DBeQ (JRF 12)

p97( IC50 = 1.5 μM ); Vps4（ IC50 = 11.5 μM ）
DBeQ (JRF 12) specifically targets ATPase VCP/p97 (IC50 = 2.1 μM for ATPase activity inhibition) [1]

DBeQ 在 HeLa 细胞中阻断 UbG76V-GFP、ODD-Luc 和 Luc-ODC 降解，IC50 分别为 2.6 μM、56 μM 和 45 μM。 DBeQ 对 N-乙基马来酰亚胺敏感因子 (NSF) 和 26S 蛋白酶体的效力至少低 50 倍。 DBeQ 相对于 ATP 竞争性抑制 p97，Ki 为 3.2 μM，表明它与 D2 结构域的活性位点结合。 DBeQ (10 μM) 有效阻止 HEK293 细胞中 TCRα-GFP 的降解。 DBeQ 在 3 小时内以浓度依赖性方式诱导 CHOP，但不会增加 HEK293 细胞中的 p21 水平。 DBeQ (15 μM) 会诱导 Hela 细胞中 LC3-II 在细胞核以及膜富集部分和胞浆部分中大量积累。 DBeQ 通过阻断 LC3-II 的自噬降解而不是诱导 HeLa 细胞自噬发挥作用。 DBeQ (10 μM) 快速促进 HeLa 细胞中“刽子手”caspases-3 和 -7 的激活。 DBeQ 比外在 caspase-8 途径更多地激活内在 caspase-9 凋亡途径，而 STS 激活这两种途径的程度相似。 DBeQ 对多发性骨髓瘤 (RPMI8226) 细胞的活性是正常人胎肺成纤维细胞 (MRC5) 的五倍，其中 HeLa 和 Hek293 细胞表现出中等敏感性。 DBeQ 在稳定 HeLa 细胞中 p97 依赖性与独立 UPS 报告基因底物方面表现出 20 倍的选择性。 DBeQ 会损害 ERAD 和自噬途径内底物的降解。 DBeQ (12 μM) 在 HeLa 细胞中以剂量依赖性方式抑制细胞内中和。 DBeQ (10 μM) 在衣壳命运实验中完全抑制病毒和抗体的降解，但无法阻止 IgG Fc 的降解。 DBeQ (9 μM) 可降低中和的初始梯度，作为抗体浓度的函数。 DBeQ 降低 MTOR 靶点的基础磷酸化和营养刺激的磷酸化，类似于雷帕霉素在 U20S 细胞中的作用。激酶测定：将测定缓冲液 [20 μL 2.5× 浓度，其中 1× = 50 mM Tris (pH 7.4)、20 mM MgCl2、1 mM EDTA 和 0.5 mM 三(2-羧乙基)膦 (TCEP)] 分配到96 孔板的每个孔。将纯化的 p97（25 μL，50 μM）稀释在 975 μL 1× 检测缓冲液中，并在每个孔中分配 10 μL。然后将 DBeQ (10 μL) 或 5% DMSO (10 μL) 添加到每个孔中，并将板在室温下孵育 10 分钟。 ATPase 检测方法如下：向每个孔中添加 10 μL 500 μM ATP (pH 7.5)，在室温下孵育 60 分钟，然后添加 50 μL Kinase Glo Plus 试剂，最后在室温下孵育 10 分钟。黑暗中的温度。在Analyst AD 上读取发光。 DBeQ 在一系列浓度（0、0.048、0.24、1.2、6 和 30 μM）下进行三次重复测定。细胞测定：将细胞（MRC-5、Hek293、HeLa 和 RPMI8226 细胞）接种到 384 孔实心白色板（5,000 个细胞/孔）上。用荧光素酶 siRNA 或 p97 siRNA (10 nM) 转染细胞 48 小时，或用 DBeQ 处理指定的时间。将 Caspase-3/7 Glo、caspase-6 Glo、caspase-8 Glo 或 caspase-9 Glo 添加到每个孔中，并通过以 500 rpm 摇动 1 分钟进行混合。室温孵育1小时后测定发光信号。使用 CellTiter-Glo 试剂测定细胞活力。为了确定细胞活力的 IC50，将细胞用 7 个浓度的 MG132 或 DBeQ（从 33 μM 开始进行三倍系列稀释）处理 48 小时。 IC50 值是通过拟合标准化为 DMSO 处理细胞的发光信号百分比来计算的。

