Aurora A 12.5 nM (IC50) Aurora B 396.5 nM (IC50)

Alisertib (MLN 8237) 诱导 MM 细胞中异常的有丝分裂纺锤体、有丝分裂积累以及衰老和死亡，以防止细胞分裂。 aleritetib 上调肿瘤抑制基因 p21 和 p27 以及 p53[1]。辅因子与 Aurora A 结合带来的 ATP 亲和力增强可能是 Alisertib (MLN 8237) 对 T217D/W277E Aurora A/TPX2 复合物活性较低的原因[2]。在各种肿瘤细胞系中，aleretitib (MLN 8237) 抑制细胞生长，IC50 范围为 15 至 469 nM[4]。

Alisertib/MLN8237体内药效学活性：有丝分裂指数增加，双极有丝分裂纺锤体减少，染色体排列异常增加[4]
在携带HCT-116结肠肿瘤异种移植物的雌性裸鼠中，以3、10和30 mg/kg的剂量口服Alisertib/MLN8237，通过血浆和肿瘤浓度测量，可获得显著的生物利用度（补充图S4）。每日一次30mg/kg的剂量是最大耐受剂量（MTD）。[4]
对用递增剂量的Alisertib/MLN8237治疗的HCT-116异种移植物的肿瘤组织进行分析，发现有丝分裂标记物pHisH3随时间和剂量的增加而增加，表明Alisertib/MLN8237抑制了Aurora a（图2A）。有丝分裂标志物下降时的血浆浓度约为1至2μmol/L，表明需要该浓度来抑制体内AAK（补充图S4）。此外，在约6μmol/L的浓度下，pHisH3没有受到抑制，这表明Aurora a在体内对Aurora B的抑制具有显著的选择性。[4]

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Alisertib/MLN8237在实体瘤异种移植物模型中引起肿瘤生长抑制，在淋巴瘤体内模型中引起消退[4]
为了确定Alisertib/MLN8237的体内抗肿瘤活性，对携带固体和血液学人类肿瘤异种移植物的小鼠施用了越来越多剂量的Alisertib/MLN8237。图3A显示了每天口服3、10或30mg/kg阿利替布3周后，皮下HCT-116肿瘤裸鼠的平均肿瘤体积。Alisertib/MLN8237治疗导致3、10和30mg/kg组的剂量依赖性TGI分别为43.3%、84.2%和94.7%。该模型中最大的抗肿瘤反应是肿瘤停滞。所有剂量均耐受良好，30mg/kg组最大体重减轻7.4%。[4]

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在人类多发性骨髓瘤的异种移植小鼠模型中，Alisertib/MLN8237（30mg/kg，口服）显著降低了肿瘤负担并提高了总体生存率[1]。在实体瘤异种移植物模型中，Alisertib/MLN8237（3-30mg/kg；口服；每天一次，持续3周）抑制肿瘤的生长[4]。

蛋白激酶测定和抑制剂[2]
使用Alisertib/MLN8237、VX-680、ZM447439和MLN8054。这些化合物的化学结构如图1 A所示。为了测量Aurora A的活性，在适当的抑制剂存在下，使用组蛋白H3作为底物，在100μM[γ-32P]ATP存在下，在30°C下对纯化的细菌表达的Aurora A进行了25 ng（12.5 nM终浓度，图1 B和补充图S1）或250 ng（125 nM最终浓度，所有其他测定）的测定。对于Aurora A/TPX2测定，包括50 ng TPX2[1−43]肽，代表Aurora A的2倍摩尔过量。Aurora A/TPX2复合物在随后添加抑制剂和ATP之前在激酶反应中形成。对于Plk4测定，在适当的抑制剂存在下，使用髓磷脂碱性蛋白（MBP）作为底物，在100μM[γ-32P]ATP存在下，在30°C下测定250 ng细菌表达的纯化His标记的人催化结构域（氨基酸1-269）20分钟。为了评估组蛋白H3和MBP的磷酸化，通过在p81磷酸纤维素纸上对磷酸化底物进行切伦科夫计数，或在SDS-PAGE后通过磷酸化试剂定量放射性标记掺入。每个实验至少重复三次，每次都有类似的结果。为了确定Aurora A和突变体的Km[ATP]值，对1至200μM[γ-32P]ATP（比活度500 cpm-pmol-1）范围内的数据进行了非线性回归分析。使用Prism软件进行数据分析。

