Danoprevir ( ITMN191, R7227; RO5190591; RG7227)   中文名称: 丹诺普韦

NS3/4A protease (IC50 = 0.29 nM); HCV genotypes (IC50 = 0.2-3.5 nM)

体外活性：Danoprevir (0.29 nM) 最大程度地抑制参考基因型 1 NS3/4A 蛋白酶，但高剂量的 Danoprevir (10 μM) 对 79 种蛋白酶、离子通道、转运蛋白和细胞没有明显的抑制作用表面受体。达诺瑞韦在初次结合后仍与 NS3/4A 结合并抑制 NS3/4A 超过 5 小时。 Danoprevir (45 nM) 可从肝细胞来源的 Huh7 细胞中消除患者来源的 HCV 基因型 1b 复制子，EC50 为 1.8 nM。在含有单个突变的 HCV 亚基因组复制子细胞系中，V36M、R109K 和 V170A 取代对 Danoprevir 几乎不产生耐药性或没有耐药性，但 R155K 取代对 Danoprevir 产生高水平（增加 62 倍）耐药性。在嵌合重组病毒转染的 Huh7.5 细胞中，Danoprevir 对 HCV 基因型 1、4 和 6 表现出抗病毒抑制作用，IC50 为 2-3 nM，比基因型 2/3/5 低 100 倍以上（280-750纳米）。激酶测定：测定缓冲液含有 25 μM NS4A 肽、50 mM Tris-HCl，pH 7.5、15%（体积/体积）甘油、0.6 mM 月桂基二甲胺 N-氧化物、10 mM 二硫苏糖醇和 0.5 μM 荧光素/QXL520 标记的 FRET底物{Ac-DE-Dap(QXL520)-EE-Abu-ψ-[COO]-AS-Cys(5-FAMsp)-NH2}。添加 K2040 酶 (50 pM) 以引发反应。在黑色 96 孔板中进行反应，并收集荧光数据。包括缺乏抑制剂和酶的对照反应。初始速率根据反应的线性阶段（最多 1 小时）计算并用于获得 IC50。通过将 10 nM NS3/4A 与两倍过量的 Danoprevir 在 1× 检测缓冲液中预孵育 15 分钟，然后将预制复合物快速 200 倍稀释到含有底物的测定缓冲液。通过向原本完全的反应混合物中添加酶来启动具有相同最终条件但未预温育 NS3/4A 和 Danoprevir 的对照反应。其他对照反应缺乏 Danoprevir 或 NS3。反应进程被跟踪超过 5 小时。细胞测定：细胞铺板后 1 天，将连续稀释的 Danoprevir 添加到含有 K2040 复制子的 Huh7 细胞中。对于抗病毒测定，孵育 48 小时后，提取细胞内 RNA，并使用引物（5-CACTCCCCTGTGAGGAACTACTG-3 和 5-AGGCTGCACGACACTCATACT-3）通过逆转录 (RT)-PCR 测定来定量 HCV 复制子 RNA 的水平和探针 (5-6-FAM-CTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGG-MGBNFQ-3，使用 ABI Prism 7900 序列检测系统。此处，FAM 是 6-羧基荧光素，MGBNFQ 是针对 HCV 5 非翻译区的分子凹槽结合非荧光猝灭剂. 使用 TaqMan Gold RT-PCR 试剂盒进行单管反应。RNA 标准品和样品的三次重复反应在 50 µL 细胞内 RNA (50 ng) 中进行。RT 在 48 °C 下进行 30 分钟然后在 95 °C 10 分钟。PCR 运行如下：95 °C 15 秒，60 °C 1 分钟，共 40 个循环。每个 RNA 浓度一式三份测定。复制子 RNA 的绝对浓度根据其信号相对于由已知浓度的对应于基因型1b 5非翻译区的体外转录RNA产生的标准曲线的信号。将 Danoprevir 存在下的复制子水平拟合到四参数逻辑函数以获得 EC50。

对大鼠或猴子施用 Danoprevir (30 mg/kg) 表明，给药 12 小时后其肝脏中的浓度超过了消除细胞中复制子 RNA 所需的 Danoprevir 浓度。

测定缓冲液包含以下成分：0.5μM荧光素/QXL520标记的FRET底物{Ac-DE-Dap(QXL520)-EE-Abu-ψ-[COO]-AS-Cys(5-FAMsp)-NH2}； 25 μM NS4A 肽； 50 mM Tris-HCl，pH 7.5； 15%（体积/体积）甘油； 0.6 mM 月桂基二甲胺 N-氧化物； 10 mM 二硫苏糖醇）。通过添加 50 pM K2040 酶开始反应。收集荧光数据并在黑色 96 孔板中建立反应。包括缺乏抑制剂和酶的对照反应。用于确定 IC50 的初始速率是根据反应的线性阶段（最多一小时）计算的。从预制的 Danoprevir-NS3/4A 复合物中恢复的活性评估涉及 10 nM NS3/ 预孵育 15 分钟。图 4A 在 1× 测定缓冲液中含有两倍过量的 Danoprevir。随后，将预制的复合物快速稀释到含有底物的测定缓冲液中 200 倍。通过将酶添加到其他完整的反应混合物中来开始对照反应，产生相同的最终条件，但没有 NS3/4A 和 Danoprevir 的预孵育。其他对照反应中不存在 NS3 或 Danoprevir。在五个小时的过程中，对反应进行监测。

