经胶质瘤细胞之间对彼此存活、增殖和/或极化的相互作用，从而促进肿瘤发生。激酶测定：BLZ945 是一种有效的、口服生物活性的、选择性的 CSF-1R（集落刺激因子 1 受体）抑制剂，IC50 为 1 nM，对其最接近的受体酪氨酸激酶同源物的选择性超过 1000 倍。细胞测定：使用MTT细胞增殖试剂盒测定细胞生长速率。简而言之，将细胞一式三份接种在 96 孔板中：神经胶质瘤细胞系每孔 1,000 个细胞，BMDM 和 CRL-2467 每孔 5 x 1,000 个细胞，HUVEC 和 HBMEC 细胞系每孔 2.5 x 1,000 个细胞。对于所有实验，介质每 48 小时更换一次。细胞在存在或不存在 6.7–6,700 nM BLZ945 或 8 μg/mL CSF-1R 中和抗体的情况下生长。 BMDM 和 CRL-2467 细胞分别补充 10 ng/mL 和 30 ng/mL 重组小鼠 CSF-1。根据制造商的方案，使用读板器通过比色分析检测 MTT 底物的还原，并在 SpectraMax 340pc 读板器上在 595 nm 和 750 nm 处进行测量。

在患有神经胶质瘤的小鼠中，BLZ945 通过抑制 CSF-1R 来阻止肿瘤进展并显着提高生存率。 BLZ945 还在体内抑制患者源性原神经肿瘤球和细胞系的原位肿瘤生长。 BLZ945（200 mg/kg，口服）可降低小鼠乳腺肿瘤病毒驱动的多瘤病毒中 T 抗原 (MMTV-PyMT) 乳腺癌模型和表达角蛋白 14 的人乳头瘤病毒 16 型 (K14-HPV- 16）宫颈癌转基因模型。

BLZ945 是一种有效的、口服生物活性的、选择性的 CSF-1R（集落刺激因子 1 受体）抑制剂，IC50 为 1 nM，对其最接近的受体酪氨酸激酶同源物的选择性超过 1000 倍。
BLZ945， CSF-1R酪氨酸激酶的高选择性小分子抑制剂（比其他酪氨酸激酶高3200倍）；参考文献27)。在体外阻断实验中，将BLZ945和GW2580分别溶于10 mmol/L和1 mmol/L的DMSO中制备原液。在体内治疗方面，根据先前的研究，BLZ945溶解在20% Captisol中，剂量为16 mg/mL，每日灌胃剂量为200 mg/kg。[3]

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细胞因子分析：在卡罗林斯卡大学医院的核心设施中，通过27参数Luminex多路试验 分析从SK-N-BE(2)、SK-N-AS或SK-N-FI神经母细胞瘤细胞系中收集的培养基或上清液中的细胞因子含量。采用ELISA法测定中药中人或鼠M-CSF （CSF-1）的浓度。[3]

CD34+造血祖细胞的分化[3]
采用含有50 ng/mL GM-CSF和5 ng/mL tnf - α的900 μL培养基，24孔板培养CD34+细胞。或者，从上述三种人类神经母细胞瘤细胞系中收集的上清液以2:1的比例添加到祖细胞中。以培养液中维持的CD34+细胞为对照。为了阻断CSF-1R信号，将Sotuletinib (BLZ945) (500 nmol/L)添加到细胞因子成熟的细胞中或细胞因子与SK-N-BE(2)结合的上清液中。7天后，通过清洗和轻轻刮拭收集所有细胞，并通过流式细胞术或基于cfse的t细胞增殖试验评估细胞的表型和功能。

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人单核细胞-肿瘤共培养[3]
原代人单核细胞与人神经母细胞瘤细胞系共培养。简而言之，将单核细胞与4×105 SK-N-BE(2)、SK-N-AS或6×105 SK-N-FI神经母细胞瘤细胞在3ml培养基中的6孔板中共培养。未培养肿瘤细胞的单核细胞作为对照。64小时后，通过大力清洗细胞，然后轻轻刮板收获细胞。流式细胞术评价细胞表型变化，用微珠和质谱柱对HLA-DR+细胞进行分选。为了研究CSF-1R的作用，将500 μmol/L Sotuletinib (BLZ945) 或1 μmol/L GW2580加入到单核细胞或共培养中。

