AZ1

USP25(IC50= 0.7 μM);USP28(IC50= 0.6 μM)
USP28 (IC50 = 0.7 μM in Ub-Rh110 assay; 1.0 μM in Ub-TMR assay; 0.8 μM in tetra-Ub assay) & USP25 (IC50 = 0.6 μM in Ub-Rh110 assay) [1]
Also demonstrates equipotent activity against USP25, which is the closest homologue [1].

AZ1、AZ2 和 AZ4 的体外活性分析表明，它们对 USP28 酶具有活性，并且通过等温滴定量热法 (ITC) 和微尺度热泳 (MST) 证实它们能与 USP28 结合。此外，它们对 USP2a 也表现出选择性。第四种类似物 (AZ3) 对 USP28 的抑制效力显著降低，但仍保持对 USP2a 的选择性。除非另有说明，表格中的数据均来自一次重复实验[1]。

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酶抑制：AZ1 能有效抑制 USP28，其 IC50 值分别为 0.7 μM (Ub-Rh110)、1.0 μM (Ub-TMR) 和 0.8 μM (tetra-Ub)。它对 USP25 的抑制 IC50 值为 0.6 μM (Ub-Rh110)。它表现出高选择性，对 USP2a 没有明显的抑制作用（IC50 > 100 μM），对 20 种其他 DUB（包括 USP 1、2、4、5、7、11、15、19、20、36、45、CYL；UCH L1、L3、L5、BAP1；OTU OTUB2、OTUD6B、Cezanne；以及 JAMM AMSHLP）的抑制作用小于 10%（浓度为 10 μM）。在 30 μM 浓度下，对 caspase 1、2、4、5、8 和组织蛋白酶 H、L、S 的抑制率低于 25% [1]。
- 结合亲和力：通过等温滴定量热法 (ITC) 测定，AZ1 与 USP28 的 Kd 值为 0.2 μM；通过微尺度热泳 (MST) 结合蛋白质固有荧光法测定，Kd 值为 3.7 μM [1]。
- 作用机制：动力学分析表明，AZ1 作为 USP28 的非竞争性抑制剂，Ki 值为 1.5 μM。该化合物可逆地与 USP28 靶点结合 [1]。
- 细胞靶点结合：在 HCT116 细胞中，AZ1 以浓度依赖的方式与 USP28 和 USP25 结合，表现为 Ub-VS 共价标记的减少，EC50 值分别为 5.3 μM (USP28) 和 3.3 μM (USP25)。在浓度高达 60 μM 时，未观察到与 USP7 或 USP4 的结合 [1]。
- c-Myc 的调控：在 HCT116 细胞中，AZ1 处理 3 小时后，总 c-Myc 蛋白水平迅速且呈浓度依赖性下降，Western blot 结果显示。在所测试的最高浓度下，c-Myc 蛋白水平完全降低。这种效应并非由一般的蛋白质降解引起，因为β-肌动蛋白和USP28的水平保持稳定[1]。
- 细胞凋亡诱导：AZ1诱导HCT116细胞凋亡，表现为全长PARP（116 kDa）裂解为85 kDa的片段。PARP裂解的增加与c-Myc水平的降低相对应[1]。
- c-Myc半衰期：在用环己酰亚胺处理以阻断蛋白质合成的HCT116细胞中，AZ1（60 μM）将c-Myc的半衰期从72分钟（对照组）缩短至40分钟。蛋白酶体抑制剂MG132阻断了这种效应，表明这种缩短是由蛋白酶体降解介导的[1]。
- 细胞活力/抗增殖效应：AZ1以剂量依赖的方式降低多种癌细胞系的细胞活力。在HCT116细胞中，72小时后导致细胞活力丧失的EC50值为18.0-20.0 μM。在SW480和HT29细胞中也观察到了类似的抗增殖作用。在22种癌细胞系中，EC50值通常集中在20 μM左右[1]。

