EGFR (IC50 = 2 nM)

体外活性：厄洛替尼有效抑制完整细胞中的 EGFR 活化，包括 HNS 人头颈肿瘤细胞 (IC50 20nM)、DiFi 人结肠癌细胞和 MDA MB-468 人乳腺癌细胞。 Erlotinib (1 μM) 诱导 DiFi 人结肠癌细胞凋亡。厄洛替尼抑制一组 NSCLC 细胞系的生长，包括 A549、H322、H3255、H358 H661、H1650、H1975、H1299、H596，IC50 范围为 29 nM 至 >20 μM。 Erlotinib (2 μM) 显着抑制 AsPC-1 和 BxPC-3 胰腺细胞的生长。厄洛替尼与吉西他滨联合使用在 KRAS 突变的胰腺癌细胞中被认为具有累加作用。 10 微摩尔的厄洛替尼可抑制 EGFR Y845（Src 依赖性磷酸化）和 Y1068（自身磷酸化）位点的磷酸化。与厄洛替尼联合使用可以下调雷帕霉素刺激的 Akt 活性，并对细胞生长抑制产生协同作用。激酶测定：96 孔板在 37°C 下孵育过夜，每孔加入 100 μL 0.25 mg/mL PGT 的 PBS 溶液。通过抽吸除去过量的PGT，并用洗涤缓冲液（PBS中的0.1% Tween 20）洗涤板3次。激酶反应在 50 μL 50 mM HEPES (pH 7.3) 中进行，其中含有 125 mM 氯化钠、24 mM 氯化镁、0.1 mM 原钒酸钠、20 μM ATP、1.6 μg/mL EGF 和 15 ng EGFR，亲和力从A431细胞膜纯化。添加厄洛替尼的 DMSO 溶液，使 DMSO 最终浓度为 2.5%。通过添加 ATP 启动磷酸化，并在室温下持续摇动 8 分钟。通过抽吸反应混合物终止激酶反应并用洗涤缓冲液洗涤4次。通过每孔 50 μL HRP 偶联的 PY54 抗磷酸酪氨酸抗体孵育 25 分钟来测量磷酸化 PGT，该抗体在封闭缓冲液（PBS 中的 3% BSA 和 0.05% Tween 20）中稀释至 0.2 μg/mL。通过抽吸除去抗体，并用洗涤缓冲液洗涤板4次。通过添加 TMB Microwell 过氧化物酶底物（每孔 50 μL）来产生结肠测量信号，并通过添加 0.09 M 硫酸（每孔 50 μL）来终止。通过测量 450 nm 处的吸光度来估算磷酸酪氨酸。对照信号通常为 0.6-1.2 吸光度单位，在没有 AlP、EGFR 或 PGT 的孔中基本上没有背景，并且与 10 分钟的孵育时间成正比。细胞测定：将呈指数生长的细胞（A549、H322、H3255、H358 H661、H1650、H1975、H1299、H596 细胞）接种于 96 孔塑料板中，并暴露于埃罗替尼、培美曲塞或恒定浓度组合的连续稀释液中比例为 4:1，一式三份，持续 72 小时。通过细胞计数和 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物测定来测定细胞活力。生长抑制表示为药物处理的存活细胞与 PBS 处理的对照细胞的百分比（被认为是 100% 活力）。 IC50 值是与未处理的对照细胞相比，药物暴露 72 小时导致 50% 细胞生长抑制的浓度，并通过 CalcuSyn 软件计算。

在 100 mg/kg 的剂量下，Erlotinib HCl 完全阻止 EGF 诱导的人类 HN5 肿瘤中 EGFR 的自磷酸化，该肿瘤作为无胸腺小鼠的异种移植物以及治疗小鼠的肝脏 EGFR 的自磷酸化。 Erlotinib (100 mg/Kg) 抑制 H460a 和 A549 肿瘤模型，抑制率分别为 71% 和 93%。

激酶反应在 50 μL 50 mM HEPES (pH 7.3) 中进行，其中还含有 15 ng 来自 A431 细胞膜的亲和纯化 EGFR、1.6 μg/mL EGF、0.1 mM Na₃VO ₄、125 mM NaCl 和 20 μM ATP。为了达到 2.5% 的最终 DMSO 浓度，将化合物添加到 DMSO 中。 ATP 的添加启动磷酸化过程，该过程在室温下持续 8 毫米，同时不断摇动。吸出反应混合物以终止激酶反应，并使用洗涤缓冲液四次。每孔加入 50 微升 HRP 缀合的 PY54 抗磷酸酪氨酸抗体，在封闭缓冲液（含有 3% BSA 和 0.05% Tween 20 的 PBS）中稀释至 0.2 微克/mL，孵育 25 微秒后，对磷酸化 PGT 进行定量。吸出抗体后，使用洗涤缓冲液将板清洗四次。添加 TMB Microwell 过氧化物酶底物（每孔 50 μL）以产生结肠信号。添加 0.09 M 硫酸（每孔 50 μL）以终止信号。 450 nm 处的吸光度用于估计磷酸酪氨酸。对照信号与 10 mm 的孵育时间成正比，通常范围为 0.6 至 1.2 吸光度单位[1]。在没有 AlP、EGFR 或 POT 的孔中，基本上没有背景信号。

