EGFR (IC50 = 2 nM)

甲磺酸厄洛替尼 (CP-358774 甲磺酸盐) 的 IC50 为 1 nM，同样是 EGFR 重组细胞内（激酶）结构域的强抑制剂。在 8 天的增殖测定中，厄洛替尼的 IC50 为 100 nM，可显着抑制 DiFi 细胞的增殖[1]。与单独治疗相比，B-DIM 与厄洛替尼 (2 μM) 的组合可显着抑制 BxPC-3 细胞中集落的发育。与单独治疗的细胞凋亡影响相比，B-DIM 和厄洛替尼 (2 μM) 的组合仅在 BxPC-3 细胞中显着诱导细胞凋亡[2]。

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体外活性：厄洛替尼有效抑制完整细胞中的 EGFR 活化，包括 HNS 人头颈肿瘤细胞 (IC50 20nM)、DiFi 人结肠癌细胞和 MDA MB-468 人乳腺癌细胞。 Erlotinib (1 μM) 诱导 DiFi 人结肠癌细胞凋亡。厄洛替尼抑制一组 NSCLC 细胞系的生长，包括 A549、H322、H3255、H358 H661、H1650、H1975、H1299、H596，IC50 范围为 29 nM 至 >20 μM。 Erlotinib (2 μM) 显着抑制 AsPC-1 和 BxPC-3 胰腺细胞的生长。厄洛替尼与吉西他滨联合使用在 KRAS 突变的胰腺癌细胞中被认为具有累加作用。 10 微摩尔的厄洛替尼可抑制 EGFR Y845（Src 依赖性磷酸化）和 Y1068（自身磷酸化）位点的磷酸化。与厄洛替尼联合使用可以下调雷帕霉素刺激的 Akt 活性，并对细胞生长抑制产生协同作用。激酶测定：96 孔板在 37°C 下孵育过夜，每孔加入 100 μL 0.25 mg/mL PGT 的 PBS 溶液。通过抽吸除去过量的PGT，并用洗涤缓冲液（PBS中的0.1% Tween 20）洗涤板3次。激酶反应在 50 μL 50 mM HEPES (pH 7.3) 中进行，其中含有 125 mM 氯化钠、24 mM 氯化镁、0.1 mM 原钒酸钠、20 μM ATP、1.6 μg/mL EGF 和 15 ng EGFR，亲和力从A431细胞膜纯化。添加厄洛替尼的 DMSO 溶液，使 DMSO 最终浓度为 2.5%。通过添加 ATP 启动磷酸化，并在室温下持续摇动 8 分钟。通过抽吸反应混合物终止激酶反应并用洗涤缓冲液洗涤4次。通过每孔 50 μL HRP 偶联的 PY54 抗磷酸酪氨酸抗体孵育 25 分钟来测量磷酸化 PGT，该抗体在封闭缓冲液（PBS 中的 3% BSA 和 0.05% Tween 20）中稀释至 0.2 μg/mL。通过抽吸除去抗体，并用洗涤缓冲液洗涤板4次。通过添加 TMB Microwell 过氧化物酶底物（每孔 50 μL）来产生结肠测量信号，并通过添加 0.09 M 硫酸（每孔 50 μL）来终止。通过测量 450 nm 处的吸光度来估算磷酸酪氨酸。对照信号通常为 0.6-1.2 吸光度单位，在没有 AlP、EGFR 或 PGT 的孔中基本上没有背景，并且与 10 分钟的孵育时间成正比。细胞测定：将呈指数生长的细胞（A549、H322、H3255、H358 H661、H1650、H1975、H1299、H596 细胞）接种于 96 孔塑料板中，并暴露于埃罗替尼、培美曲塞或恒定浓度组合的连续稀释液中比例为 4:1，一式三份，持续 72 小时。通过细胞计数和 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物测定来测定细胞活力。生长抑制表示为药物处理的存活细胞与 PBS 处理的对照细胞的百分比（被认为是 100% 活力）。 IC50 值是与未处理的对照细胞相比，药物暴露 72 小时导致 50% 细胞生长抑制的浓度，并通过 CalcuSyn 软件计算。

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表皮生长因子受体（EGFR）在很大比例的癌症中过表达，并导致恶性表型。CP-358774是一种直接作用的人EGFR酪氨酸激酶抑制剂，IC50为2 nM，可减少完整肿瘤细胞中的EGFR自磷酸化，IC50为20 nM。在分离激酶和全细胞的检测中，这种抑制对EGFR酪氨酸激酶的选择性高于我们检查过的其他酪氨酸激酶。在100mg/kg的剂量下，CP-358774完全阻止了EGF诱导的人HN5肿瘤中EGFR的自磷酸化，该肿瘤在无胸腺小鼠中作为异种移植物生长，并完全阻止了接受治疗的小鼠的肝EGFR自磷酸化。CP-358774在细胞培养物中以亚摩尔浓度抑制DiFi人结肠肿瘤细胞的增殖，并阻断G1期的细胞周期进程。这种抑制剂在DiFi细胞中产生低磷酸化形式的视网膜母细胞瘤蛋白的显著积累和p27KIP1的积累，这可能有助于细胞周期阻滞。根据DNA片段的形成和其他标准，抑制EGFR也会触发这些细胞的凋亡。这些结果表明，CP-358774具有治疗依赖EGFR途径增殖或存活的肿瘤的潜力。[1]