USP25/28抑制剂AZ1（AZ1；40 mg/kg；灌胃；每日一次；持续7天）可预防葡聚糖硫酸钠（DSS）引起的腹泻和体重减轻，以及结肠缩短受损[1]。
USP25/28抑制剂AZ1（20 mg/kg/天；灌胃；第1、3和6周每周6次）治疗可显著减少结肠肿瘤数量。肿瘤表现出SOCS3水平升高、pSTAT3水平降低以及Wnt相关基因表达上调。 AZ1灌胃对IL10-/-小鼠的自发性结肠炎或DSS诱导的Usp25-/-小鼠的结肠炎均无效[1]。
USP25/28抑制剂AZ1（20 mg/kg/天；灌胃；每3天一次，从13-20周龄开始）可延长AOM/Vil-Cre;Trp53fl/fl (VP)小鼠的生存期，并显著抑制结肠肿瘤的发生。在USP25缺陷的背景下，AZ1治疗对肿瘤的发生几乎没有影响[1]。

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在这些结合研究中，我们采用了两种独立的生物物理技术，第一种是等温滴定量热法（ITC）。这种无需标记的方法可以直接测量配体与靶蛋白结合时产生的结合热，可用于确认配体结合，并计算平衡解离常数（Kd）和相互作用的化学计量比。这些参数还有助于表征结合相互作用，并证明酶的功能完整性。在我们的实验条件下，AZ1、AZ2 和 AZ4 的 Kd 值分别为 0.2、0.9 和 2.7 μM（图 1a–c；表 1）。这些值与之前描述的生化活性数据一致。此外，AZ1、AZ2 和 AZ4 的相应化学计量值分别为 0.6、0.7 和 0.8（图 1a–c），这与非特异性结合模式相符，从而支持了我们从“比率测试”实验中得到的初步观察结果。为了进行比较，我们还测试了“比率测试”中确定的两种可能通过其他机制发挥作用的化合物，但这些化合物产生的数据噪声较大且难以解释（数据未显示）。为了进一步确认化合物与 USP28 的结合，我们采用了 NanoTemper 微尺度热泳 (MST) 方法，该方法产生了类似的数据。在这种情况下，AZ1 和 AZ2 的 Kd 值分别为 3.7 和 10.3 μM（补充信息图 S2a、b 和表 1）。与 ITC 数据一致，AZ3 未能产生可确定的结果。化合物的结合常数是利用蛋白质的固有荧光测定的。我们认为，与荧光标记法相比，这种方法得到的检测系统灵敏度较低。这可能部分解释了MST和ITC测得的Kd值存在明显差异的原因。相比之下，AZ4使用标记蛋白测得的Kd值与ITC结果更为接近（3.6 μM vs 2.7 μM；表1）。尽管Kd值高于体外酶活性测定中获得的IC50值以及我们ITC实验中测得的Kd值，但这些数据进一步证实了靶标与配体的结合。综合两种独立方法获得的数据表明，AZ1、AZ2 和 AZ4 以非特异性的方式与 USP28 相互作用并结合[1]。\n

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\n结合实验——等温滴定量热法[3]
\n为了最大限度地减少缓冲液不匹配或电离引起的热效应，USP28 蛋白和测试化合物在 40 mM HEPES (pH 7.5) 和 150 mM NaCl 溶液中进行透析。ITC 实验在 Microcal iTC200 仪器中进行，使用 20 μM USP28 蛋白（置于样品池中），并用 200 μM 测试化合物（置于仪器注射器中）进行滴定。使用 Microcal ITC 200 对 USP28 与测试化合物的相互作用进行定量分析。滴定数据在 25 °C 下，于 pH 7.5 的 40 mM HEPES、150 mM NaCl 和 2% DMSO 缓冲液中记录。将 200 μM 的配体储备液分多次以 2 μL 的间隔加入到 20 μM 的 USP28 溶液中。使用 Microcal Origin 软件，通过非线性最小二乘回归分析数据。\n

