Baicalin   中文名称: 黄芩苷

Natural product; carnitine palmityl transferase 1 (CPT1); NF-κB; Autophagy

通过改变活性氧 (ROS)、Toll 样受体 (TLR) 2 和 TLR4、NF-κB、Bax 和 Bcl-2 等多种介质的合成，黄芩苷可提供针对再灌注损伤 (IRI) 的保护。促炎细胞因子 TLR2/4、MyD88、p-NF-κB 和 p-IκB，以及与 IκB 表达相关的 NF-κB 产生增强，均会受到治疗的抑制 [1]。 MTT测定用于评估细胞活力。与对照细胞相比，用粉末酶处理的SH-SY5Y细胞的活力要低得多。与单独使用粉状酶处理的细胞相比，单独使用黄芩苷（5、10 和 20 μM）可以剂量依赖性方式增强细胞活力 [2]。

在两个季度（10 和 100 毫克/公斤）内，黄芩苷显着降低血尿素氮 (BUN) 和 Scr 浓度，同时还定量预防肾功能丧失。采用0-3分分级系统，评估黄芩苷引起的组织损伤。与假手术组相比，用 10 和 100 mg/kg 黄芩苷治疗仅导致 MDA 含量略有增加，SOD 活性略有降低，这表明当不再注射时黄芩苷会增加氧化作用 [1]。

热位移分析[3]
热位移测定如前所述 进行。对于温度依赖性热位移测定，将50µL脂肪变性Hela细胞或CPT1A过表达大肠杆菌的裂解物（3 mg/mL）与100µMbaicalin/黄芩苷在36至76°C的每个温度点孵育4分钟。样品在4°C下以20000 g离心10分钟，以分离上清液和托盘。将12µL上清液与3µL 5x加载缓冲液混合，然后在10%SDS-PAGE上分离，用于CPT1A的免疫印迹分析。对于剂量依赖性热位移测定，将50µL裂解物（3 mg/mL）与不同浓度的baicalin/黄芩苷（0至1000µM）在52°C下孵育4分钟。通过离心分离上清液，并如上所述对CPT1A进行免疫印迹分析。

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CPT1活性测定[3]
CPT1活性测定是根据之前报告的修改方案进行的，该方案基本上测量了氘标记的肉碱（[D9]-肉碱）向氘标记的棕榈酰肉碱（[D9-棕榈酰肉碱）的转化。反应缓冲液由150 mM KCl、2 mM EDTA、4.5 mM谷胱甘肽、1 mg/mL BSA、0.1 mM棕榈酰辅酶A和0.1 mM[D9]-肉碱在PBS中组成。按指示浓度加入baicalin/黄芩苷。我们使用纯但无活性的重组CPT1A建立蛋白质浓度标准曲线，并在进行CPT1A酶测定时使用蛋白质印迹来估计各种细胞、组织和大肠杆菌裂解物中CPT1A的量。然后使用这些数字将CPT1A活性标准化为绝对值（每m g CPT1A每分钟棕榈酰肉碱的nmol转换）。为了测试细胞CPT1A的活性，将HeLa细胞在冰上用0.1%的Triton X-100溶解在PBS中，并将裂解物调节至2 mg/mL。通过向100µL反应缓冲液中加入20µL裂解物开始酶促反应，并在37°C下孵育10分钟。反应结束时，加入0.3 nmol[D3]-棕榈酰肉碱作为内标，加入600µL预冷甲醇，在冰上提取小分子代谢物。将反应混合物在4°C下以20000 g离心5分钟。然后取出400µL上清液，与600µL蒸馏水混合，制成1mL最终样品体积，用于LCMS测定[D9]-棕榈酰肉碱。LC-MS系统由AB SCIEX 5500三重四极杆质谱仪和岛津DGU-20A液相色谱仪组成，该液相色谱仪配有6个安捷伦柱。缓冲液梯度为100%-0缓冲液A（100%水，0.1%甲酸）和0%-100%缓冲液B（100%乙腈，0.1%甲酸。通过比较[D9]-棕榈酰基肉碱和[D3]-棕榈酰肉碱的峰面积来计算[D9]棕榈酰基肉碱的绝对浓度。在有或没有100µM丙二酰辅酶A处理的情况下平行制备两个反应，CPT1A的活性计算为有和没有丙二酰CoA处理时[D9]-棕榈酰肉碱的差异。为了测试原代肝细胞中的CPT1A活性，将肝细胞在冰上用0.1%的Triton X-10溶解在PBS中，并将裂解物调节至2mg/mL。通过向100µL反应缓冲液中加入10µL裂解物开始酶反应，并在37°C下孵育10分钟。为了检测线粒体中的CPT1A活性，使用培养细胞线粒体分离试剂盒分离线粒体。然后，在冰上用0.1%的Triton X-100在PBS中裂解线粒体，然后将裂解物调节至0.2mg/mL。如上所述，使用10µL线粒体裂解物测定CPT1A活性。为了测试小鼠肝脏的CPT1A活性，用0.1%的Triton X-100均质化组织，以获得2mg/mL的裂解液。如上所述，使用10µL的肝脏裂解液来测定CPT1A的活性。为了测试大肠杆菌的重组CPT1活性，如上所述，使用过表达每个CPT1构建体的大肠杆菌的10µL裂解物（1L大肠杆菌培养物用含有0.1%曲顿-100的50mL PBS裂解）来测定CPT1活性。

