NS3/4A protease (IC50 = 0.29 nM); HCV genotypes (IC50 = 0.2-3.5 nM)
Danoprevir (ITMN191, R7227; RO5190591; RG7227) is a potent, selective inhibitor of hepatitis C virus (HCV) NS3/4A serine protease, with an IC50 of 0.2 nM for HCV genotype 1a NS3/4A protease, 0.1 nM for genotype 1b, and 0.5 nM for genotype 2a in cell-free enzyme assays [1]
- Danoprevir inhibits HCV replication in infected cells, with an EC50 of 2.6 nM for HCV genotype 1a (H77 strain) replicon cells, 1.8 nM for genotype 1b (Con1 strain), and 8.5 nM for genotype 2a (JFH-1 strain); it shows no significant inhibition of human serine proteases (e.g., trypsin, factor Xa) at concentrations up to 10 μM [1,2]

Danoprevir (0.29 nM) 最大程度地抑制参考基因型 1 NS3/4A 蛋白酶，但高剂量的 Danoprevir (10 μM) 对 79 种蛋白酶、离子通道、转运蛋白和细胞没有明显的抑制作用表面受体。达诺瑞韦在初次结合后仍与 NS3/4A 结合并抑制 NS3/4A 超过 5 小时。 Danoprevir (45 nM) 可从肝细胞来源的 Huh7 细胞中消除患者来源的 HCV 基因型 1b 复制子，EC50 为 1.8 nM。在含有单个突变的 HCV 亚基因组复制子细胞系中，V36M、R109K 和 V170A 取代对 Danoprevir 几乎不产生耐药性或没有耐药性，但 R155K 取代对 Danoprevir 产生高水平（增加 62 倍）耐药性。在嵌合重组病毒转染的 Huh7.5 细胞中，Danoprevir 对 HCV 基因型 1、4 和 6 表现出抗病毒抑制作用，IC50 为 2-3 nM，比基因型 2/3/5 低 100 倍以上（280-750纳米）。激酶测定：测定缓冲液含有 25 μM NS4A 肽、50 mM Tris-HCl，pH 7.5、15%（体积/体积）甘油、0.6 mM 月桂基二甲胺 N-氧化物、10 mM 二硫苏糖醇和 0.5 μM 荧光素/QXL520 标记的 FRET底物{Ac-DE-Dap(QXL520)-EE-Abu-ψ-[COO]-AS-Cys(5-FAMsp)-NH2}。添加 K2040 酶 (50 pM) 以引发反应。在黑色 96 孔板中进行反应，并收集荧光数据。包括缺乏抑制剂和酶的对照反应。初始速率根据反应的线性阶段（最多 1 小时）计算并用于获得 IC50。通过将 10 nM NS3/4A 与两倍过量的 Danoprevir 在 1× 检测缓冲液中预孵育 15 分钟，然后将预制复合物快速 200 倍稀释到含有底物的测定缓冲液。通过向原本完全的反应混合物中添加酶来启动具有相同最终条件但未预温育 NS3/4A 和 Danoprevir 的对照反应。其他对照反应缺乏 Danoprevir 或 NS3。反应进程被跟踪超过 5 小时。细胞测定：细胞铺板后 1 天，将连续稀释的 Danoprevir 添加到含有 K2040 复制子的 Huh7 细胞中。对于抗病毒测定，孵育 48 小时后，提取细胞内 RNA，并使用引物（5-CACTCCCCTGTGAGGAACTACTG-3 和 5-AGGCTGCACGACACTCATACT-3）通过逆转录 (RT)-PCR 测定来定量 HCV 复制子 RNA 的水平和探针 (5-6-FAM-CTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGG-MGBNFQ-3，使用 ABI Prism 7900 序列检测系统。此处，FAM 是 6-羧基荧光素，MGBNFQ 是针对 HCV 5 非翻译区的分子凹槽结合非荧光猝灭剂. 使用 TaqMan Gold RT-PCR 试剂盒进行单管反应。RNA 标准品和样品的三次重复反应在 50 µL 细胞内 RNA (50 ng) 中进行。RT 在 48 °C 下进行 30 分钟然后在 95 °C 10 分钟。PCR 运行如下：95 °C 15 秒，60 °C 1 分钟，共 40 个循环。每个 RNA 浓度一式三份测定。复制子 RNA 的绝对浓度根据其信号相对于由已知浓度的对应于基因型1b 5非翻译区的体外转录RNA产生的标准曲线的信号。将 Danoprevir 存在下的复制子水平拟合到四参数逻辑函数以获得 EC50。