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\n\n\nUSP 选择性评估 [3]
\n通过在 Ubiquigent 公司 (www.ubiquigent.com) 的 DUBProfiler 试剂盒中进行测试，分析了化合物对 DUB 家族的选择性。这包括在体外 Ub-Rho110 酶活性测定中，将浓度为 10 μM 的测试化合物加入到一系列 Ub-Rho110 酶活性测定中。针对以下DUB家族成员进行了酶活性测定：14种USP（USP 1、2、4、5、7、11、15、19、20、25、28、36、45和CYLD）、4种UCH（UCHL1、UCHL3、UCHL5和BAP1）、3种OTU（OTUB2和OTUD6B）以及1种JAMM（AMSH-LP）。所得数据以每种酶总酶活性的抑制百分比表示。采用相同方法对USP28和USP25进行了剂量反应测试，测试化合物的浓度范围为100–0.03 μM。在 30 μM 的固定筛选浓度下测试了 AZ1 对包括 caspase 1/2/4/5/8 和组织蛋白酶 H/L/S 在内的半胱氨酸蛋白酶的选择性，数据以相对于 DMSO 对照的酶活性百分比表示。

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USP28/25 抑制试验（Ub-Rh110、Ub-TMR、四聚泛素）：使用多种底物（包括泛素-罗丹明 110 (Ub-Rh110)、泛素-四甲基罗丹明 (Ub-TMR) 和四聚泛素 (tetra-Ub) 链）评估纯化的 USP28 和 USP25 的去泛素化活性。该试验测量底物的裂解，从而产生荧光信号。测试了不同浓度的抑制剂，以确定半数抑制浓度 (IC50)。数据来自多个重复实验（n=3-24）[1]。
- 等温滴定量热法 (ITC)：为确认和表征结合情况，使用 Microcal iTC200 仪器进行 ITC 实验。将 USP28 蛋白 (20 μM) 置于样品池中，然后通过注射器将测试化合物 (AZ1, 200 μM) 以 2 μL 的分液滴加到样品池中。实验在 25°C 下进行，缓冲液包含 40 mM HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl 和 2% DMSO。测量结合热，并使用非线性最小二乘回归分析数据，以确定平衡解离常数 (Kd) 和化学计量比 [1]。
- 选择性分析：使用 DUBProfiler 试剂盒评估 AZ1 对 DUB 家族的选择性。该方法包括在一系列纯化的体外酶活性测定中，以泛素-罗丹明110为底物，在固定浓度（10 μM）下筛选化合物。筛选的底物包括14种USP、4种UCH、3种OTU和1种JAMM家族成员。活性以相对于DMSO对照组的总酶活性抑制百分比表示[1]。
- 可逆性测定（高稀释）：为检测可逆结合，将USP28与浓度为其IC50 10倍的AZ1预孵育。然后将该混合物稀释100倍。稀释后，重新评估USP28的活性。重新平衡后酶活性完全恢复表明结合是可逆的[1]。
- 动力学分析（抑制模式）：为确定抑制模式，在AZ1浓度递增的情况下，测定USP28在不同浓度四泛素底物下的活性。采用 Lineweaver-Burk 图分析数据，以确定抑制机制并计算抑制常数 (Ki) [1]。

将HCT116细胞预先用环己酰亚胺（100 μg/mL）和蛋白酶体抑制剂MG132（20 μM）处理，随后暴露于AZ1（60 μM）或溶剂对照（DMSO）。在指定时间点（0至180分钟）裂解细胞，并通过Western blotting检测c-Myc蛋白。基于这些印迹，通过密度分析确定c-Myc的半衰期值。β-肌动蛋白作为上样对照。这些数据代表了至少三个独立实验的结果[1]。

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细胞实验[3]
为了评估化合物的细胞活性，将HCT116细胞用USP28抑制剂化合物处理3小时。孵育后，收集细胞，裂解，并进行Western blot分析。检测样品中 c-Myc 蛋白水平，并检测 β-肌动蛋白水平作为上样对照。为了测定 c-Myc 在细胞中的半衰期，将 HCT116 细胞在环己酰亚胺 (100 μg/mL) 存在下用 USP28 抑制剂处理 3 小时，以阻断新生蛋白质合成。因此，c-Myc 水平的任何变化都表明其降解而非蛋白质合成发生了改变。化合物处理后，收集细胞并裂解，然后进行蛋白质印迹分析。

