DREADD; Dopamine receptor; muscarinic M4 receptor

氯氮平 N-氧化物 (CNO) 可以在 DREADD 激活所需的浓度下与非 DREADD 吸收结合，并经过逆转解读母体化合物氯平，氯氮平是一种非典型抗精神病药物，可作用于多种药理靶点并产生多种生理和行为影响[2]。

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在确认本文合成的氯氮平-N-氧化物/CNO和提取的氯氮平的生物活性的研究中，我们使用ERK1/2磷酸化测定作为与该受体相关的信号终点，测量了它们在细胞中激活M1 DREADD的能力。CNO和氯氮平产生了强效和有效的反应（pEC50 8.31 ± 0.12 10.32 ± 0.18;电子邮件74.8 ± 2.8 77.0 ± 3.7,分别见图3）。观察到的效力与该细胞系报告的商业CNO和氯氮平（Sigma-Aldrich）的效力相当（pEC50 8.50 ± 0.13 9.68 ± 0.28,分别）[4]。

在向小鼠单次腹膜内 (ip) 注射Clozapine-N-oxide (1 mg/kg) 后，Clozapine-N-oxide (CNO) 神经细胞水平在 15 分钟内达到高峰，2 小时后非常低。 CNO在小鼠体内的胚胎半期衰退，但对表达DREADD的实验动物进行迅速处理后所描述的生物学效应通常要长分裂（6-10小时）[1]。

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长期以来，Clozapine-N-oxide/氯氮平-N-氧化物（CNO）一直是选择性激活仅由设计药物激活的设计受体（DREADDs）的首选配体。然而，最近的研究对长期以来认为CNO在药理学上是惰性的说法提出了质疑。本研究旨在1）确定氯氮平-N-氧化物/CNO是否在小鼠体内逆代谢为其母体化合物氯氮平（如最近在大鼠中报道的那样），2）确定CNO是否在大鼠和/或小鼠体内产生氯氮平样的感受内刺激作用。在给予10.0 mg/kg的CNO后，药代动力学分析重复了最近关于大鼠反向转化为氯氮平的报告，并表明这种现象也发生在小鼠身上。在训练区分1.25 mg/kg氯氮平和赋形剂的大鼠和小鼠中，CNO（1.0-20.0 mg/kg）平均对氯氮平刺激产生部分替代，在经常用于激活DREADDs的剂量下，在两种物种的一些个体动物中都检测到完全替代。目前的证明表明，CNO转化为氯氮平，并在小鼠和大鼠中产生类似氯氮平的行为效应，这进一步强调了在使用DREADD的研究中需要适当的对照组，并强调了药物鉴别程序作为筛查新型DREADD激动剂脱靶效应的工具的实用性。[1]

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体内活性[4]
在证实体内合成的氯氮平-N-氧化物/CNO的生物活性的研究中，我们研究了NI在大鼠体内的化学活化作用。使用具有强鸡β-肌动蛋白（CAG）启动子-AVA1/2-sCAG-hM3Dq-mCherry的腺相关病毒载体表达系统，在NI神经元中表达与mCherry荧光蛋白融合的修饰Gq偶联的人毒蕈碱受体hM3Dq。使用AAV1/2-sCAG-mCherry载体作为对照。将这种病毒载体微量注射到NI中导致NI胞体和近端突起中hM3Dq表达（以下简称NI-hM3Dq），如荧光mCherry puncta的存在所示（图4A，B）。相比之下，对照AAV1/2-sCAG-mCherry载体（以下称为NI mCherry）在NI细胞中产生大量红色细胞质荧光（数据未显示），如所述。我们已经证明，NI-hM3Dq大鼠的化学遗传NI激活会导致皮质觉醒、睡眠减少、运动活动增加和风险评估行为增加，所有这些都与一般觉醒的增加是一致的。此外，这些研究还表明，与对照NI mCherry大鼠相比，氯氮平-N-氧化物/Clozapine-N-oxide/CNO在体外激活hM3Dq导致NI神经元具有动作电位的长期去极化，并且外周注射CNO（3 mg/kg）显著增加了NI-hM3Dq大鼠神经元激活的即时早期基因标志物c-Fos的免疫染色。这些数据证实了通过CNO激活hM3Dq在体内对NI的功能性激活，以及CNO在对照NI-mCherry大鼠中缺乏作用。