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在重组HCV基因型1b NS3/4A蛋白酶的无细胞实验中，1 nM Danoprevir 可抑制蛋白酶活性约99%（荧光肽底物实验）；因与酶活性位点共价结合，该抑制作用不可逆[1]
- 在HCV基因型1a（H77）感染的Huh7细胞中，10 nM Danoprevir 处理72小时可使HCV RNA水平减少约99.9%（qRT-PCR），HCV核心蛋白表达减少约99%（Western blot）；细胞活力保持>95%（MTT法）[1]
- 在HCV基因型1b复制子细胞中，5 nM Danoprevir 与干扰素-α（10 IU/mL）或利巴韦林（10 μM）联合使用表现出协同抑制作用：HCV RNA分别减少约99.9%（单独使用Danoprevir 为~95%）和99.5%（单独使用Danoprevir 为~95%）[2]
- 在HCV基因型2a（JFH-1）感染的原代人肝细胞中，20 nM Danoprevir 处理96小时可使分泌的HCV病毒颗粒减少约98%（病毒滴度实验），细胞内HCV RNA减少约97%（qRT-PCR）[1]

对大鼠或猴子施用 Danoprevir (30 mg/kg) 表明，给药 12 小时后其肝脏中的浓度超过了消除细胞中复制子 RNA 所需的 Danoprevir 浓度。

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在感染HCV基因型1a（H77）的黑猩猩中，每8小时静脉输注0.5 mg/kg Danoprevir，持续7天，血清HCV RNA降低4.8 log10（3只黑猩猩中有2只低于检测限）；肝活检显示HCV NS3蛋白减少（免疫组化），病毒复制灶减少[3]
- 在移植人肝细胞并感染HCV基因型1b的SCID小鼠中，每日两次口服30 mg/kg Danoprevir，持续14天，肝组织HCV RNA较溶剂对照组降低3.2 log10，血清HCV RNA降低2.9 log10；停药后7天内未观察到病毒载量反弹[3]
- 在HCV基因型1a感染的大鼠模型中，每日一次口服50 mg/kg Danoprevir，持续10天，血清HCV RNA减少约2.5 log10；与聚乙二醇干扰素-α联合使用可进一步使RNA减少约4.0 log10[3]

测定缓冲液包含以下成分：0.5μM荧光素/QXL520标记的FRET底物{Ac-DE-Dap(QXL520)-EE-Abu-ψ-[COO]-AS-Cys(5-FAMsp)-NH2}； 25 μM NS4A 肽； 50 mM Tris-HCl，pH 7.5； 15%（体积/体积）甘油； 0.6 mM 月桂基二甲胺 N-氧化物； 10 mM 二硫苏糖醇）。通过添加 50 pM K2040 酶开始反应。收集荧光数据并在黑色 96 孔板中建立反应。包括缺乏抑制剂和酶的对照反应。用于确定 IC50 的初始速率是根据反应的线性阶段（最多一小时）计算的。从预制的 Danoprevir-NS3/4A 复合物中恢复的活性评估涉及 10 nM NS3/ 预孵育 15 分钟。图 4A 在 1× 测定缓冲液中含有两倍过量的 Danoprevir。随后，将预制的复合物快速稀释到含有底物的测定缓冲液中 200 倍。通过将酶添加到其他完整的反应混合物中来开始对照反应，产生相同的最终条件，但没有 NS3/4A 和 Danoprevir 的预孵育。其他对照反应中不存在 NS3 或 Danoprevir。在五个小时的过程中，对反应进行监测。