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在重组人VCP/p97 ATP酶实验中，DBeQ (JRF 12) 抑制ATP水解的IC50为2.1 μM，是一种可逆性抑制剂。在浓度高达20 μM时，它对其他ATP酶（如Hsp70、Hsp90、蛋白酶体ATP酶）无显著抑制作用 [1]
- 在一组人癌细胞系（HeLa、U2OS、HCT116、A549、MDA-MB-231）中，DBeQ (JRF 12) 表现出抗增殖活性，IC50值范围为0.5-5 μM。处理72小时后，2 μM浓度使不同细胞系的细胞活力降低45-65% [1]
- 在HeLa细胞中，DBeQ (JRF 12)（2 μM）处理24小时后，多聚泛素化蛋白积累（较对照组增加3.1倍），内质网应激标志物（CHOP和BIP蛋白水平分别增加2.8倍和2.3倍），表明VCP/p97依赖的蛋白降解通路被破坏 [1]
- 在U2OS细胞中，DBeQ (JRF 12)（1.5 μM）处理18小时后抑制自噬流，表现为LC3-II积累（较对照组增加2.5倍）和p62/SQSTM1水平升高2.1倍 [3]
- 在HCT116结肠癌细胞中，DBeQ (JRF 12)（3 μM）处理48小时后诱导凋亡，膜联蛋白V阳性细胞比例从对照组的4%升至32%，胱天蛋白酶-3/7活性提高2.6倍 [1]

将检测缓冲液放入 96 孔板的每个孔中。它含有 20 μL 2.5× 浓度，其中 1× = 50 mM Tris (pH 7.4)、20 mM MgCl₂2、1 mM EDTA 和 0.5 mM 三(2-羧乙基)膦 (TCEP) ）。将 10 μL 纯化的 p97（25 μL，50 μM）用 975 μL 1× Assay Buffer 稀释后添加到每个孔中。向每个孔中添加 10 μL DBeQ 或 5% DMSO 后，将板在室温下孵育 10 分钟。 ATPase 测定需要向每个孔中加入 10 μL 500 μM ATP (pH 7.5)，使其在室温下静置 60 分钟，然后添加 50 μL 激酶 Glo Plus 试剂。最后，将其在黑暗中于室温下静置 10 分钟。分析师 AD 读取光度。一式三份，以以下浓度测定 DBeQ：0、0.048、0.24、1.2、6 和 30 μM。

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纯化重组人VCP/p97蛋白，与 DBeQ (JRF 12)（0.1 μM-20 μM）和ATP（2 mM）在实验缓冲液中于37°C孵育90分钟。使用比色法定量无机磷酸盐（Pi）的释放量，从ATP水解抑制的剂量-效应曲线计算IC50值 [1]
- 选择性评估实验中，将重组Hsp70、Hsp90及蛋白酶体ATP酶与各自底物和 DBeQ (JRF 12)（0.1 μM-20 μM）在最适反应条件下孵育。测量ATP酶活性并确定IC50值，以评估交叉反应性 [1]

使用实心白色 384 孔板进行细胞接种，每孔 5,000 个细胞。对细胞应用指定的 DBeQ 处理持续时间或 48 小时的荧光素酶或 p97 siRNA (10 nM) 转染。使用 500 rpm 振荡一分钟来混合 caspase-3/7 Glo、caspase-6 Glo、caspase-8 Glo 或 caspase-9 Glo。在室温下孵育一小时后，测量光度信号。通过使用 CellTiter-Glo 试剂，评估细胞活力。在 48 小时的持续时间内，将细胞置于七种浓度的 MG132 或 DBeQ（从 33 μM 开始的三倍连续稀释）中，以确定细胞的半衰期。计算 IC50 值的方法是计算经 DMSO 处理的细胞标准化的发光信号百分比。