细胞培养与实验设计[2]
SH-SY5Y细胞在37°C的RPMI-1640培养基 中培养，该培养基补充了15%的胎牛血清，空气中含有95%的空气和5%的二氧化碳，湿度饱和。在60~70%的融合后，SH-SY5Y细胞分为：（i）对照组，在RPMI-1640培养基中孵育；（ii）凝血酶组，根据我们的预实验，凝血酶诱导（40U/L）6小时；（iii）黄芩苷组，在凝血酶诱导前用baicalin/黄芩苷（5μM、10μM或20μM）处理2小时。

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细胞活力测定[2]
如前所述，使用MTT法测量细胞存活率[24]。简而言之，向每个孔中加入15μl MTT溶液（5mg/mL），并在37°C下孵育4小时。去除上清液后，向每个孔中加入80μL DMSO。使用微孔板读数器在492nm处测量吸光度。所有实验均一式三份。

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流式细胞术检测细胞凋亡[2]
不含EDTA的胰蛋白酶消化法收获细胞，在PBS中洗涤两次。用AnnexinV/异硫氰酸荧光素（FITC）和碘化丙啶（PI）染色后，立即用流式细胞仪分析细胞。

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SILAC-ABPP SILAC[3]
ABPP实验是根据先前报告改编的方案进行的。Hela细胞在含有10%SILAC FBS、1%青霉素-链霉素和100µg/mL[13C6.15N4]L-精氨酸-HCl和[13C6.15N2]L-赖氨酸-HHCl或L-精氨酰-HCl和L-赖氨酸酯-HCl的SILAC DMEM中传代10次。在ABPP实验之前，细胞被血清饥饿24小时，并用1 mM游离脂肪酸处理24小时，以诱导脂滴的积累。收集细胞并在-80°C下储存以供进一步实验。将冷冻细胞颗粒重新悬浮在含有0.1%Triton X-100的PBS中，超声处理，并通过100000 g超速离心45分钟将其分离为可溶性和不溶性部分。使用酶标仪上的BCA蛋白测定法（Pierce™BCA蛋白测定试剂盒，赛默飞世尔科技公司）测定可溶性蛋白浓度。将裂解物调节至2 mg/mL，用2 mM黄芩苷（10µL的200 mM DMSO储备）或DMSO处理，用200µM黄芩苷探针（10µL的20 mM DMSO库存）或DMSO标记，然后在365 nm的紫外线辐射下冰上放置1小时。将轻和重探针化的蛋白质组以1:1的比例均匀混合，并立即用氯仿-甲醇沉淀。然后将沉淀物用1.2%的SDS/PBS重新悬浮，并与300µM叠氮化生物素、100µM TBTA、1 mM TCEP和1 mM 7 CuSO4混合1小时。反应后，用氯仿甲醇再次提取蛋白质组以去除多余的试剂。