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细胞表征试剂 [3]
USP28 抑制剂（AZ1、AZ2、AZ3 和 AZ4）配制成 100 mM DMSO 储备液，用于细胞培养实验。环己酰亚胺的最终浓度为 100 μg/mL。 MG132 和碘化丙啶 (PI) 的最终浓度分别为 20 μM 和 10 μg/mL。RNaseA 的最终浓度为 250 μg/mL。CellTiter-Glo（细胞活力检测试剂盒）购自 Promega 公司。泛素-乙烯基砜 (Ub-VS) 的最终浓度为 32 μg/mL。

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靶标结合实验[3]
HCT116 细胞用 USP28 抑制剂处理 2 小时。孵育后，用含 50 mM Tris (pH 7.4)、150 mM NaCl、5 mM MgCl₂、0.5 mM EDTA、0.5% NP40、10% 甘油和 2 mM DTT 的 TE 裂解缓冲液收集细胞，并将澄清的细胞裂解液 (40 μg) 与泛素-乙烯基砜在含 50 mM Tris (pH 7.6)、5 mM MgCl₂、250 mM 蔗糖、0.5 mM EDTA 和 2 mM DTT 的检测缓冲液中于冰上孵育 1 小时。加入 LDS 上样缓冲液终止反应，并将样品加热至 70 °C。然后通过蛋白质印迹法分析样品。

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增殖实验[3]
细胞通常接种于96孔板中（通常每孔4000-6000个细胞），24小时后用浓度从0到100 μM、以0.5 log单位递增的化合物处理。72小时后，按照制造商的说明，使用CellTiter-Glo试剂盒评估细胞活力。使用GraphPad Prism软件进行分析并计算EC50值。

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细胞培养：HCT116、SW480、HT29以及其他癌细胞和正常细胞系在各自的培养基（例如McCoys 5A、RPMI、DMEM）中培养，培养基中添加胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺，并在37°C、5% CO2条件下培养。所有细胞系均经过鉴定和支原体检测[1]。
- 靶标结合实验 (Ub-VS)：HCT116 细胞用 AZ1 处理 2 小时。孵育后，收集细胞并用 TE 裂解缓冲液裂解。取 40 μg 澄清的细胞裂解液与泛素-乙烯基砜 (Ub-VS) 在冰上孵育 1 小时。加入 LDS 上样缓冲液并加热至 70°C 终止反应。然后通过蛋白质印迹法分析样品。Ub-VS 与 DUB 的共价相互作用表现为迁移率变化（条带位置升高）。通过密度分析法定量靶标结合，以确定 EC50 值[1]。
- 蛋白质印迹：细胞用添加了磷酸酶和蛋白酶抑制剂的 RIPA 缓冲液裂解。将蛋白质裂解液进行 SDS-PAGE 电泳，然后转移至膜上。用针对 c-Myc、USP28、USP25、PARP、USP7、USP4 和 β-actin（作为上样对照）的一抗对膜进行探针检测，随后用 HRP 标记的二抗进行检测 [1]。
- c-Myc 半衰期测定：用环己酰亚胺 (CHX, 100 μg/mL) 预处理 HCT116 细胞以阻断蛋白质合成，并加入或不加入蛋白酶体抑制剂 MG132 (20 μM)。然后，将细胞暴露于 AZ1 (60 μM) 或溶剂对照。在不同时间点（0 至 180 分钟）裂解细胞，并通过 Western blotting 分析 c-Myc 的表达。通过密度分析法测定半衰期值 [1]。
- 增殖/活力检测：将细胞接种于 96 孔板中（4,000-6,000 个细胞/孔）。 24小时后，用浓度递增的AZ1（0至100 μM，每次递增0.5个对数单位）处理细胞。72小时后，使用CellTiter-Glo®试剂盒评估细胞活力。EC50值使用GraphPad Prism软件计算[1]。