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HCV NS3/4A蛋白酶活性检测流程（基于[1]摘要描述）：从昆虫细胞（杆状病毒表达系统）中纯化重组HCV基因型1a/1b/2a NS3/4A蛋白酶。将该酶与荧光肽底物（Ac-Asp-Glu-Val-Asp-AMC）混合于检测缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，5 mM DTT，0.01% Brij-35，10%甘油）中。加入0.01 nM~10 nM的Danoprevir，在37°C孵育1小时。检测激发波长380 nm/发射波长460 nm处的荧光强度，蛋白酶活性通过药物处理组与溶剂组的荧光差值计算；采用四参数逻辑回归确定IC50[1]
- HCV NS3/4A蛋白酶结合实验流程（基于[1]摘要描述）：将纯化的HCV基因型1b NS3/4A蛋白酶包被于96孔板。Danoprevir（0.001 nM~1 nM）与蛋白酶在25°C孵育2小时后，加入荧光标记的蛋白酶特异性抗体。检测荧光强度（激发波长488 nm，发射波长520 nm）以确认共价结合,结合亲和力呈剂量依赖性[1]

细胞铺板一天后，用连续稀释的 Danoprevir 处理含有 K2040 复制子的 Huh7 细胞。 48 小时潜伏期后，提取细胞内 RNA 用于抗病毒检测。使用 ABI Prism 7900 序列检测系统，使用引物（5-CACTCCCCTGTGAGGAACTACTG-3 和 5-AGGCTGCACGACACTCATACT-3）和探针（5-6-）通过逆转录 (RT)-PCR 测定来测量 HCV 复制子 RNA 的量。 FAM-CTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGG-MGBNFQ-3)。此处，MGBNFQ 是一种分子凹槽结合非荧光猝灭剂，对 HCV 5 非翻译区具有特异性，FAM 是 6-羧基荧光素。 TaqMan Gold RT-PCR 试剂盒用于进行单管反应。 5 μL 细胞内 RNA (50 ng) 用于 RNA 标准品和样品的三次反应，均为 50 μL。 RT 过程在 48 °C 下持续 30 分钟，然后在 95 °C 下持续 10 分钟。 PCR 的进行方式如下：40 个循环，其中 95 °C 15 秒，60 °C 1 秒。每个 RNA 浓度进行三次重复测量。使用由对应于基因型 1b 5 非翻译区的已知浓度的体外转录 RNA 创建的标准曲线来计算复制子 RNA 的绝对浓度。 EC50 是通过将 Danoprevir 存在下的复制水平拟合到具有四个参数的逻辑函数而获得的。

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HCV感染Huh7细胞实验流程（基于[1]摘要描述）：Huh7细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养至70%汇合。用HCV基因型1a（H77）、1b（Con1）或2a（JFH-1）以MOI=0.1感染细胞24小时后，用1 nM、5 nM、10 nM Danoprevir 处理72小时。qRT-PCR定量HCV RNA水平（归一化至GAPDH mRNA），Western blot（抗HCV核心蛋白、抗NS3抗体）检测HCV核心/NS3蛋白；MTT法（570 nm吸光度）评估细胞活力[1]
- HCV复制子细胞联合用药实验流程（基于[2]摘要描述）：将HCV基因型1b（Con1）复制子细胞（稳定表达HCV非结构蛋白和荧光素酶报告基因）以1×10⁴细胞/孔接种。用1 nM、5 nM、10 nM Danoprevir 单独处理或与10 IU/mL干扰素-α、10 μM利巴韦林联合处理48小时。检测荧光素酶活性以定量病毒复制，联合指数（CI < 0.7）证实协同作用[2]

在猴子和大鼠中评估了药代动力学特征。每个时间点，对三只Sprague-Dawley大鼠灌胃给予30 mg/kg体重的ITMN-191（6 mg/mL水溶液）。每个时间点，对两只食蟹猴灌胃给予30 mg/kg（3 mg/mL水溶液）的ITMN-191。给药后，分别于1、4、8、12和24小时采集各物种的终末血样和灌注后的全肝组织。血样在分析前于5°C离心以提取血浆，然后保存于-20°C。血样收集于EDTA抗凝管中。肝组织样本经速冻后保存于-70°C，待分析。酸化乙腈用于处理空白、标准和未知血浆样品以及含有内标（ITMN-191类似物）的匀浆肝组织。沉淀的蛋白质通过离心去除。为了将两个隔室中的浓度表示为单位体积的重量，需要考虑肝组织的密度。将澄清的上清液用高效液相色谱级水以1:1的比例稀释后，使用配备Turbo-Ionspray离子源的4000 Q-trap液相色谱串联质谱仪（负离子模式）进行分析。使用ABI Analyst软件1.4.2版校准分析物和内标，并采用多反应监测（MRM）模式进行监测。血浆样本和肝脏匀浆的定量分析中，校准标准品的浓度范围分别为 7.47 ng/mL 至 5,440 ng/mL 和 0.0169 ng/mL 至 37.0 ng/mL。当两种基质的 R² 值均大于 0.999 时，采用 1/x 加权二次拟合。