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B-DIM和厄洛替尼对胰腺癌症细胞生存能力的影响[2]
值得注意的是，在我们的试点研究中，如材料和方法所示，使用了不同浓度的B-DIM和厄洛替尼，如表1所示。此外，在分析了EGFR、NF-κB和COX-2的基础表达水平后，我们选择了两种细胞系（BxPC-3），其NF-κB、EGFR和COX-2的表达水平为组成型激活水平，而NF-κA、EGFR和COX-2的表达水平较低（MIAPaCa）。我们的结果促使我们选择B-DIM和厄洛替尼的后续浓度，如下所示。用B-DIM（20µmol/L）、埃洛替尼（2µmol/L）和组合处理的BxPC-3和MIPaCa胰腺癌症细胞的细胞活力通过MTT测定进行测定，数据如图1A和B所示。在用任一药剂处理的Bx PC-3细胞中观察到细胞活力的显著抑制，联合处理进一步增强了细胞活力（P=0.0001）。此外，我们还通过克隆形成试验测试了治疗对细胞存活率的影响，如下所示。MIAPaCa细胞的类似处理导致单独使用B-DIM显著抑制活细胞，但当同时暴露于类似浓度的B-DIM和厄洛替尼时则没有，联合治疗没有增强这种效果（P=0.0890）。MIAPaCa细胞对厄洛替尼的不敏感性与最近发表的一份报告一致

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克隆形成试验抑制细胞生长/存活[2]
为了确定B-DIM和厄洛替尼对细胞生长的影响，用每种单一药物或其组合处理细胞，并通过克隆形成试验评估细胞存活率。与单独使用任何一种药物相比，B-DIM和厄洛替尼的组合显著抑制了BxPC-3细胞中的集落形成（图2A和B）。MIAPaCa细胞的类似处理（图2C）显示，单独使用B-DIM和联合使用都能抑制集落形成，但联合使用并不能增强这种效果，如BxPC-3细胞所示（图2A和B）。这些结果与软琼脂试验获得的结果相似。总的来说，克隆发生测定的结果与MTT数据一致，如图1A和B所示，表明B-DIM在BxPC-3和MIPaCa胰腺癌症细胞之间具有不同的作用。这些差异的机制得到了进一步的研究，结果将在以下部分呈现，但首先我们确定了B-DIM、厄洛替尼和联合用药对凋亡细胞死亡的影响。

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厄洛替尼、B-DIM和联合用药诱导细胞凋亡[2]
通过使用细胞死亡检测ELISA确定不同处理的凋亡效应，进一步研究了抑制细胞存活的潜在机制。与单独使用任何一种药物的凋亡作用相比，B-DIM和厄洛替尼的组合仅在BxPC-3细胞中显著诱导了凋亡（图1C）。对MIAPaCa细胞的类似处理显示，联合用药没有诱导细胞凋亡（图1D）。这些结果与MTT法的细胞存活率测定结果一致。随后，我们试图找到进一步的凋亡证据，如下所述。

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B-DIM通过厄洛替尼增强细胞凋亡信号传导[2]
在用B-DIM（20µmol/L）、厄洛替尼（2µmol/L）和组合处理的BxPC-3和MIAPaCa细胞中测定了PARP切割（图3）。我们仅在BxPC-3细胞中发现了72小时处理后大量PARP（116 kDa）蛋白切割产物（85 kDa片段）（图3）。相比之下，经类似处理的MIAPaCa细胞仅显示出单独使用B-DIM和联合使用但不单独使用厄洛替尼对PARP的小切割。凋亡的诱导可能部分是由于重要存活基因的失活；因此，我们研究了B-DIM、厄洛替尼及其组合是否会影响关键的生存蛋白。

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B-DIM对凋亡相关分子的影响[2]
使用BxPC-3和MIAPaCa细胞来评估B-DIM和/或厄洛替尼对存活素、Bcl-2、Bcl-xL和c-IAP1/2表达的影响。与单独使用任何一种药物相比，联合治疗的细胞中Bcl-2、Bcl-xL、survivin和c-IAP1/2蛋白的表达显著降低（图3）。单独或联合用药对MIAPaCa细胞中的抗凋亡蛋白没有影响。这些结果表明，B-DIM、厄洛替尼及其组合下调了关键存活蛋白，进而诱导BxPC-3细胞凋亡，但在MIAPaCa细胞中没有。为了进一步确定B-DIM致敏BxPC-3细胞对厄洛替尼诱导的细胞活力抑制和凋亡诱导的分子机制，我们研究了EGFR及其下游信号通路的作用。