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小鼠骨髓细胞的分化[3]
抑制性骨髓细胞是根据先前描述的方案，从负基因型TH-MYCN小鼠的骨髓细胞中诱导的。简言之，将1×106分离的骨髓细胞在NHO2A肿瘤条件培养基（中药，1:1稀释至新鲜培养基）存在的6孔板中培养。作为对照，细胞在新鲜培养基或M-CSF （20 ng/mL）中培养。为了阻断CSF-1R信号，在培养物中加入1 μmol/L的Sotuletinib (BLZ945) 或GW2580，并加入DMSO作为对照。4天后，通过收集浮细胞和仔细刮拭孔贴壁细胞的方法收获细胞，随后进行流式细胞术分析或t细胞抑制实验。

小鼠：使用游标卡尺测量肿瘤体积，计算公式为：体积 = (宽度)² × 长度/2。在 MMTV-PyMT 小鼠研究中，56-63 日龄雌性小鼠分别接受 200 mg/kg 的 sotuletinib 或 20% Captisol 溶剂。根据肿瘤大小将小鼠随机分组。每周测量两次肿瘤体积，每日灌胃给药一次。每五天腹腔注射一次大鼠 IgG 对照或 5A1 大鼠抗小鼠 CSF1 中和抗体，剂量为 10 mg/kg。将 MMTV-PyMT 转基因小鼠的福尔马林固定石蜡包埋肺组织进行连续切片，并用苏木精-伊红染色，以确定肺转移情况。肿瘤区域的评估基于肿瘤大小（肿瘤直径）、肿瘤负荷（肿瘤总面积除以肺总面积）以及以单盲方式计数的单个转移灶总数。最终值取自整个肺深度的平均值。

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原位同种异体移植模型[2]
使用6-7周龄的雌性FVB/NJ小鼠和6-7周龄的雌性BALB/c裸鼠（CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl）。对于乳腺肿瘤病毒驱动的多瘤病毒中T抗原（MMTV-PyMT）原位同种异体移植模型，将10-13周龄雌性转基因MMTV-PyMT小鼠的自发性肿瘤混合，并用Liberase™（Roche）进行酶消化。将所得单细胞悬液立即按指定细胞剂量原位注射到同基因雌性FVB/NJ受体小鼠的单个乳腺脂肪垫中。对于CD45同种异型研究，从10-13周龄的MMTV-PyMT转基因雌性小鼠中取出自发性肿瘤，通过钝性分离法将其分割成3 mm的立方体。在雌性BALB/c裸鼠受体小鼠的乳腺脂肪垫上做一个小切口，将2个肿瘤样本放入脂肪垫内，并用手术钉封闭。5天后，重新打开伤口取出肿瘤样本。肿瘤按以下所述进行消化和分析。供体和受体小鼠在切除和植入前5天分别接受Sotuletinib (BLZ945)或载体处理，具体方法如下所述。

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CSF1信号拮抗剂在自发性肿瘤模型中的药理学研究[2]
使用游标卡尺测量肿瘤大小，并根据公式：体积 = (宽度)² × 长度/2 计算肿瘤体积。在MMTV-PyMT小鼠研究中，将56-63日龄的雌性小鼠根据肿瘤体积随机分组，并分别给予20% Captisol®溶剂或200 mg/kg的Sotuletinib (BLZ945)。每日一次灌胃给药，每周两次测量肿瘤体积。每5天腹腔注射10 mg/kg的5A1大鼠抗小鼠CSF1中和抗体或大鼠IgG对照。为了计算MMTV-PyMT转基因小鼠的肺转移情况，将福尔马林固定、石蜡包埋的肺组织进行连续切片，并用苏木精-伊红（H&E）染色。肿瘤区域的评分依据肿瘤负荷（肿瘤总面积除以肺总面积）、大小（肿瘤直径）以及以单盲方式计数的单个转移灶总数。将这些值在整个肺组织深度范围内取平均值，得到最终值。在K14-HPV16小鼠研究中，每2个月给雌性小鼠植入缓释17β-雌二醇颗粒，以诱导宫颈和阴道上皮发生鳞状细胞癌。^43,44 小鼠在6月龄时（即报道的宫颈癌发病年龄）进行随机分组，并用Sotuletinib (BLZ945)治疗1个月。为了确定 K14-HPV16 转基因小鼠的宫颈肿瘤体积，将福尔马林固定石蜡包埋的宫颈组织和肿瘤进行连续切片，以单盲方式对肿瘤面积进行评分，并将这些值乘以肿瘤深度。