用冷甲醇洗涤蛋白质界面，用1.2%SDS/PBS溶解，用PBS稀释5倍。溶解的蛋白质在室温下与链霉抗生物素蛋白珠（100µL浆液）一起旋转孵育3小时。然后将珠粒用5mL PBS洗涤三次，用5mL水洗涤三次后转移到螺旋顶Eppendorf管中。富集的蛋白质在6 M尿素/PBS中变性，在65°C下用10 mM二硫苏糖醇还原15分钟，在35°C下在黑暗中搅拌20 mM碘乙酰胺（Sigma-Aldrich）阻断30分钟。用950µL PBS稀释反应物，并在1400g下离心3分钟。去除上清液。然后向珠子中加入200µL 2 M尿素/PBS、2µL 100 mM氯化钙水溶液和4µL胰蛋白酶（20µg在40µL胰蛋白缓冲液Promega中复溶）的预混合溶液，并在37°C下搅拌过夜。第二天，将混合物转移到生物旋转过滤器中，通过离心（1000g）将消化后的溶液洗脱到低粘附管中。洗脱液用5%甲酸酸化。如图2c所示，进行了一系列使用黄芩苷探针的SILAC-ABPP实验，可以与天然黄芩苷化合物竞争或不竞争。简而言之，轻蛋白质组总是用DMSO处理，并通过紫外线诱导的光交联用baicalin/黄芩苷BP探针标记，然后与如下所述处理的重蛋白质组混合。在“BP对照”实验中，重蛋白质组用DMSO处理，并用紫外线照射的空白DMSO溶液标记。在“紫外线对照”实验中，重蛋白质组用DMSO处理，并用黄芩苷BP探针标记，但没有紫外线辐射。在“CP对照”实验中，重蛋白质组用DMSO处理，并用黄芩苷CP探针（即不含二苯甲酮部分）在紫外线照射下标记。在“竞争”实验中，重蛋白质组与黄芩苷竞争，并用黄芩苷BP探针用紫外辐射标记。三个对照实验旨在消除与探针间接和/或非特异性结合的假阳性靶标。每个对照和竞争实验进行三次重复，所有定量的蛋白质都列在数据集S1中。

肾脏缺血再灌注模型[1]
将大鼠随机分为五组，每组六只：（i）假手术组；（ii）IR+生理盐水组；（iii）IR+黄芩苷（1 mg/kg）组；（iv）IR+黄芩苷（10 mg/kg）组；（v）IR+黄芩苷（100 mg/kg）组。采用左肾动脉夹闭45分钟并切除右肾的方法诱导肾脏缺血再灌注损伤[18]。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg体重）麻醉。经腹部正中切口后，用止血钳夹闭左肾动脉45分钟。解除止血钳后，检查血流恢复情况，然后缝合腹部。随后切除右肾。假手术组动物接受了相同的手术操作，但不进行肾脏夹闭。

生理盐水组动物在肾脏夹闭前30分钟腹腔注射1 mL 0.9%无菌氯化钠溶液。黄芩苷组大鼠在肾脏夹闭前30分钟腹腔注射黄芩苷溶液（用无菌生理盐水稀释至1、10或100 mg/kg体重）。术后，大鼠置于保温毯上12小时，并提供食物和水。所有动物均在术后24小时用戊巴比妥钠过量麻醉处死，并采集血液和肾脏组织。