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B-DIM对EGFR蛋白表达的影响[2]
通过免疫印迹法测定EGFR的表达。在MIAPaCa细胞中未发现EGFR的基线表达。与单独使用任何一种药物相比，当暴露于厄洛替尼联合B-DIM时，表达EGFR的BxPC-3细胞显示出EGFR表达和磷酸化EGFR水平的显著降低（图3）。众所周知，EGFR的激活反过来可以调节一种重要的转录因子NF-κB，它是存活素、c-IAP1/2、Bcl-2和Bcl-xL等几种生存基因的已知调节因子。因为我们发现与单独使用B-DIM和厄洛替尼相比，BxPC-3细胞中survivin、c-IAP1/2、Bcl-2和Bcl-xL的下调程度更大，而且这些基因受NF-κB的转录调节，所以我们研究了每种处理对NF-κB DNA结合活性的影响。

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B-DIM抑制NF-κBDNA结合活性[2]
在B-DIM处理和厄洛替尼处理的细胞中评估核转录因子NF-κB的激活。与单独使用埃罗替尼相比，暴露于埃罗替尼和B-DIM的BxPC-3细胞中NF-κB活化受到显著抑制（图4A）。MIAPaCa细胞中没有显示出这种抑制作用（图4B）。这些结果表明，B-DIM和厄洛替尼的组合对细胞生长、凋亡诱导、存活因子抑制、EGFR抑制和NF-κB失活有更大的抑制作用。

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由于NF-κB在促生存和抗凋亡过程的调节中起着重要作用，我们测试了p65 cDNA转染NF-κB的过表达是否可以消除B-DIM诱导和厄洛替尼诱导的凋亡过程。此外，众所周知，NF-κB转录调节COX-2，COX-2产生PGE2，进而诱导细胞存活。因此，我们测试了塞来昔布、厄洛替尼或单独的B-DIM是否会影响p65 cDNA转染细胞中B-DIM和厄洛替尼的活性。

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厄洛替尼、B-DIM和塞来昔布阻断p65 cDNA转染刺激的NF-κB活性的激活[2]
用p65 cDNA转染BxPC-3和MIAPaCa细胞，然后用厄洛替尼（2µmol/L）、B-DIM（20µmol/L）或塞来昔布（5µmol/L）处理或未处理48小时，对其细胞质和核蛋白进行NF-κB活性分析，通过蛋白质印迹分析和EMSA进行测量。结果显示，与未处理的细胞相比，厄洛替尼、B-DIM和塞来昔布对BxPC-3细胞中p65蛋白和NF-κB DNA结合活性的抑制作用更大（图5A和B），对MIAPaCa细胞的影响很小。重要的是，如图5A和B所示，NF-κB p65 cDNA转染仅在BxPC-3细胞中显著增强了NF-κBp65蛋白和DNA结合活性。另一方面，在MIAPaCa细胞中没有观察到这种变化。由于NF-κB的激活诱导COX-2表达，导致PGE2产生并释放到培养基中，我们测量了用埃罗替尼、B-DIM和COX-2抑制剂塞来昔布处理的未转染和转染细胞中PGE2的水平。

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p65 cDNA转染细胞中PGE2合成的抑制[2]
我们测量了从BxPC-3和MIAPaCa细胞收集的条件培养基中PGE2的水平，作为COX-2活性的指标。我们发现BxPC-3细胞分泌高水平的PGE2，而MIAPaCa细胞显示出非常低的PGE2水平，这与COX-2的低组成性表达是一致的。用p65cDNA转染BxPC-3和MIAPaCa细胞，然后用厄洛替尼（10nmol/L）、B-DIM（1µmol/L）或塞来昔布（1nmol/L）处理，以分析释放到培养基中的PGE2水平（图5C）。单独用厄洛替尼处理细胞时，PGE2水平没有变化（P=0.084）。然而，在用B-DIM（P=0.006）和塞来昔布（P=0.005）处理的BxPC-3细胞中观察到PGE2水平显著降低。与未转染的细胞相比，p65 cDNA转染的BxPC-3细胞中PGE2水平显著升高（P=0.009），表明NF-κB可以诱导COX-2表达。然而，使用任何药物后，MIAPaCa细胞中的PGE2水平都没有变化。总的来说，这些结果表明PGE2的产生是通过NF-κB和COX-2途径介导的，塞来昔布可以下调NF-κB和COX-2。这些结果随后与凋亡程度相关（图5D），如下所示。