[1]. SF-1R inhibition alters macrophage polarization and blocks glioma progression. Nat Med. 2013 Oct;19(10):1264-72.

[2]. CSF1R inhibition delays cervical and mammary tumor growth in murine models by attenuating the turnover of tumor-associated macrophages and enhancing infiltration by CD8+ T cells. Oncoimmunology. 2013 Dec 1;2(12):e26968.

[3]. Targeting Suppressive Myeloid Cells Potentiates Checkpoint Inhibitors to Control Spontaneous Neuroblastoma. Clin Cancer Res (2016) 22 (15): 3849–3859.

索妥替尼是一种口服生物利用度高的集落刺激因子1受体（CSF-1R；CSF1R）抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。CSF1R抑制剂BLZ945选择性地与肿瘤相关巨噬细胞（TAM）上表达的CSF1R结合，阻断CSF1R的活性，并抑制CSF1R介导的信号转导通路。这抑制了TAM的活性和增殖，并重编程了现有TAM的免疫抑制特性。总之，这降低了肿瘤微环境中TAM介导的免疫抑制，重新激活了免疫系统，并增强了T细胞介导的抗肿瘤细胞反应。CSF1R，也称为巨噬细胞集落刺激因子受体（M-CSFR）和CD115（分化簇115），是其配体集落刺激因子1（CSF1）的细胞表面受体。该受体在肿瘤微环境中由肿瘤相关巨噬细胞（TAM）过度表达，并在免疫抑制和诱导肿瘤细胞增殖中发挥重要作用。

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目的：神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤，高危患者即使接受积极的多模式治疗，预后仍然很差。神经母细胞瘤引起的炎症会导致抑制性髓系细胞的诱导，从而阻碍有效的抗肿瘤免疫反应。因此，我们试图通过消除髓系细胞介导的免疫抑制来增强抗肿瘤免疫。
实验设计：通过分析神经母细胞瘤患者的基因组数据集，证实了髓系细胞的预后价值。利用新鲜分离的人类CD34+造血干细胞、原代人单核细胞和鼠骨髓细胞，通过体外培养模型，解析了肿瘤来源因子对髓系造血和抑制性髓系细胞局部诱导的影响。为了测试 BLZ945 作为单药疗法或与免疫检查点抑制剂联合疗法的治疗效果，我们使用了一种会自发形成侵袭性神经母细胞瘤的转基因小鼠模型 (TH-MYCN)。
结果：我们发现，浸润的 CSF-1R+ 髓系细胞预示着神经母细胞瘤患者预后不良。体外实验表明，神经母细胞瘤来源的因子会干扰髓系细胞的早期发育，并通过 M-CSF/CSF-1R 相互作用赋予其对人单核细胞的抑制功能。在一种类似于高危人类神经母细胞瘤的转基因小鼠模型 (TH-MYCN) 中，使用选择性抑制剂 (BLZ945) 拮抗 CSF-1R 可以调节人和小鼠抑制性髓系细胞的诱导，并有效限制肿瘤进展。尽管免疫检查点抑制剂不足以控制肿瘤生长，但将BLZ945与PD-1/PD-L1阻断抗体联合使用可显著提高肿瘤控制效果。
结论：我们的研究结果表明CSF-1R信号通路在诱导抑制性髓系细胞过程中发挥着至关重要的作用，并强调了其作为人类癌症免疫疗法的临床潜力。[3]