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所有小鼠（C57BL/6j）均饲养于温度控制屏障设施内，光照/黑暗周期为12小时，并可自由获取食物和水。本研究仅使用雄性小鼠。本研究采用按体重分层的随机区组设计。每组选取5只小鼠以达到统计学显著性。研究采用随机、对比和单盲试验。野生型同窝小鼠在6周龄时开始接受高脂饮食（60%热量来自脂肪，Research Diets Inc.）或标准饲料（10%热量来自脂肪，Research Diets Inc.）的饮食干预，持续24周(11)。在饮食干预12周后，开始每日灌胃给予400 mg/kg黄芩苷（40 mg/mL生理盐水储备液）(12)，并持续12周，之后分析这些小鼠的代谢变化和脂肪变性相关症状。[3]

该剂量选择基于一项先前的药代动力学研究，该研究测得黄芩苷在摄入后6小时的最终血浆浓度为0.8 μg/mL [3]。
由于黄芩苷的生物利用度较低，我们在动物实验中采用了相对较高（但安全）的剂量。根据先前的药代动力学分析，口服400 mg/kg黄芩苷后，其血浆稳态浓度预计为0.8 μg/mL (41)。因此，可以设想，通过药物化学优化黄芩苷的构效关系，并结合对CPT1-黄芩苷相互作用的更深入的结构研究，有望获得具有更佳药效学和药代动力学的新型合成抗肥胖药物。为此，我们初步探索了一种乙酰化衍生物Ac-黄芩苷的活性，预计该衍生物具有更高的生物利用度。结果表明，通过乙酰化对黄酮类化合物核心进行结构修饰会破坏 CPT1A 的结合，而 CPT1A 活化的丧失会消除 Ac-黄芩苷的降脂作用（SI 附录，图 S20）。[3]

[1]. The protective effect of Baicalin against renal ischemia-reperfusion injury through inhibition of inflammation and apoptosis. BMC Complement Altern Med. 2014 Jan 13;14:19.

[2]. Baicalin protects against thrombin induced cell injury in SH-SY5Y cells. Int J Clin Exp Pathol. 2015 Nov 1;8(11):14021-7.

[3]. Chemoproteomics reveals baicalin activates hepatic CPT1 to ameliorate diet-induced obesity and hepatic steatosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018;115(26):E5896-E5905.

黄芩苷是黄芩素的7-O-葡萄糖醛酸苷，属于糖苷氧基黄酮。它是中药黄芩的活性成分。黄芩苷具有多种药理活性，包括非甾体类抗炎药、EC 3.4.21.26（脯氨酰寡肽酶）抑制剂、前药、植物代谢产物、铁死亡抑制剂、神经保护剂、抗肿瘤剂、心脏保护剂、抗动脉粥样硬化剂、抗氧化剂、EC 2.7.7.48（RNA指导的RNA聚合酶）抑制剂、抗冠状病毒剂和抗菌剂。它是一种葡萄糖醛酸、糖苷氧基黄酮、二羟基黄酮和单糖衍生物，在功能上与黄芩素相关。它是黄芩苷(1-)的共轭酸。
据报道，黄芩苷存在于匍匐黄芩、攀缘黄芩以及其他有相关数据的生物体中。
另见：黄芩根（部分）。

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背景：肾脏缺血再灌注损伤（IRI）会增加肾移植术后急性肾衰竭、移植肾功能延迟恢复和早期死亡率。其病理生理机制包括氧化应激、线粒体功能障碍和免疫介导的损伤。黄芩苷是从黄芩中分离得到的一种黄酮苷，其抗氧化、抗凋亡和抗炎特性已被证实。因此，本研究评估了黄芩苷对大鼠肾脏IRI的影响。方法：在肾脏缺血前30分钟腹腔注射黄芩苷。再灌注24小时后采集血清和肾脏组织。评估肾功能和组织学变化。同时检测氧化应激标志物、Toll样受体（TLR）2和TLR4信号通路、线粒体应激和细胞凋亡。结果：黄芩苷治疗可降低氧化应激和组织学损伤，改善肾功能，并抑制促炎反应和肾小管细胞凋亡。黄芩苷预处理还降低了TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB和p-IκB蛋白的表达，降低了caspase-3活性，并提高了Bcl-2/Bax比值。结论：黄芩苷可能通过抑制促炎反应和线粒体介导的细胞凋亡来减轻肾脏缺血再灌注损伤。这些作用与TLR2/4信号通路和线粒体应激有关。 [1]