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p65 cDNA转染细胞中NF-κB失活导致的细胞凋亡[1]
将p65 cDNA转染到BxPC-3和MIAPaCa细胞中，然后用厄洛替尼（2µmol/L）、B-DIM（20µmol/L）或塞来昔布（5µmol/L）处理48小时（图5D）。用厄洛替尼处理的p65 cDNA转染的BxPC-3细胞的凋亡程度（P=0.034）远低于用厄洛替尼处理的未转染细胞（P=0.007）。在BxPC-3细胞中，B-DIM和塞来昔布治疗均观察到类似的结果。然而，在MIAPaCa细胞中，没有观察到这种程度的凋亡。这些结果表明，p65 cDNA转染激活NF-κB可以消除厄洛替尼、B-DIM和塞来昔布的凋亡诱导作用。

Bcrp1/Mdr1a/1b-/- 和 WT 小鼠之间口服埃罗替尼 (5 mg/kg) 治疗后的 AUC0-inf 有 1.49 倍的统计学差异（分别为 7,419±1,720 与 4,957±1,735 ng*h/mL，P= 0.01）[3]。当厄洛替尼（10 mg/kg/天或 20 mg/kg/天）给予博莱霉素（BLM）治疗的大鼠时，没有证据表明肺损伤显着恶化（通过肺重量、肺羟脯氨酸等指标测量） (HyP) 水平、组织病理学评分（包括肺纤维化评分和肺病灶密度）和镜检结果。结果显示，厄洛替尼不会加重 BLM 对大鼠造成的肺部损伤[4]。

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在 100 mg/kg 的剂量下，Erlotinib HCl 完全阻止 EGF 诱导的人类 HN5 肿瘤中 EGFR 的自磷酸化，该肿瘤作为无胸腺小鼠的异种移植物以及治疗小鼠的肝脏 EGFR 的自磷酸化。 Erlotinib (100 mg/Kg) 抑制 H460a 和 A549 肿瘤模型，抑制率分别为 71% 和 93%。

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B-DIM增强厄洛替尼对原发性肿瘤的体内治疗效果[2]
研究了B-DIM和厄洛替尼组合在携带原位植入BxPC-3胰腺肿瘤细胞的SCID小鼠中的潜在治疗效用。选择每只小鼠口服3.5mg/d的B-DIM剂量，而厄洛替尼剂量（腹腔注射50mg/kg体重）基于之前发表的报告，如图6A所示。共28只小鼠分为四组。为了确定单一药物治疗与联合治疗的疗效，我们确定了所有治疗组的平均胰腺重量。在我们的实验条件下，与对照组肿瘤相比，通过强饲治疗和单独使用厄洛替尼给予B-DIM分别使肿瘤重量减轻了20%和35%（图6C）。然而，在实验条件下，与未经治疗的对照组、单独使用B-DIM或单独使用厄洛替尼治疗组相比，B-DIM和厄洛替尼联用治疗组的肿瘤重量显著降低（P<0.01）。这些结果首次表明，在原位模型中，B-DIM和厄洛替尼联合使用抑制胰腺肿瘤生长的疗效。

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B-DIM在体内抑制NF-κBDNA结合活性[2]
在B-DIM治疗和厄洛替尼治疗的肿瘤组织中评估NF-κB的激活。结果表明，B-DIM和厄洛替尼下调了NF-κB（图6B）。图6B（底部）显示了所有七只小鼠的结果。这些体内结果与我们的体外发现相似，表明NF-κB的失活至少是B-DIM在我们的实验动物模型中增强厄洛替尼诱导的抗肿瘤活性的分子机制之一。

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阻断表皮生长因子受体（EGFR）在急性肾损伤（AKI）中的作用存在争议。在这里，我们研究了厄洛替尼（一种可以阻断EGFR活性的选择性酪氨酸激酶抑制剂）对顺铂（CP）诱导的急性肾损伤的肾脏保护作用。从诱导CP肾毒性（CP-N）的前一天到第3天，给各组动物服用厄洛替尼或赋形剂。此外，我们使用人肾近端肾小管细胞（HK-2）分析了厄洛替尼对CP-N相关信号通路的影响。与对照组相比，厄洛替尼治疗的大鼠肾功能明显改善，肾小管间质损伤减轻，凋亡和增殖细胞数量减少。厄洛替尼治疗的大鼠肾皮质促纤维化基因的mRNA显著减少。厄洛替尼治疗显著降低了Bax/Bcl-2 mRNA和蛋白比值。在体外，我们观察到厄洛替尼显著降低了HK-2中CP诱导的MEK1和Akt的磷酸化过程。综上所述，这些数据表明厄洛替尼具有肾脏保护特性，这可能是通过减少肾小管细胞的凋亡和增殖来介导的，这些作用反映了对EGFR下游信号通路的抑制。这些结果表明，厄洛替尼可能有助于预防接受CP化疗的患者发生急性肾损伤[PLoS One. 2014 Nov 12;9(11):e111728.]。