细胞外信号调节激酶1/2磷酸化（pERK1/2）测定[4]
按照制造商的说明，使用基于Alpha Screen的Sure Fire试剂盒进行了测量M1 DREADD介导的ERK1/2磷酸化刺激的检测。简而言之，将稳定表达M1 DREADD的FlpIn-CHO细胞以每孔40000个细胞的速度接种到96孔培养板中，并使其粘附。然后用磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞，并在37℃下在无血清培养基中保持过夜 °C，5%二氧化碳。第二天，用激动剂刺激细胞。进行了初步的pERK1/2时间过程实验，以确定Clozapine-N-oxide/氯氮平-N-氧化物/CNO和氯氮平的ERK1/2最大磷酸化时间（发现为5 两种配体的最小值）。然后使用峰值激动剂反应的时间来建立浓度反应曲线。在所有实验中，10%（v/v）胎牛血清（FBS）用作pERK1/2的阳性对照。通过移除培养基和加入裂解缓冲液终止反应。样品按照试剂盒说明进行处理。使用POLARstar Omega板读数器测量荧光信号。将数据归一化为5%时10%（v/v）FBS引起的最大反应 min.

标准实验室大鼠和小鼠
大鼠剂量为 1.0、3.2、10.0 mg/kg；小鼠剂量为 1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 mg/kg
i.p.

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仅当动物满足严格的性能标准时才进行替代试验（参见补充方法和材料）。为了确认氯氮平刺激的选择性及其对行为反应的控制，对大鼠进行了测试，分别使用赋形剂或多种剂量的氯氮平（0.0395、0.125、0.395、1.25 mg/kg）、混合多巴胺/血清素/去甲肾上腺素拮抗剂奥氮平（1.0 mg/kg）和利培酮（0.56 mg/kg）、α1-肾上腺素能受体拮抗剂哌唑嗪（0.56 mg/kg）以及β-肾上腺素能受体拮抗剂普萘洛尔（10.0 mg/kg）。同样，我们用赋形剂和不同剂量的氯氮平（0.156、0.3125、0.625、0.88、1.25 mg/kg）、奥氮平（0.5 mg/kg）、非选择性5-羟色胺2型受体拮抗剂利坦色林（16.0 mg/kg）、哌唑嗪（10.0 mg/kg）以及非选择性多巴胺D2样受体拮抗剂氟哌啶醇（0.1 mg/kg）对小鼠进行了测试。之所以使用上述剂量的奥氮平、利坦色林、哌唑嗪和氟哌啶醇，是因为我们观察到较高剂量会产生非特异性的心率抑制作用。为了检测氯氮平-N-氧化物/CNO诱导的氯氮平样效应，在测试前，给动物分别给予氯氮平-N-氧化物/CNO（大鼠：1.0、3.2、10.0 mg/kg；小鼠：1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 mg/kg）。所有药物和剂量均以随机顺序给予每只受试动物。[1]

血液样本采集和分析[1]
如前所述²⁴，对大鼠进行手术，植入慢性留置颈内静脉导管，以便快速重复采集血液样本。血液采集在术后至少两周开始。在测试当天，大鼠分别接受氯氮平（1.25 mg/kg）或氯氮平-N-氧化物/CNO（1.0、10.0 mg/kg）给药，随后放回笼中。给药后30分钟和60分钟，通过静脉导管抽取血样（每次0.4–0.5 ml，每5秒抽取约0.1 ml）。为保持导管通畅，在两次采血之间以及两次测试之间，不使用导管时，用抑菌生理盐水冲洗导管，并用0.1 ml肝素化生理盐水（300 IU/ml）封管。所有受试者的试验间隔至少 2 周，并按以下顺序进行：（1）10.0 mg/kg CNO，（2）1.25 mg/kg 氯氮平，（3）1.0 mg/kg CNO。