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黄芩苷是从黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）干燥根中提取的物质，已被证实具有神经保护作用。然而，其确切机制尚不完全清楚。本研究旨在探讨黄芩苷对凝血酶诱导的SH-SY5Y细胞损伤的影响，并探索其可能的机制。将SH-SY5Y细胞单独用凝血酶处理，或先用不同浓度的黄芩苷（5、10、20 μM）预处理2小时，再用凝血酶处理。未用凝血酶和黄芩苷处理的细胞作为对照。采用MTT法检测细胞活力。采用流式细胞术分析细胞凋亡。采用实时定量PCR检测蛋白酶激活受体1（PAR-1）的mRNA表达水平。采用Western blotting检测PAR-1、Caspase-3和NF-κB的蛋白表达水平。黄芩苷以剂量依赖的方式降低凝血酶处理后的细胞死亡，同时抑制NF-κB活化和PAR-1表达。此外，黄芩苷还降低了Caspase-3的表达。上述结果表明，黄芩苷可能通过抑制PAR-1表达和NF-κB活化来预防凝血酶刺激后的细胞损伤。[2]

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肥胖及相关代谢性疾病正成为全球流行病，导致死亡率上升和医疗保健成本高昂。目前尚未找到有效的治疗方法。基于黄芩苷（一种来自中药黄芩的黄酮类化合物）具有独特的抗脂肪变性活性这一观察结果，我们进行了定量化学蛋白质组学分析，并鉴定出肉碱棕榈酰转移酶1 (CPT1)（脂肪酸氧化的调控酶）是黄芩苷的关键靶点。黄酮类化合物直接激活肝脏CPT1亚型，具有选择性，从而加速脂质流入线粒体进行氧化。长期服用黄芩苷可改善饮食诱导的肥胖（DIO）和肝脂肪变性，并系统性地改善其他代谢紊乱。破坏黄芩苷在CPT1上的预测结合位点可完全消除该黄酮类化合物的有益作用。我们发现黄芩苷作为一种变构CPT1激活剂，为DIO及其相关后遗症的药物治疗开辟了新的途径。[3]

C21H18O11

446.36

446.084

C, 56.51; H, 4.06; O, 39.43p

21967-41-9

21967-41-9;

64982

Light yellow to yellow solid powder

1.7±0.1 g/cm3

836.6±65.0 °C at 760 mmHg

202-205 ºC

297.2±27.8 °C

0.0±3.2 mmHg at 25°C

1.740

0.31

187.12

6

11

4

32

748

5

C1=CC=C(C=C1)C2=CC(=O)C3=C(C(=C(C=C3O2)O[C@H]4[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O4)C(=O)O)O)O)O)O)O

IKIIZLYTISPENI-ZFORQUDYSA-N

InChI=1S/C21H18O11/c22-9-6-10(8-4-2-1-3-5-8)30-11-7-12(14(23)15(24)13(9)11)31-21-18(27)16(25)17(26)19(32-21)20(28)29/h1-7,16-19,21,23-27H,(H,28,29)/t16-,17-,18+,19-,21+/m0/s1

(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(5,6-dihydroxy-4-oxo-2-phenyl-chromen-7-yl)oxy-3,4,5-trihydroxy-tetrahydropyran-2-carboxylic acid

Baicalin； 21967-41-9; Baicalein 7-O-glucuronide; 7-D-Glucuronic acid-5,6-dihydroxyflavone; Baicalein 7-glucuronide; CHEBI:2981; MFCD00134418; 347Q89U4M5;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 100 mg/mL (~224.03 mM)
H2O : < 0.1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.60 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.60 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 20 mg/mL (44.81 mM) in 0.5% CMC-Na/saline water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。