表皮生长因子受体（EGFR）在很大比例的癌中过度表达，并导致恶性表型。CP-358,774是一种直接作用的人EGFR酪氨酸激酶抑制剂，IC50为2 nM，在完整肿瘤细胞中降低EGFR自磷酸化，IC50为20 nM。这种抑制是选择性的EGFR酪氨酸激酶相对于其他酪氨酸激酶我们已经检查过，在分离的激酶和全细胞的分析。在100 mg/kg的剂量下，CP-358,774完全阻止egf诱导的人类HN5肿瘤在胸腺小鼠中作为异种移植物生长的EGFR自磷酸化和处理小鼠的肝脏EGFR。在细胞培养中，CP-358,774在亚微摩尔浓度下抑制DiFi人结肠肿瘤细胞的增殖，并在G1期阻断细胞周期进程。该抑制剂在DiFi细胞中产生低磷酸化形式的视网膜母细胞瘤蛋白的显著积累和p27KIP1的积累，这可能有助于细胞周期阻滞。抑制EGFR也会触发这些细胞的凋亡，这是由DNA片段的形成和其他标准决定的。这些结果表明，CP-358,774具有治疗依赖EGFR途径增殖或存活的肿瘤的潜力。[1]

表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂阻断表皮生长因子受体（EGFR）不足以有效抗肿瘤活性，因为独立激活的生存途径。因此，多靶点方法可能会改善抗egfr治疗的结果。在本研究中，我们利用原位动物肿瘤模型，测定了3,3'-二吲哚基甲烷（biorese BR-DIM，简称B-DIM）对厄洛替尼体外和体内细胞活力和凋亡的影响，这是一种生物利用度更高的DIM。分别用B-DIM（20微mol/L）、厄洛替尼（2微mol/L）及两者联合处理EGFR水平和NF-kappaB dna结合活性不同的BxPC-3和MIAPaCa细胞。采用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑和组蛋白dna ELISA检测细胞存活和凋亡情况。电泳迁移率转移法评价NF-kappaB的dna结合活性。通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-酰基）-2,5-二苯基溴化四唑和克隆实验，我们发现与单独使用任何一种药物相比，厄洛替尼和B-DIM联合治疗BxPC-3细胞可显著降低细胞活力，诱导凋亡，下调EGFR磷酸化，nf - κ b dna结合活性，以及抗凋亡基因的表达。相比之下，在类似处理的MIAPaCa细胞中没有观察到这种效果。最重要的是，这些体外结果在动物模型中得到了概括，表明B-DIM与厄洛替尼联合作为抗肿瘤药物比单独使用任何一种药物都更有效。这些结果表明，对于肿瘤中EGFR和NF-kappaB激活状态的患者，使用B-DIM可能是一种有效的治疗策略，可以获得更好的治疗效果。[2]

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为了评估用 B-DIM、厄洛替尼或两者处理的细胞的存活率，将 3,000–5,000 个 BxPC-3 和 MIAPaCa 细胞接种到 96 孔板的每孔中，并在 37°C 下孵育整夜。最初，在一系列浓度下测试 B-DIM (10-50 µM) 和厄洛替尼 (1-5 µM)。根据初步结果为每次检测选择 B-DIM (20 µM) 和厄洛替尼 (2 µM) 的浓度。标准 MTT 测定用于测量 B-DIM (20 µM)、厄洛替尼 (2 µM) 及其组合对 BxPC-3 和 MIAPaCa 细胞的影响。 72小时后进行3次测定。 Tecan 微孔板荧光计测量 595 nm 处的颜色强度。用 DMSO 处理的细胞的值为 100%，并被视为未处理的对照。除了上述测定之外，我们还进行了克隆形成测定来评估治疗效果[2]。

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细胞活力测定[2]
为了测试用B-DIM、厄洛替尼或其组合处理的细胞的存活率，将BxPC-3和MIAPaCa细胞（每孔3000-5000个）铺在96孔板中，并在37°C下孵育过夜。我们最初测试了B-DIM（10-50µmol/L）和埃罗替尼（1-5µmol/L）的一系列浓度。根据初步结果，所有测定均选择B-DIM（20µmol/L）和埃罗替尼（2µmol/L）的浓度。72小时后，通过标准3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）法测定B-DIM（20µmol/L）、埃罗替尼（2µmol/L）和联合用药对BxPC-3和MIAPaCa细胞的影响，并重复三次。通过帝肯微孔板荧光计在595nm下测量颜色强度。DMSO处理的细胞被认为是未处理的对照，并被赋予100%的值。除上述检测外，我们还进行了克隆形成检测，以评估治疗效果，如下所示。