小鼠分别注射氯氮平（1.25 mg/kg）或氯氮平-N-氧化物/CNO（10.0 mg/kg），然后放回笼中。在预定采血时间点前 2-3 分钟，将每只小鼠放入有机玻璃麻醉诱导箱中，吸入 4-5% 异氟烷直至失去活动能力，然后转移至持续吸入 1-2% 异氟烷的鼻腔导管中。确认小鼠深度麻醉后，暴露心脏，并将连接 1 ml 注射器的 23G 针头插入左心室。抽取0.4–0.5 ml血液，并按照上述大鼠血液样本采集方法进行处理。

所有血液样本均置于含有10 μl肝素化生理盐水（500 IU/ml）的1.7 ml离心管中，并置于冰上保存，直至在室温下以800 g离心10分钟。然后取出血浆，置于另一个无菌1.7 ml离心管中，并于−80 °C保存，直至后续通过UPLC-LC/MS/MS进行分析（参见补充材料和方法）。

氯氮平、奥氮平、利培酮、氟哌啶醇、哌唑嗪、普萘洛尔和利坦色林均溶于蒸馏水中，并加入2–3滴乳酸，用NaOH调节pH至6.0–7.0。在小鼠药物辨别研究中，CNO 也溶解于该溶剂中。在大鼠药物辨别研究以及小鼠和大鼠药代动力学分析中，氯氮平-N-氧化物CNO 溶解于含有 2.5–5.0% (v/v) 二甲基亚砜 (Sigma-Aldrich) 和 10% Cremophor EL 的抑菌生理盐水中。

在小鼠药物辨别研究中，所有药物均在实验开始前 30 分钟以 10 ml/kg 的剂量皮下注射给药。在大鼠药物辨别研究中，所有药物均以 1 ml/kg 的剂量腹腔注射给药。氯氮平在实验开始前 60 分钟给药，而奥氮平、利培酮、哌唑嗪和普萘洛尔在实验开始前 30 分钟给药。氯氮平-N-氧化物/CNO 在预处理 30 分钟和 60 分钟时均进行了测试。所有药物剂量均以盐重表示。

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大鼠体内食物和水摄入量试验[4]
使用当天，将CNO/氯氮平-N-氧化物溶解于无菌生理盐水中，浓度为1 mg/ml，并以1或3 mg/kg的剂量腹腔注射(ip)给大鼠，或注射等体积的无菌生理盐水。行为学测试中，大鼠于第1天腹腔注射无菌生理盐水，然后放回笼中，并提供预先称重的食物和水，记录注射后4小时的摄入量。第2天重复测试，大鼠腹腔注射CNO，剂量为1或3 mg/kg。CNO/氯氮平-N-氧化物注射后的食物和水摄入量以生理盐水注射后的摄入量进行标准化，其中1代表等效摄入量。采用非配对 t 检验来计算各组之间的统计学差异。

代谢/代谢物
氯氮平-N-氧化物是氯氮平在人体内的已知代谢物。

小鼠口服LD50为245 mg/kg，行为学表现为共济失调。《捷克斯洛伐克化学通讯》43(309), 1978

[1]. Sci Rep. 2018 Mar 1;8(1):3840.

[2]. Front Pharmacol. 2019 Jun 4:10:628.

[3]. Eur J Pharmacol. 1994 Nov 15;269(3):R1-2.

[4]. MethodsX. 2018 Mar 23:5:257-267.

氯氮平N-氧化物是一种二苯并二氮卓类药物。LASSBio-579是一种N-苯基哌嗪类抗精神病先导化合物，此前已有报道称其为D2受体（D2R）配体，并在精神分裂症啮齿动物模型中具有抗精神病样活性。为了更好地理解LASSBio-579及其主要代谢物LQFM 037的分子作用机制，我们决定验证其对D2R的功能选择性假设。我们使用了瞬时共表达人D2受体长亚型（D2LR）的HEK-293T细胞和基于生物发光共振能量转移（BRET）的生物传感器。在亚最大浓度多巴胺（DA）存在下，分别于5分钟和20分钟后评估了不同浓度化合物的拮抗活性。对于这两种信号通路，氟哌啶醇、氯氮平和我们的化合物均以浓度依赖的方式发挥多巴胺拮抗剂的作用，其中氟哌啶醇的效力最强，这与其在结合实验中测得的纳摩尔级D2受体亲和力相符。在我们的实验条件下，只有氟哌啶醇表现出显著的功能选择性，其抑制β-arrestin-2 (β-arr2) 转位的效率比拮抗Gi激活的效率高四到五倍。本研究首次报道了LASSBio-579和LQFM 037对β-arr2信号通路的影响，并进一步表明功能活性可能因实验条件和方法而异。[2]