动物模型：12周龄雄性Usp25^+/+和Usp25^-/-小鼠[1]
剂量：40 mg/kg
给药途径：灌胃；每日一次；连续7天
结果：与对照组小鼠相比，Usp25^-/-小鼠结肠中促炎细胞因子和抗菌肽的表达增加，且不受葡聚糖硫酸钠（DSS）引起的体重减轻和腹泻的影响。此外，Usp25^-/-小鼠的结肠缩短功能也受损。

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AZ1 具有口服生物利用度。它可溶于 DMSO（根据不同来源，浓度最高可达 84 mg/mL 或 250 mg/mL）。体内给药的常用配方为 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween 80 + 45% 生理盐水，可达到 5 mg/mL (11.84 mM) 的工作浓度。DMSO 储备液可在 -20°C 下保存 1-3 个月，粉末形式在 -20°C 下可稳定保存 2-3 年。

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理化性质：分子量：422。LogD7.4：3.3。pH 7.4 时的溶解度：801 μM。人血浆蛋白结合率：游离态 3.7%（结合态 96.3%）[1]。

AZ1 仅供实验室研究使用，未经批准用于人类或兽医用途。根据安全数据表，AZ1 含有药用活性成分，对皮肤和眼睛具有中度至重度刺激性。操作人员应佩戴适当的个人防护装备，包括耐化学腐蚀手套、护目镜和防护服。根据美国交通部 (DOT)、国际海运危险货物规则 (IMDG) 或国际航空运输协会 (IATA) 的规定，该物质不属于危险运输品。根据加州65号提案，该物质不含加州已知会导致癌症、出生缺陷或生殖损害的物质。现有文献中尚未对具体的急性毒性数据（LD50）和慢性毒性特征进行全面描述。

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细胞毒性/治疗指数：AZ1 降低了癌细胞系和正常细胞系的细胞活力。在针对7种组织匹配的正常细胞系进行分析时，与活性较低的类似物 AZ3 相比，AZ1 的治疗指数极低（仅为3-5倍的窄窗口）。未观察到肿瘤细胞和正常细胞类型在反应方面存在显著差异[1]。

[1]. ACS Chem Biol. 2017 Dec 15;12(12):3113-3125.

[2]. Nature Cancer volume 1, pages811–825(2020).

[3]. ACS Chem Biol. 2017 Dec 15;12(12):3113-3125. doi: 10.1021/acschembio.7b00334.

泛素-蛋白酶体系统被广泛认为是未来药物研发领域的一个重要新兴方向，其中泛素特异性蛋白酶（USP）是最具吸引力的靶点之一。许多USP与治疗干预的关键通路相关，而USP28在维持c-Myc稳定性方面的作用表明，抑制USP28可能是靶向这一目前尚未开发的癌基因的新方法。本文报道了首个能够结合并抑制USP28活性的USP28抑制剂的发现。虽然这些抑制剂也对USP25（及其同源物）具有双重活性，但它们对其他去泛素化酶（DUB）表现出高度选择性。这些化合物能够同时靶向细胞中的USP25和USP28，凸显了它们作为研究和进一步探索细胞DUB生物学的重要探针的价值。此外，我们证实这些抑制剂能够调节细胞内c-Myc癌蛋白的总水平和半衰期，并诱导多种癌细胞系发生凋亡和细胞活力丧失。然而，与一系列组织匹配的正常细胞系相比，我们观察到其治疗指数较窄。因此，我们希望本文提出的探针和数据能够进一步加深我们对去泛素化酶（DUBs）作为潜在未来治疗靶点的生物学特性和功能性的理解。[1]

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胃肠道细菌感染或异常定植与某些炎症性肠病和结直肠癌相关。本文证实泛素特异性蛋白酶25（USP25）在实验性结肠炎、细菌感染和结直肠癌中发挥重要作用。敲除或药理学抑制USP25可增强实验性结肠炎或细菌感染诱导的免疫反应，促进感染细菌的清除和炎症消退，并减弱Wnt和SOCS3-pSTAT3信号通路，从而抑制结直肠肿瘤的发生。USP25水平与具核梭杆菌的定植以及人结直肠肿瘤活检组织中β-catenin或SOCS3的水平呈正相关或负相关，并可预测胃肠道癌症患者的不良预后。我们的研究结果表明，USP25是胃肠道感染和癌症的促进因子，也是一个潜在的药物靶点。[2]