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克隆形成试验[2]
为了测试用B-DIM、厄洛替尼或其组合处理的细胞的存活率，将BxPC-3和MIAPaCa细胞（每孔50000-100000）铺在六孔板中，并在37°C下孵育过夜。在暴露于20µmol/L B-DIM、2µmol/L厄洛替尼和组合72小时后，对细胞进行胰蛋白酶处理，计数活细胞（台盼蓝排除），并在100至1000个细胞的100 mm培养皿中平板培养，以确定平板效率并评估处理对克隆存活的影响。然后将细胞在37°C的5%CO2/5%O2/90%N2培养箱中培养约10至12天。菌落用2%结晶紫染色并计数。存活分数在克隆形成效率方面与未经处理的对照细胞标准化，BxPC-3和MIAPaCa细胞的克隆形成效率均为83%。除此试验外，还对细胞进行了类似的处理，将其铺在软琼脂中（软琼脂集落试验），并在37°C下孵育。12天后，还对所有未处理和处理过的孔中的软琼脂菌落进行了计数。

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ELISA定量细胞凋亡[2]
细胞死亡检测ELISA试剂盒（罗氏应用科学公司）用于检测未处理和处理的BxPC-3和MIAPaCa细胞的凋亡。接种在六孔板中的细胞用B-DIM（20µmol/L）、厄洛替尼（2µmol/L）或其组合处理。细胞被胰蛋白酶消化，如前所述，使用了约10000个细胞。使用帝肯微孔板荧光计测量405nm处的颜色强度。这个实验重复了三次。

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蛋白质提取和蛋白质印迹分析[2]
用B-DIM（20µmol/L）、厄洛替尼（2µmol/L）或联合治疗72小时的BxPC-3和MIAPaCa细胞用于评估治疗对存活素、Bcl-2、Bcl-xL、EGFR、EGFR-pTyr1173、c-IAP1/2、Src、聚ADP核糖聚合酶（PARP）和β-actin表达的影响。实验至少进行了三次。如前所述收获细胞。将样品装载在7%至12%的SDS-PAGE上进行分离，并电泳转移到硝化纤维膜上。每层膜都与抗survivin、Bcl-2、Bcl-xL、Src、c-IAP1/2、EGFR、EGFR-pTyr1173、PARP和β-actin的单克隆抗体一起孵育。印迹与过氧化物酶偶联的二抗一起孵育。然后使用化学发光检测系统测量信号强度。

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NF-κB活化的电泳迁移率变化分析[2]
为了评估B-DIM和厄洛替尼对BxPC-3和MIAPaCa细胞的影响，细胞要么未经处理，要么用B-DIM（20µmol/L）、厄洛替宁（2µmol/L）或组合处理，至少重复实验三次，持续72小时。如前所述，使用Dounce均质器在400µL冰冷的裂解缓冲液中均质化细胞或切碎的肿瘤组织。

\n\n小鼠：治疗组由 7 只随机分配的 6-7 周龄雌性 ICR-SCID 小鼠组成：（a）对照组（不治疗）；（b）B-DIM（50 mg/kg 体重）每日一次灌胃给药； (c) 腹腔注射厄洛替尼（50 mg/kg 体重），每日一次，连续 15 天；(d) 根据各治疗方案分别给予 B-DIM 和厄洛替尼。所有小鼠在最后一次给药后，于第 3 天处死，并记录体重。一部分组织立即置于液氮中冷冻，并保存在 -70°C 的低温环境中以备后用；剩余部分用福尔马林固定，并制备石蜡包埋组织块。通过对固定组织切片进行苏木精-伊红 (H&E) 染色，验证每只小鼠胰腺中是否存在肿瘤。

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\n\n大鼠：使用 6 周龄、体重 180–210 g 的雄性 Sprague-Dawley (SD) 大鼠。在第0天，SD大鼠（n=28）腹腔注射7 mg/kg新鲜配制的浓度为1 mg/mL的环丙沙星（CP）。为了研究厄洛替尼的作用，将28只CP-N大鼠分为两组。两组动物（n=14）从第-1天（CP注射前24小时）至第3天，每天灌胃给予厄洛替尼（20 mg/kg）（CP+E组，n=14）或赋形剂（CP+V组，n=14）。赋形剂组灌胃给予等量的生理盐水。6周龄时，正常对照组（NC组，n=5）由5只雄性SD大鼠组成。从第1天到第3天，NC组大鼠灌胃给予等量的生理盐水。第4天（CP注射后96小时）：大鼠麻醉后，经心脏穿刺放血处死。同时取出肾脏和血液。肾组织切片后固定于2%多聚甲醛/磷酸盐缓冲液（PBS）中备用，或可液氮速冻。为尽可能减轻动物痛苦，所有手术操作均采用乙醚气体麻醉。\n