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肿瘤浸润巨噬细胞数量的增加与多种癌症（包括乳腺癌和前列腺癌）患者的不良预后相关。集落刺激因子1受体（CSF1R）信号通路驱动肿瘤相关巨噬细胞（TAM）募集至肿瘤微环境，并促进TAM向促肿瘤表型分化。目前有12项临床试验正在评估靶向CSF1/CSF1R信号通路的药物作为治疗多种恶性肿瘤（包括乳腺癌、白血病和胶质母细胞瘤）的疗效。研究表明，阻断 CSF1R 信号通路能够以组织特异性的方式显著降低巨噬细胞的数量。然而，为了理解巨噬细胞的耗竭机制以及 CSF1R 抑制对其他肿瘤浸润免疫细胞的整体影响，还需要进一步的机制研究。我们使用高选择性 CSF1R 小分子抑制剂 BLZ945，发现 CSF1R 抑制能够降低肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 的周转率，同时增加浸润宫颈癌和乳腺癌的 CD8+ T 细胞的数量。具体而言，我们发现 BLZ945 能够抑制小鼠乳腺肿瘤病毒驱动的多瘤病毒中 T 抗原 (MMTV-PyMT) 乳腺癌模型中恶性细胞的生长。此外，我们发现BLZ945能够抑制表达角蛋白14的人乳头瘤病毒16型（K14-HPV-16）转基因宫颈癌模型中的肿瘤进展。我们的结果表明，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）以CSF1R依赖的方式持续更新，并提示持续抑制CSF1R通路对于维持有效的巨噬细胞清除作为抗癌疗法至关重要。[2]胶质母细胞瘤（GBM）包含多种分子亚型，包括前神经型GBM。大多数靶向胶质瘤细胞的治疗方法均以失败告终。一种替代策略是靶向胶质瘤微环境中的细胞，例如肿瘤相关巨噬细胞和小胶质细胞（TAMs）。巨噬细胞的分化和存活依赖于集落刺激因子-1（CSF-1）。我们使用 CSF-1 受体 (CSF-1R) 抑制剂靶向小鼠前神经胶质母细胞瘤 (GBM) 模型中的肿瘤相关巨噬细胞 (TAM)，结果显著延长了小鼠的生存期并使已形成的肿瘤消退。此外，CSF-1R 阻断还减缓了患者来源的胶质瘤异种移植瘤的颅内生长。令人惊讶的是，在接受治疗的小鼠中，TAM 并未减少。相反，胶质瘤分泌的因子，包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 和干扰素-γ (IFN-γ)，在 CSF-1R 抑制的情况下促进了 TAM 的存活。存活的 TAM 中替代激活的 M2 标志物的表达降低，这与肿瘤促进功能的受损相一致。这些基因特征与前神经胶质母细胞瘤患者的生存期延长相关。我们的研究结果表明，TAM 是前神经胶质瘤的一个有前景的治疗靶点，并证实了 CSF-1R 抑制在 GBM 治疗中的转化应用潜力。[1]

434.11793

C, 50.96; H, 5.13; Cl, 15.04; N, 11.89; O, 10.18; S, 6.80

2222138-40-9

Sotuletinib;953769-46-5;Sotuletinib hydrochloride;2222138-31-8

141759984

Typically exists as solid at room temperature

125Ų

5

7

5

30

540

2

ZIHWHYXECXSBNA-LVVRIOTCSA-N

InChI=1S/C20H22N4O3S.2ClH/c1-21-19(26)16-10-13(8-9-22-16)27-12-6-7-15-18(11-12)28-20(24-15)23-14-4-2-3-5-17(14)25;;/h6-11,14,17,25H,2-5H2,1H3,(H,21,26)(H,23,24);2*1H/t14-,17-;;/m1../s1

4-((2-(((1R,2R)-2-hydroxycyclohexyl)amino)benzo[d]thiazol-6-yl)oxy)-N-methylpicolinamide dihydrochloride

Sotuletinib dihydrochloride; BLZ945; Sotuletinib hydrochloride; 2222138-31-8; Sotuletinib (hydrochloride); 4-((2-(((1R,2R)-2-Hydroxycyclohexyl)amino)benzo[d]thiazol-6-yl)oxy)-N-methylpicolinamide hydrochloride; Sotuletinib HCl?; BLZ945 HCl; BLZ945 HYDROCHLORIDE; BLZ 945; BLZ-945.Sotuletinib;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。