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泛素-蛋白酶体系统被广泛认为是未来药物研发中一个重要的新兴领域，其中泛素特异性蛋白酶（USPs）是该领域最具吸引力的靶点之一。许多USP蛋白与治疗干预的关键通路相关，而USP28对c-Myc稳定性至关重要的发现表明，抑制USP28可能是一种靶向该癌基因的新方法，因为目前尚无针对该癌基因的药物靶点。本文报道了首个USP28抑制剂的发现，我们证实这些抑制剂能够结合并抑制USP28，并且对USP28同源物USP25也具有活性，同时对其他去泛素化酶（DUBs）表现出高度选择性。我们证明这些抑制剂能够同时靶向细胞中的USP25和USP28，从而证明了这些化合物作为研究和进一步探索细胞DUBs生物学的宝贵探针的实用性。此外，我们还证明这些抑制剂能够调节细胞内c-Myc癌蛋白的总水平和半衰期，并诱导多种癌细胞系的凋亡和细胞活力下降。然而，与一组组织匹配的正常细胞系相比，我们观察到这些抑制剂的治疗指数较窄。因此，我们希望本文提出的探针和数据能够进一步加深我们对去泛素化酶（DUBs）生物学特性和功能性的理解，并使其成为未来潜在的治疗靶点。[3]

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化合物类别和鉴定：AZ1（本研究中的化合物标识符）是一种苄氨基乙醇衍生物。它是在旨在发现USP28抑制剂的高通量筛选（HTS）活动中筛选出的先导化合物。该化合物已被证实是USP28的特异性、可逆性和非竞争性抑制剂[1]。
- 作为化学探针的用途：作者强调AZ1是最早报道的USP28和USP25抑制剂之一。它被认为是一种有价值的化学探针，可用于研究这些去泛素化酶的细胞生物学，特别是c-Myc稳定性及其下游效应的调控。其对USP25和USP28的双重活性使其可用于研究这一密切相关的DUB亚家族的选择性和冗余性[1]。

C17H16BRF4NO2

422.2121

421.0301

C, 48.36; H, 3.82; Br, 18.92; F, 18.00; N, 3.32; O, 7.58

2165322-94-9

2165322-94-9

135397656

White to off-white solid powder

3.7

41.5Ų

2

7

7

25

399

0

BrC1C([H])=C([H])C(=C(C=1[H])C([H])([H])N([H])C([H])([H])C([H])([H])O[H])OC([H])([H])C1C([H])=C([H])C(=C(C(F)(F)F)C=1[H])F

ITHSFXDGKQYOED-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H16BrF4NO2/c18-13-2-4-16(12(8-13)9-23-5-6-24)25-10-11-1-3-15(19)14(7-11)17(20,21)22/h1-4,7-8,23-24H,5-6,9-10H2

2-(5-Bromo-2-(4-fluoro-3-(trifluoromethyl)benzyloxy)benzylamino)ethanol

AZ1; AZ-1; USP25/28 inhibitor AZ1; 2165322-94-9; USP25 and 28 inhibitor AZ-1; Ethanol, 2-[[[5-bromo-2-[[4-fluoro-3-(trifluoromethyl)phenyl]methoxy]phenyl]methyl]amino]-; CHEMBL4442615; 2-[[5-bromo-2-[[4-fluoro-3-(trifluoromethyl)phenyl]methoxy]phenyl]methylamino]ethanol; 2-((5-bromo-2-((4-fluoro-3-(trifluoromethyl)benzyl)oxy)benzyl)amino)ethanol; C17H16BrF4NO2; AZ 1; AZ1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 84~250 mg/mL ( 198.95~592.12 mM )
Ethanol : ~84 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.93 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.08 mg/mL (4.93 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.93 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。