细胞铺板一天后，用连续稀释的 Danoprevir 处理含有 K2040 复制子的 Huh7 细胞。 48 小时潜伏期后，提取细胞内 RNA 用于抗病毒检测。使用 ABI Prism 7900 序列检测系统，使用引物（5-CACTCCCCTGTGAGGAACTACTG-3 和 5-AGGCTGCACGACACTCATACT-3）和探针（5-6-）通过逆转录 (RT)-PCR 测定来测量 HCV 复制子 RNA 的量。 FAM-CTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGG-MGBNFQ-3)。此处，MGBNFQ 是一种分子凹槽结合非荧光猝灭剂，对 HCV 5 非翻译区具有特异性，FAM 是 6-羧基荧光素。 TaqMan Gold RT-PCR 试剂盒用于进行单管反应。 5 μL 细胞内 RNA (50 ng) 用于 RNA 标准品和样品的三次反应，均为 50 μL。 RT 过程在 48 °C 下持续 30 分钟，然后在 95 °C 下持续 10 分钟。 PCR 的进行方式如下：40 个循环，其中 95 °C 15 秒，60 °C 1 秒。每个 RNA 浓度进行三次重复测量。使用由对应于基因型 1b 5 非翻译区的已知浓度的体外转录 RNA 创建的标准曲线来计算复制子 RNA 的绝对浓度。 EC50 是通过将 Danoprevir 存在下的复制水平拟合到具有四个参数的逻辑函数而获得的。

In monkeys and rats, pharmacokinetic characteristics are assessed. An oral gavage treatment of 30-mg/kg of body weight (a 6-mg/mL solution in water) is given to three Sprague-Dawley rats per time point. ITMN-191 is given orally via gavage to two cynomolgus monkeys per time point at a dose of 30 mg/kg (three milligrams per milliliter in water). After the dose is administered, 1, 4, 8, 12, and 24 hours later, terminal blood samples and the whole perfused liver are taken for every species. Before being analyzed, blood samples are centrifuged at 5°C to extract plasma, then they are kept at -20°C. The samples are collected in EDTA. Liver samples are kept at −70°C after being snap-frozen, pending analysis. Acidified acetonitrile is used to treat blank, standard, and unknown plasma samples as well as homogenized liver containing an internal standard (ITMN-191 analog). Precipitated proteins are then removed by centrifugation. In order to express concentrations in both compartments as weight per unit volume, the density of liver tissue is taken into consideration. A 4000 Q-trap liquid chromatography tandem mass spectrometer equipped with a Turbo-Ionspray source operating in negative-ion mode is used to analyze the cleared supernatants after they have been diluted 1:1 into high-performance liquid chromatography grade water. ABI Analyst software, version 1.4.2, is used to calibrate the analytes and internal standards, and multiple-reaction monitoring scans are used for monitoring. For the quantification of plasma samples and liver homogenates, the calibration standards range from 7.47 ng/mL to 5,440 ng/mL and from 0.0169 ng/mL to 37.0 ng/mL, respectively. In situations where both matrices have an R2 value of > 0.999, quadratic fitting with 1/x weighting is applied.

[1]. Antimicrob Agents Chemother . 2008 Dec;52(12):4432-41.

[2]. J Infect Dis . 2008 Sep 15;198(6):800-7.

[3]. Hepatology . 2011 Apr;53(4):1090-9.

C35H46FN5O9S

731.83

731.30

C, 57.44; H, 6.34; F, 2.60; N, 9.57; O, 19.68; S, 4.38

850876-88-9

Solid powder

CC(C)(C)OC(=O)N[C@H]1CCCCC/C=C\[C@@H]2C[C@]2(NC(=O)[C@@H]3C[C@H](CN3C1=O)OC(=O)N4CC5=C(C4)C(=CC=C5)F)C(=O)NS(=O)(=O)C6CC6

ZVTDLPBHTSMEJZ-JSZLBQEHSA-N

InChI=1S/C35H46FN5O9S/c1-34(2,3)50-32(45)37-27-13-8-6-4-5-7-11-22-17-35(22,31(44)39-51(47,48)24-14-15-24)38-29(42)28-16-23(19-41(28)30(27)43)49-33(46)40-18-21-10-9-12-26(36)25(21)20-40/h7,9-12,22-24,27-28H,4-6,8,13-20H2,1-3H3,(H,37,45)(H,38,42)(H,39,44)/b11-7-/t22-,23-,27+,28+,35-/m1/s1

[(1S,4R,6S,7Z,14S,18R)-4-(cyclopropylsulfonylcarbamoyl)-14-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-2,15-dioxo-3,16-diazatricyclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-18-yl] 4-fluoro-1,3-dihydroisoindole-2-carboxylate

Danoprevir; RG-7227; RG7227; RG 7227; ITMN-191; ITMN 191; ITMN191; RO-5190591; RO5190591; RO 5190591

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

Solubility in Formulation 1: ≥ 2.5 mg/mL (3.42 mM) (saturation unknown) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (add these co-solvents sequentially from left to right, and one by one), clear solution.
For example, if 1 mL of working solution is to be prepared, you can add 100 μL of 25.0 mg/mL clear DMSO stock solution to 400 μL PEG300 and mix evenly; then add 50 μL Tween-80 to the above solution and mix evenly; then add 450 μL normal saline to adjust the volume to 1 mL.
Preparation of saline: Dissolve 0.9 g of sodium chloride in 100 mL ddH₂ O to obtain a clear solution.

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Solubility in Formulation 2: ≥ 2.5 mg/mL (3.42 mM) (saturation unknown) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (add these co-solvents sequentially from left to right, and one by one), clear solution.
For example, if 1 mL of working solution is to be prepared, you can add 100 μL of 25.0 mg/mL clear DMSO stock solution to 900 μL of corn oil and mix evenly.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。