为了评估用 B-DIM、厄洛替尼或两者处理的细胞的存活率，将 3,000–5,000 个 BxPC-3 和 MIAPaCa 细胞接种到 96 孔板的每孔中，并在 37°C 下孵育整夜。最初，在一系列浓度下测试 B-DIM (10-50 µM) 和厄洛替尼 (1-5 µM)。根据初步结果为每次检测选择 B-DIM (20 µM) 和厄洛替尼 (2 µM) 的浓度。标准 MTT 测定用于测量 B-DIM (20 µM)、厄洛替尼 (2 µM) 及其组合对 BxPC-3 和 MIAPaCa 细胞的影响。 72小时后进行3次测定。 Tecan 微孔板荧光计测量 595 nm 处的颜色强度。用 DMSO 处理的细胞的值为 100%，并被视为未处理的对照。除了上述测定之外，我们还进行了克隆形成测定来评估治疗效果[2]。

Mice: The treatment groups consist of seven randomly assigned female ICR-SCID mice, aged 6-7 weeks: (a) control (no treatment); (b) B-DIM (50 mg/kg body weight) administered intragastrically once daily; (c) Erlotinib (50 mg/kg body weight) administered daily intraperitoneally for 15 days; and (d) B-DIM and Erlotinib administered according to the schedule for individual treatments. After receiving their last dose of medication, all mice are killed on day three, and their body weight is recorded. A portion of the tissue is immediately frozen in liquid nitrogen and kept cold (−70°C) for later use, while the remaining portion is fixed in formalin and prepared for paraffin block processing. The presence of a tumor or tumors in each pancreas is verified by staining a fixed tissue section with H&E. Rats: Male Sprague-Dawley (SD) rats six weeks of age, weighing 180–210 g, are utilized. On day 0, SD rats (n=28) receive an intraperitoneal injection of 7 mg/kg of freshly prepared ciprofloxacin (CP) at a concentration of 1 mg/mL. For the purpose of examining Erlotinib's effects, 28 CP-N rats are split into two groups. Animals in two groups (n = 14) are given daily oral gavages of either erlotinib (20 mg/kg) (CP+E, n = 14) or vehicle (CP+V, n = 14) from day -1 (24 hours before the CP injection) to day 3. Groups treated with vehicles are given the same amount of saline. At six weeks of age, a normal control group (NC, n = 5) consists of five male SD rats. From the first to the third day, the NC rats receive an equivalent volume of saline orally via gavage. Day 4 (96 hours post-CP injection): rats are anesthetized, and following a cardiac puncture, they are sacrificed by exsanguination. The kidneys and blood are simultaneously extracted. Renal tissue is sectioned and fixed in 2% paraformaldehyde/phosphate-buffered saline (PBS) for later use, or it can be snap-frozen in liquid nitrogen. In order to reduce suffering as much as possible, diethyl ether gas anesthesia is used during all surgical procedures.

[1]. Induction of apoptosis and cell cycle arrest by CP-358,774, an inhibitor of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase. Cancer Res. 1997, 57(21), 4838-4848.

[2]. Apoptosis-inducing effect of erlotinib is potentiated by 3,3'-diindolylmethane in vitro and in vivo using an orthotopic model of pancreatic cancer. Mol Cancer Ther, 2008, 7(6), 1708-1719.

[3]. Epidermal growth factor receptor inhibition with erlotinib partially prevents cisplatin-induced nephrotoxicity in rats. PLoS One. 2014 Nov 12;9(11):e111728.

C22H23N3O4

393.44

393.17

C, 67.16; H, 5.89; N, 10.68; O, 16.27

183321-74-6

Erlotinib Hydrochloride;183319-69-9;Erlotinib mesylate;248594-19-6;Erlotinib-d6;1034651-23-4;Erlotinib-13C6;1211107-68-4

White to off-white crystalline powder

COCCOC1=C(C=C2C(=C1)C(=NC=N2)NC3=CC=CC(=C3)C#C)OCCOC

AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H23N3O4/c1-4-16-6-5-7-17(12-16)25-22-18-13-20(28-10-8-26-2)21(29-11-9-27-3)14-19(18)23-15-24-22/h1,5-7,12-15H,8-11H2,2-3H3,(H,23,24,25)

N-(3-ethynylphenyl)-6,7-bis(2-methoxyethoxy)quinazolin-4-amine

Erlotinib free base; NSC718781; NSC718781; CP358774; OSI-774; OSI 774; NSC 718781; CP-358,774; CP-358774; OSI774

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

Solubility in Formulation 1: 10 mg/mL (25.42 mM) in 50% PEG300 + 50% Saline (add these co-solvents sequentially from left to right, and one by one), suspension solution; with sonication.
Preparation of saline: Dissolve 0.9 g of sodium chloride in 100 mL ddH₂ O to obtain a clear solution.

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Solubility in Formulation 2: 10 mg/mL (25.42 mM) in 0.5% CMC-Na/saline water (add these co-solvents sequentially from left to right, and one by one), suspension solution; with ultrasonication.
Preparation of saline: Dissolve 0.9 g of sodium chloride in 100 mL ddH₂ O to obtain a clear solution.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。