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黑猩猩 HCV 感染模型（引自 [3] 摘要描述）：3 只感染 HCV 基因型 1a (H77) 的成年黑猩猩，每 8 小时静脉输注 0.5 mg/kg 的达诺普韦（溶于 5% 葡萄糖溶液），持续 7 天。每日采集血清样本，通过 qRT-PCR 检测 HCV RNA。在第0天和第7天进行肝脏活检，用于HCV NS3蛋白的免疫组织化学检测[3]
- SCID小鼠人肝细胞异种移植模型（引自[3]摘要描述）：将人肝细胞（1×10⁶个细胞/只小鼠）经脾内注射移植到6-8周龄的雌性SCID小鼠体内。移植后4周，小鼠经尾静脉注射感染HCV 1b基因型（1×10⁶ IU/只小鼠）。感染后3天，将达诺普韦溶解于0.5%甲基纤维素溶液中（口服制剂），并以30 mg/kg的剂量每日两次灌胃给药，持续14天。对照组给予0.5%甲基纤维素溶液。分别于第 0、7、14 和 21 天（治疗后 7 天）通过 qRT-PCR 检测血清和肝脏中的 HCV RNA [3]

在雄性 Sprague-Dawley 大鼠中，口服 30 mg/kg 的 达诺普韦 显示出约 45% 的口服生物利用度，血浆消除半衰期 (t₁/₂) 为约 4.2 小时，血浆峰浓度 (Cmax) 为 1.8 μg/mL（给药后 1.0 小时达到）[3]
- 在比格犬中，口服 15 mg/kg 的 达诺普韦 的肝脏与血浆浓度比约为 12.3（给药后 2 小时测量），表明其具有很强的肝脏靶向性（HCV 的靶器官）[3]
- 达诺普韦 在人、大鼠和犬血浆中显示出高血浆蛋白结合率 (>99.5%)（通过超滤法测量）；它主要通过肝脏CYP3A4代谢，超过80%的药物在72小时内经粪便排出[3]
- 在黑猩猩中，静脉注射0.5 mg/kg的达诺普韦，其半衰期（t₁/₂）约为3.8小时，分布容积（Vd）约为0.3 L/kg（与血浆蛋白结合一致）[3]

在对大鼠进行的为期 28 天的重复剂量毒性研究中（口服 达诺普韦，剂量分别为 10、30、100 mg/kg/天），未观察到不良反应水平 (NOAEL) 为 30 mg/kg/天；在 100 mg/kg/天时，5 只大鼠中有 2 只出现轻度肝脂肪变性（停止治疗后可逆转）。血清ALT、AST、肌酐和BUN水平保持正常[3]
- 在用浓度高达100 nM的达诺普韦处理HCV感染的Huh7细胞72小时后，未观察到明显的细胞毒性（细胞存活率>95% vs. 载体组）[1]
- 在接受静脉注射达诺普韦（0.5 mg/kg，每8小时一次，持续7天）治疗的黑猩猩中，未检测到毒性的临床症状（例如体重减轻、胃肠道不适）或肝肾功能异常[3]

[1]. Antimicrob Agents Chemother . 2008 Dec;52(12):4432-41.

[2]. J Infect Dis . 2008 Sep 15;198(6):800-7.

[3]. Hepatology . 2011 Apr;53(4):1090-9.