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\n小鼠随机分为以下治疗组（n = 7）：（a）未治疗对照组；（b）仅B-DIM（50 mg/kg体重），每日一次灌胃；（c）厄洛替尼（50 mg/kg体重），每日一次腹腔注射，连续15天；（d）B-DIM联合厄洛替尼，给药方案与各组相同。所有小鼠均在末次给药后第3天处死，并测定其体重。一部分组织迅速置于液氮中冷冻，并储存于−70°C冰箱中备用；另一部分组织用福尔马林固定，并制成石蜡包埋块。采用苏木精-伊红（H&E）染色法对固定组织切片进行染色，以确认每只小鼠胰腺中是否存在肿瘤。[2] 顺铂（CP）用生理盐水新鲜配制，浓度为1 mg ml−1，于第0天以7 mg/kg的剂量腹腔注射至SD大鼠（n = 28）体内。CP的剂量选择参考了之前的研究。为了研究厄洛替尼的作用，将28只CP-N大鼠分为两组。将动物分为若干组（n = 14），每组分别灌胃给予厄洛替尼（20 mg/kg，Cugai Pharmaceutical/F. Hoffmann-La Roche，瑞士巴塞尔）（CP+E组，n = 14）或赋形剂（CP+V组，n = 14），从第-1天（CP注射前24小时）至第3天，每日一次。赋形剂组灌胃给予等体积的生理盐水。另取5只6周龄雄性SD大鼠作为正常对照组（NC组，n = 5）。NC组大鼠从第-1天至第3天，每日一次灌胃给予等体积的生理盐水。第4天（CP注射后96小时），每只大鼠麻醉后经心脏穿刺放血处死；通过心脏穿刺采集血液并取出肾脏（图1）。将肾组织进行分离；部分组织样本被速冻于液氮中或固定于2%多聚甲醛/磷酸盐缓冲液（PBS）中，以备后续使用。所有手术均在乙醚气体麻醉下进行，并尽一切努力减轻患者的痛苦。[PLoS One. 2014年11月12日;9(11):e111728.]

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溶于 6% Captisol；50 mg/kg；灌胃

5 周龄雄性 BALB-nu/nu 裸鼠，携带 HPAC 细胞

吸收、分布和排泄
厄洛替尼口服后吸收率约为60%，食物可显著提高其生物利用度至接近100%。血浆峰浓度出现在给药后4小时。厄洛替尼的溶解度受pH值影响，pH值升高时溶解度降低。吸烟也会降低厄洛替尼的暴露量。
口服100 mg后，91%的剂量被回收，其中83%在粪便中排出（以原药形式占剂量的1%），8%在尿液中排出（以原药形式占剂量的0.3%）。
表观分布容积 = 232 L
吸烟者的厄洛替尼清除率高出24%。
厄洛替尼口服后吸收率约为60%，食物可显著提高其生物利用度至接近100%。给药后4小时达到血浆峰浓度。厄洛替尼的溶解度受pH值影响，pH值越高，溶解度越低。吸收后，厄洛替尼约93%与血浆白蛋白和α1-酸性糖蛋白结合。厄洛替尼的表观分布容积为232升。达到稳态血浆浓度所需时间为7-8天。未观察到清除率与患者年龄、体重或性别等协变量存在显著相关性。吸烟者厄洛替尼的清除率高出 24%。
口服 100 mg 后，91% 的剂量被回收：83% 从粪便中排出（占完整母体药物剂量的 1%），8% 从尿液中排出（占完整母体药物剂量的 0.3%）。
有关厄洛替尼（共 10 项）的更多吸收、分布和排泄（完整）数据，请访问 HSDB 记录页面。

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代谢/代谢物
代谢发生在肝脏。体外细胞色素P450代谢试验表明，厄洛替尼主要由CYP3A4代谢，其次由CYP1A2和肝外同工酶CYP1A1代谢。
本研究在健康男性志愿者中开展，研究了口服表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼的代谢和排泄情况。受试者单次口服¹⁴C-厄洛替尼盐酸盐（相当于100 mg游离碱，约91 μCi/受试者）后，在血浆中检测到未代谢的厄洛替尼，其主要循环成分为原形厄洛替尼，而具有药理活性的代谢物M14约占总循环放射性的5%。厄洛替尼的三种主要生物转化途径是：侧链O-去甲基化，随后氧化为羧酸M11（占剂量的29.4%）；乙炔部分氧化生成羧酸M6（21.0%）；芳香环羟基化生成M16（9.6%）。此外，M6的O-去甲基化生成M2，侧链的O-去甲基化生成M13和M14，以及氧化代谢物与葡萄糖醛酸（M3、M8和M18）和硫酸（M9）的结合，在厄洛替尼的代谢中起次要作用。已鉴定的代谢物占尿液和粪便中回收的总放射性的90%以上。在人体中观察到的代谢物与毒性动物（大鼠和犬）中发现的代谢物相似。
厄洛替尼已知的代谢物包括厄洛替尼M14。