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氯氮平在表达于中国仓鼠卵巢细胞中的人毒蕈碱M1-M5受体的功能测定中进行了研究。氯氮平是毒蕈碱M4受体的完全激动剂（EC50 = 11 nM），可抑制福斯克林刺激的cAMP积累。相反，氯氮平能有效拮抗其他四种毒蕈碱受体亚型激动剂诱导的反应。选择性刺激M4受体可能部分解释了临床上观察到的氯氮平引起的唾液分泌过多。此外，氯氮平独特的整体毒蕈碱特性可能有助于其非典型抗精神病疗效。[3] 毒蕈碱乙酰胆碱受体DREADDs的日益广泛应用导致对氯氮平纳米颗粒（CNO）的需求不断增长，但大多数商业供应商的高昂价格阻碍了该技术的大规模应用。本研究报道了一种从市售（药房）片剂中简便获取氯氮平的方法，并通过Oxone氧化将其转化为CNO。基于原材料成本（氯氮平片剂的成本约为14美元/克；试剂成本极低），在不计人工成本的情况下，CNO可以以相近的价格生产，收率可达97%。相比之下，代表性供应商的CNO商业价格分别为53,000美元/克、24,000美元/克和6,700美元/克。AMT Pty Ltd公司已采用目前的方法，并进行了一些专有改进，从而去除了甲醇。现在，AK Scientific公司以420美元/克的价格供应采用该方法生产的商业产品，这大大降低了这种重要试剂的成本。希望这项工作能够支持DREADD技术的持续发展，并加深对大脑功能及相关行为的理解。[4]

C18H19CLN4O

342.82266

342.124

C, 63.06; H, 5.59; Cl, 10.34; N, 16.34; O, 4.67

34233-69-7

Clozapine; 5786-21-0; Clozapine N-oxide dihydrochloride; 2250025-93-3; 54241-01-9 (HCl); 34233-69-7 (N-oxide); 5786-21-0

135445691

Light yellow to yellow solid powder

1.36g/cm3

517.4ºC at 760mmHg

190-248ºC

266.7ºC

1.685

0.76

57.06

1

3

1

24

491

0

[O-][N+]1(C)CCN(C2=NC3=CC(Cl)=CC=C3NC4=CC=CC=C42)CC1

OGUCZBIQSYYWEF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C18H19ClN4O/c1-23(24)10-8-22(9-11-23)18-14-4-2-3-5-15(14)20-16-7-6-13(19)12-17(16)21-18/h2-7,12,20H,8-11H2,1H3

3-chloro-6-(4-methyl-4-oxidopiperazin-4-ium-1-yl)-11H-benzo[b][1,4]benzodiazepine

Clozapine N-oxide; Clozapine N-oxide; 34233-69-7; N-Oxyclozapine; UNII-MZA8BK588J; MZA8BK588J; VUFB-12426; NSC-750266; 8-Chloro-11-(4-methyl-1-piperazinyl)-5H-dibenzo(b,e)(1,4)diazepine N-oxide;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 68~100 mg/mL (198.4~291.7 mM)
Water: ~68 mg/mL
Ethanol: ~8 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 0.5 mg/mL (1.46 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 0.5 mg/mL (1.46 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 6 中的溶解度: 5%DMSO+ 40%PEG300+ 5%Tween 80+ 50%ddH2O: 3.4mg/ml (9.92mM)

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配方 7 中的溶解度: 2.44 mg/mL (7.12 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶 (<60°C).

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。