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基于酶和细胞的激酶抑制测定[4]
如Manfredi及其同事所述，进行了Aurora A和Aurora B放射性Flashplate酶测定和基于细胞的测定，以确定Alisertib/MLN8237介导的体外抑制的性质和程度。在基于细胞的测定中，Aurora A活性是通过测量Aurora A在苏氨酸288上的自磷酸化来确定的，而Aurora B活性是通过使用高含量成像测定和如前所述测量组蛋白H3在丝氨酸10上的磷酸化（pHisH3）来确定的。还测试了1μmol/LAlisertib/MLN8237对205种激酶的抑制活性。

测定细胞活力和增殖[1]
将MM细胞系、从MM患者骨髓抽吸物中纯化的CD138+肿瘤细胞和健康供者外周血单个核细胞（PBMCs）接种于100 μL完整培养基中，以20 × 104个细胞/孔的密度接种于3个96孔板中。每孔加入MLN8237浓度范围为0.0001 ~ 4μ m，终体积为200 μL。采用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）测定细胞活力，并在孵育24、48和72小时采用3[H]-胸苷掺入法测定细胞增殖。用分光光度计在570/630 nm处测定吸光度。
将MM细胞单独或与BM基质细胞、rhIL-6 （10 ng/mL）或rhIGF-1 （25 ng/mL）共同孵育于96孔板中，然后暴露于MLN8237 (0.0001-4μM)中24、48和72小时。孵育最后8小时，细胞用3[H]-胸苷（0.5 μCi）脉冲，收集到玻璃滤光片上，用LKB betatplate闪烁计数器计数。
MM细胞株与DMSO或MLN8237 (0.125 ~ 0.5μ m)联合常规抗MM药物美法兰（2.5 ~ 5μ m）、阿霉素（50 ~ 100nm）、地塞米松（50 ~ 100nm）孵育；并用新型抗mm药物硼替佐米（2.5 ~ 5nm）或来那度胺（0.5 ~ 1μ m）治疗72小时。MTT法测定细胞活力。联合指数（CI）采用CalcuSyn软件进行等线图分析，2.0版本(CI < 1表示协同效应；CI = 1，加性效应；和CI bbb1，无显著组合效应)。

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检测细胞凋亡和衰老[1]
采用荧光素偶联膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）染色法检测MLN8237触发的MM细胞凋亡。细胞与0.5至1μM MLN8237或DMSO孵育24至72小时，并根据制造商的方案用荧光素异硫氰酸酯-膜联蛋白V和PI染色。流式细胞术检测凋亡细胞，采用BDFACS-Canto II和FlowJo Version 7.0软件。
在MM1中检测到细胞衰老的诱导。根据制造商的方案，使用衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒，用0.5μM MLN8237处理S细胞和OPM1细胞48小时。用光镜观察β-半乳糖苷酶阳性细胞(原放大×20；徕卡dil)在室温下。

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细胞循环分析[1]
将MM细胞暴露于DMSO或0.5 ~ 1μM MLN8237中24 ~ 72小时，70%乙醇在- 20℃下渗透，50 μg/mL PI和20单位/mL RNase-A孵育。流式细胞术采用BDFACS-Canto II和FlowJo软件分析DNA含量。

动物/疾病模型： 携带HCT-116结肠肿瘤异种移植的裸鼠[4]
剂量： 3、10或30 mg/kg
给药途径： 口服；每日一次，持续3周
实验结果： 3、10和30 mg/kg组的肿瘤生长抑制率（TGI）分别为43.3%、84.2%和94.7%，呈剂量依赖性。

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体内疗效研究[4]
在裸鼠或重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠中建立了9种不同组织学类型的皮下或播散性肿瘤模型。除下文所述的淋巴瘤肿瘤模型外，所有体内研究的方法均已在之前的文献中描述(32)。所有小鼠均可自由摄取食物和水，并按照《实验动物饲养和使用指南》和千年机构动物护理和使用委员会指南进行饲养和处理。所有模型的小鼠均经口给予Alisertib/MLN8237，持续约3周，并在治疗的最后一天计算肿瘤生长抑制率（TGI）。所有研究中，Alisertib/MLN8237均配制于10% 2-羟丙基-β-环糊精和1%碳酸氢钠中，并采用灌胃法每日一次或两次给药。
淋巴瘤模型采用OCI-LY7-Luc、OCI-LY19-Luc和WSU-DLCL2-Luc细胞系；将肿瘤细胞经静脉注射接种到5至8周龄的雌性SCID（非肥胖型糖尿病SCID；Taconic公司，用于OCI-LY7-Luc研究）小鼠体内。携带播散性、CD20阳性非霍奇金淋巴瘤模型OCI-LY19的小鼠分别接受以下治疗：载体对照（所有体内研究均使用10% 2-羟丙基-β-环糊精和1%碳酸氢钠）、每日两次20 mg/kg或每日一次30 mg/kg的alisertib，或每周一次10 mg/kg的抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗（Rituxan）。淋巴瘤细胞系稳定表达萤火虫荧光素酶，并使用Xenogen IVIS 200成像系统进行全身生物发光成像，以测量肿瘤随时间的生长情况。成像前15分钟，小鼠腹腔注射150 mg/kg的底物荧光素，该底物经荧光素酶氧化后会释放光子。对小鼠进行背侧和腹侧成像，并将两个方向的光子通量值相加。各治疗组的抗肿瘤效果通过计算治疗结束时的肿瘤生长指数（TGI）百分比来确定[(Δ对照组平均肿瘤光子通量 − Δ治疗组平均肿瘤光子通量) × 100/Δ对照组平均肿瘤光子通量]。