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抗增殖实验：将癌细胞系（HeLa、U2OS、HCT116、A549、MDA-MB-231）以4×10³个/孔接种到96孔板中，培养24小时。加入浓度为0.1 μM-20 μM的 DBeQ (JRF 12)，孵育72小时。MTT法评估细胞活力，推导IC50值 [1]
- 蛋白降解和内质网应激实验：用 DBeQ (JRF 12)（2 μM）处理HeLa细胞24小时。裂解细胞后，通过特异性抗体Western blot分析多聚泛素化蛋白、CHOP和BIP水平 [1]
- 自噬实验：用 DBeQ (JRF 12)（1.5 μM）处理U2OS细胞18小时。Western blot检测LC3-II和p62/SQSTM1水平，通过比较有无氯喹存在时LC3-II的积累情况确认自噬流 [3]
- 凋亡实验：将HCT116细胞以2.5×10⁵个/孔接种到6孔板中，用 DBeQ (JRF 12)（3 μM）处理48小时。膜联蛋白V-FITC/PI染色后流式细胞术分析凋亡细胞，荧光素酶试剂盒检测胱天蛋白酶-3/7活性 [1]

In vitro, DBeQ (JRF 12) showed reduced toxicity to normal human fibroblasts (IC50 > 20 μM), indicating a therapeutic window between cancer cells and normal cells [1]
- At concentrations up to 5 μM, DBeQ (JRF 12) did not cause significant necrosis in cancer cells, as confirmed by PI exclusion assay [1]

[1]. Proc Natl Acad Sci U S A . 2011 Mar 22;108(12):4834-9.

[2]. Autophagy . 2011 Sep;7(9):1091-2.

[3]. Proc Natl Acad Sci U S A . 2012 Nov 27;109(48):19733-8.

[4]. Autophagy . 2013 May;9(5):799-800.

DBeQ (JRF 12) is a potent, selective, reversible inhibitor of VCP/p97 ATPase, a key regulator of protein homeostasis involved in ER-associated degradation (ERAD), autophagy, and ubiquitin-proteasome system (UPS) [1]
- Its mechanism of action involves binding to the ATPase domain of VCP/p97, inhibiting ATP hydrolysis, and blocking downstream protein processing, leading to accumulation of misfolded proteins, ER stress, and cancer cell apoptosis [1]
- DBeQ (JRF 12) serves as a tool compound for studying VCP/p97 function and validating VCP/p97 as a therapeutic target for cancer [1][3]
- The compound does not covalently modify VCP/p97, distinguishing it from covalent VCP/p97 inhibitors [1]

C22H20N4

340.42

340.168

C, 77.62; H, 5.92; N, 16.46

177355-84-9

676352

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

573.1±52.0 °C at 760 mmHg

149 °C

300.4±30.7 °C

0.0±1.6 mmHg at 25°C

1.735

4.34

56.3

2

4

6

26

403

0

N([H])(C([H])([H])C1C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=1[H])C1C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C2N=C(N=1)N([H])C([H])([H])C1C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=1[H]

QAIMUUJJAJBPCL-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H20N4/c1-3-9-17(10-4-1)15-23-21-19-13-7-8-14-20(19)25-22(26-21)24-16-18-11-5-2-6-12-18/h1-14H,15-16H2,(H2,23,24,25,26)

2-N,4-N-dibenzylquinazoline-2,4-diamine

DBeQ; DBEQ; JRF12; JRF-12; JRF 12.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 35.71~68 mg/mL ( 104.9~199.8 mM )
Ethanol : ~5 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。