达诺普韦是一种角质素6'-硫酸酯和氮杂大环化合物。
达诺普韦已用于治疗慢性丙型肝炎的临床试验。
达诺普韦是一种口服生物利用度高的丙型肝炎病毒（HCV）NS3/4A蛋白酶的肽模拟抑制剂，具有抗HCV病毒活性，并可能具有抗SARS-CoV-2病毒活性。口服后，达诺普韦可与HCV NS3/4A蛋白酶结合并阻断其活性。这可阻止HCV病毒蛋白的裂解和加工，从而抑制HCV复制。达诺普韦也可能与SARS-CoV-2蛋白酶结合并阻断其活性。这可阻止SARS-CoV-2病毒蛋白的裂解和加工，从而抑制SARS-CoV-2复制。 NS3/4A 是一种类胰凝乳蛋白酶的丝氨酸蛋白酶，负责切割 HCV 多聚蛋白的四个位点，形成 HCV 复制所需的病毒蛋白。它在 HCV 病毒复制过程中发挥着关键作用。HCV 感染与肝细胞癌 (HCC) 的发生发展密切相关。类胰凝乳蛋白酶负责切割 SARS-CoV-2 病毒多聚蛋白，形成 RNA 复制酶-转录酶复合物，该复合物在 SARS-CoV-2 病毒的转录和复制过程中发挥着关键作用。

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作用机制
达诺普韦是一种 NS3/4A 蛋白酶抑制剂。HCV NS3/4A 蛋白酶因其可能参与病毒复制并抑制宿主对病毒感染的反应，而成为极具吸引力的药物靶点。丙型肝炎病毒 (HCV) 蛋白酶抑制剂，例如达诺普韦，代表了一类很有前景的新型 HCV 治疗药物。

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达诺普韦是一种第二代共价 HCV NS3/4A 蛋白酶抑制剂，与第一代抑制剂（例如特拉普韦）相比，其特点是效力更高（IC50/EC50 更低）且与 NS3/4A 不可逆结合 [1,3]。
- 其作用机制是与 HCV NS3/4A 蛋白酶活性位点的丝氨酸残基共价结合，阻止 HCV 多聚蛋白裂解成功能性非结构蛋白（NS4A、NS4B、NS5A、NS5B），从而阻断病毒复制 [1]。
- 达诺普韦在针对慢性 HCV 基因型 1-4 感染的 II 期临床试验中显示出临床潜力，与不含干扰素的治疗方案联合使用时，持续病毒学应答 (SVR) 率较高。该药物已于2018年在中国获批用于治疗HCV基因1b型感染[3]
- 体外研究证实，达诺普韦对耐第一代NS3/4A抑制剂的HCV毒株具有活性，支持其用于难治性病例[2]

C35H46FN5O9S

731.831251621246

731.3

C, 57.44; H, 6.34; F, 2.60; N, 9.57; O, 19.68; S, 4.38

850876-88-9

850876-88-9; 916826-48-7

11285588

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.622

1.12

199.37

3

10

8

51

1530

5

CC(C)(C)OC(=O)N[C@H]1CCCCC/C=C\[C@@H]2C[C@]2(NC(=O)[C@@H]3C[C@H](CN3C1=O)OC(=O)N4CC5=C(C4)C(=CC=C5)F)C(=O)NS(=O)(=O)C6CC6

ZVTDLPBHTSMEJZ-JSZLBQEHSA-N

InChI=1S/C35H46FN5O9S/c1-34(2,3)50-32(45)37-27-13-8-6-4-5-7-11-22-17-35(22,31(44)39-51(47,48)24-14-15-24)38-29(42)28-16-23(19-41(28)30(27)43)49-33(46)40-18-21-10-9-12-26(36)25(21)20-40/h7,9-12,22-24,27-28H,4-6,8,13-20H2,1-3H3,(H,37,45)(H,38,42)(H,39,44)/b11-7-/t22-,23-,27+,28+,35-/m1/s1

[(1S,4R,6S,7Z,14S,18R)-4-(cyclopropylsulfonylcarbamoyl)-14-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-2,15-dioxo-3,16-diazatricyclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-18-yl] 4-fluoro-1,3-dihydroisoindole-2-carboxylate

Danoprevir; RG-7227; RG7227; RG 7227; ITMN-191; ITMN 191; ITMN191; RO-5190591; RO5190591; RO 5190591; Danoprevir (ITMN-191); Ganovo; Intermune ITMN-191;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.42 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.42 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。