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有丝分裂指数、纺锤体双极性和染色体排列分析[4]
携带HCT-116异种移植瘤的小鼠经口单次口服3、10和30 mg/kg的Alisertib/MLN8237，并在指定时间点取出肿瘤样本。将冷冻肿瘤组织切片进行有丝分裂标记物pHisH3染色，然后使用免疫荧光检测法进行可视化，并在指定时间点进行定量分析。pHisH3（也是一种Aurora B底物）的染色和定量方法已在之前的文献中描述。

[1]. A novel Aurora-A kinase inhibitor MLN8237 induces cytotoxicity and cell-cycle arrest in multiple myeloma Blood June 24, 2010 vol. 115 no. 25 5202-5213.

[2]. Drug-Resistant Aurora A Mutants for Cellular Target Validation of the Small Molecule Kinase Inhibitors MLN8054 and MLN8237 ACS Chem. Biol., 2010, 5 (6), pp 563-576.

[3]. Aurora Kinase Inhibitors: Current Status and Outlook. Front Oncol. 2015 Dec 21;5:278.

[4]. Characterization of Alisertib (MLN8237), an investigational small-molecule inhibitor of aurora A kinase using novel in vivo pharmacodynamic assays.Clin Cancer Res. 2011 Dec 15;17(24):7614-7624.

4-[[9-氯-7-(2-氟-6-甲氧基苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂卓-2-基]氨基]-2-甲氧基苯甲酸是一种苯并氮杂卓类化合物。
Alisertib 是一种新型 Aurora A 激酶抑制剂，目前正在研究其治疗多种癌症的疗效。
Alisertib 是一种第二代口服生物利用度高、选择性强的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 Aurora A 激酶小分子抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。Alisertib 与 Aurora A 激酶结合并抑制其活性，这可能导致有丝分裂纺锤体组装紊乱、染色体分离紊乱以及细胞增殖抑制。Aurora A 激酶在有丝分裂过程中定位于纺锤体极和纺锤体微管，被认为能够调控纺锤体的组装。 Aurora激酶的异常表达见于多种癌症，包括结肠癌和乳腺癌。

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药物适应症
用于治疗多种癌症。

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Aurora-A是一种有丝分裂激酶，调控有丝分裂纺锤体的形成和分离。在多发性骨髓瘤（MM）中，Aurora-A基因的高表达与中心体扩增和增殖相关；因此，抑制MM中的Aurora-A可能具有治疗益处。本文评估了小分子Aurora-A激酶抑制剂MLN8237的体外和体内抗MM活性。用MLN8237处理培养的MM细胞会导致有丝分裂纺锤体异常、有丝分裂细胞积累，并通过诱导细胞凋亡和衰老抑制细胞增殖。此外，MLN8237还能上调p53以及抑癌基因p21和p27的表达。 MLN8237 与地塞米松、阿霉素或硼替佐米联合用药在体外可产生协同/叠加的抗多发性骨髓瘤（MM）活性。使用人源MM异种移植小鼠模型证实了MLN8237的体内抗MM活性。在接受30 mg/kg MLN8237治疗21天的动物中，肿瘤负荷显著降低（P = 0.007），总生存期显著延长（P < 0.005）。通过TdT介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测，证实了MLN8237可诱导治疗动物肿瘤细胞凋亡和细胞死亡。 MLN8237目前正在针对晚期恶性肿瘤患者进行I期和II期临床试验，我们的临床前结果表明，MLN8237可能是一种有前景的多发性骨髓瘤（MM）新型靶向疗法。[1]

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Aurora激酶调控有丝分裂进程的多个方面，它们在多种肿瘤类型中的过表达使其成为极具吸引力的肿瘤治疗靶点。过去十年的深入研究已发现化学结构不同的Aurora激酶小分子抑制剂家族，其中许多已在模型系统中展现出治疗潜力。这些药物也是解析Aurora激酶调控的信号通路的重要工具，并且已利用化学遗传学技术验证了泛Aurora抑制剂（如VX-680）的抗增殖靶点。在许多情况下，Aurora抑制剂对非相关激酶的非特异性已被充分证实，这可能拓宽这些化合物的应用范围，使其适用于更多种类的癌症。然而，明确鉴定临床激酶抑制剂的分子靶点是一项重要的挑战，对于阐明化合物特异性、耐药性和疗效的分子基础至关重要。本文研究了Aurora A对苯并氮杂卓类Aurora抑制剂MLN8054及其类似物MLN8237（一种正在进行II期临床试验的第二代化合物）的敏感性所需的氨基酸。晶体学分析有助于设计和生化研究一系列耐药的Aurora A突变体，并从中筛选出一部分作为候选耐药靶点进行进一步评估。我们利用可诱导的人类细胞系，证明表达接近生理水平的功能性但部分耐药的Aurora A T217D突变体的细胞在MLN8054或MLN8237存在的情况下仍能存活，这证实了Aurora A是这些化合物的关键抗增殖靶点。[2]

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目的：Aurora A (AAK) 和 B (ABK) 激酶的小分子抑制剂在有丝分裂中发挥重要作用，目前正在肿瘤临床试验中进行研究。我们开发了三种新的检测方法，用于定量测量体内AAK抑制的生物标志物。本文描述了选择性AAK抑制剂alisertib (MLN8237)的临床前特性，并结合了这些新的药效学检测方法。实验设计：我们研究了alisertib对AAK和ABK的选择性，并研究了alisertib在体外和体内的抗肿瘤和抗增殖活性。本研究采用新型检测方法，分别利用DNA和α-微管蛋白的免疫荧光检测，评估人肿瘤异种移植模型中的染色体排列和有丝分裂纺锤体双极性。此外，还利用18F-3'-氟-3'-脱氧-L-胸苷正电子发射断层扫描（FLT-PET）无创地测量了阿利塞替尼对体内肿瘤细胞增殖的影响。结果显示，阿利塞替尼在细胞中对AAK的抑制作用优于ABK，且选择性超过200倍。在HCT-116异种移植模型中，阿利塞替尼可剂量依赖性地降低双极染色体和排列染色体的数量，这一表型与AAK抑制作用相符。阿利塞替尼在体外抑制人肿瘤细胞系的增殖，并在实体瘤异种移植模型中抑制肿瘤生长，在体内淋巴瘤模型中引起肿瘤消退。此外，当给予能使肿瘤体积停滞的阿利塞替尼剂量时，FLT摄取量会降低，这表明无创成像可能比传统的疗效评估方法更有价值。结论：阿利塞替尼是一种选择性强效的AAK抑制剂。本文所述的测量Aurora A通路抑制的新方法以及肿瘤成像的应用可能对小分子抑制剂的临床评估具有重要价值。[4]

C27H19CLFN4NAO4

540.905339479446

540.098

C, 58.02; H, 3.79; Cl, 6.34; F, 3.40; N, 10.02; Na, 4.11; O, 14.31

1028486-06-7

Alisertib sodium;1028486-06-7; 1028486-01-2 (free acid); 1208255-63-3 (sodium)

66819785

Typically exists as solid at room temperature

3.92

108.76

1

9

6

38

843

0

ClC1C=CC2C3C(=CN=C(NC4C=CC(C(=O)[O-])=C(C=4)OC)N=3)CN=C(C3C(=CC=CC=3OC)F)C=2C=1.[Na+]

AIUYVPGHBMKGAC-UHFFFAOYSA-M

InChI=1S/C27H20ClFN4O4.Na/c1-36-21-5-3-4-20(29)23(21)25-19-10-15(28)6-8-17(19)24-14(12-30-25)13-31-27(33-24)32-16-7-9-18(26(34)35)22(11-16)37-2;/h3-11,13H,12H2,1-2H3,(H,34,35)(H,31,32,33);/q;+1/p-1

sodium;4-[[9-chloro-7-(2-fluoro-6-methoxyphenyl)-5H-pyrimido[5,4-d][2]benzazepin-2-yl]amino]-2-methoxybenzoate

ALISERTIB SODIUM; Alisertib sodium [USAN]; UNII-T76P158V9D; Alisertib sodium hydrate; MLN8237-004; T76P158V9D; 1208255-63-3; Alisertib sodium (USAN);

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。