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生物半衰期
中位半衰期为36.2小时。
一项对591例接受单药盐酸厄洛替尼二线/三线治疗的患者进行的群体药代动力学分析显示，中位半衰期为36.2小时。

肝毒性
在厄洛替尼治疗胰腺癌和肺癌期间，血清转氨酶水平升高较为常见，至少10%的患者会出现超过正常值上限5倍以上的ALT值。然而，类似的ALT升高发生率在使用类似的抗肿瘤方案时也会出现。这些异常通常无症状且可自行消退，但可能需要调整剂量或停药（病例1）。此外，也有少数病例报告称厄洛替尼治疗可导致临床上明显的肝损伤。肝损伤通常在开始治疗后的几天或几周内出现，且可能很严重，文献中至少报道了12例死亡病例。肝损伤可能突然发生，血清酶升高的模式通常为肝细胞性（病例2）。免疫过敏反应（皮疹、发热和嗜酸性粒细胞增多）并不常见，也未见自身抗体形成的报道。建议在治疗期间常规监测肝功能。既往存在肝硬化或因肝肿瘤负荷导致肝功能损害的患者，发生临床显著肝损伤和肝衰竭的风险增加。
可能性评分：B（可能但不常见，是导致临床明显肝损伤的原因）。

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妊娠和哺乳期影响
◉ 哺乳期用药概述
目前尚无厄洛替尼在哺乳期临床应用的信息。由于厄洛替尼与血浆蛋白的结合率高达93%，因此其在乳汁中的含量可能较低。然而，其半衰期约为36小时，可能会在婴儿体内蓄积。此外，厄洛替尼还与吉西他滨联合用于治疗胰腺癌，这可能会增加婴儿的风险。制造商建议在厄洛替尼治疗期间以及末次给药后 2 周内停止母乳喂养。
◉ 对母乳喂养婴儿的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。
◉ 对泌乳和母乳的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。

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蛋白质结合
93% 与白蛋白和 α-1 酸性糖蛋白 (AAG) 结合

[1]. Induction of apoptosis and cell cycle arrest by CP-358,774, an inhibitor of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase. Cancer Res. 1997 Nov 1;57(21):4838-48.

[2]. Apoptosis-inducing effect of erlotinib is potentiated by 3,3'-diindolylmethane in vitro and in vivo using an orthotopic model of pancreatic cancer. Mol Cancer Ther, 2008, 7(6), 1708-1719.

[3]. Effect of the ATP-binding cassette drug transporters ABCB1, ABCG2, and ABCC2 on erlotinib hydrochloride (Tarceva) disposition in in vitro and in vivo pharmacokinetic studies employing Bcrp1-/-/Mdr1a/1b-/- (triple-knockout) and wild-type mice.Mol Cancer Ther. 2008 Aug;7(8):2280-7.

[4]. Effects of erlotinib on lung injury induced by intratracheal administration of bleomycin (BLM) in rats. J Toxicol Sci. 2010 Aug;35(4):503-14.

我们体外检测了口服活性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂盐酸厄洛替尼（Tarceva，OSI-774）是否是ATP结合盒药物转运蛋白P-糖蛋白（P-gp；MDR1、ABCB1）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP；ABCG2）和多药耐药蛋白2（MRP2；ABCC2）的底物，以及P-gp和BCRP是否影响盐酸厄洛替尼的体内口服药代动力学。我们使用Madin-Darby犬肾II细胞系[MDCKII；野生型（WT）、MDR1、BCRP1和MRP2]和LLCPK细胞（WT和MDR1）以及IGROV1和衍生的过表达人BCRP的T8细胞系，进行了体外细胞存活率、药物转运、蓄积和厄洛替尼外排的检测。本研究在Bcrp1/Mdr1a/1b(-/-)（三基因敲除）小鼠和野生型小鼠中，研究了口服和腹腔注射厄洛替尼后的体内药代动力学。体外实验表明，厄洛替尼可被P-gp和BCRP/Bcrp1主动转运，而未观察到MRP2对厄洛替尼的主动转运。体内实验显示，与野生型小鼠（40.0%）相比，Bcrp1/Mdr1a/1b(-/-)基因敲除小鼠口服（5 mg/kg）后，其全身暴露量（P = 0.01）和生物利用度均显著升高（60.4% vs. 40.0%；P = 0.02）。结论：体外实验表明，厄洛替尼可被P-gp和BCRP/Bcrp1有效转运。体内实验表明，P-gp和Bcrp1的缺失显著影响厄洛替尼的口服生物利用度。需要探讨P-gp/BCRP抑制剂底物与口服厄洛替尼在肠道中可能发生的药物相互作用（包括药物-药物相互作用和药物-草药相互作用）的临床后果。[3]

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表皮生长因子受体（EGFR）在相当一部分癌中过度表达，并促进恶性表型的形成。CP-358,774是一种直接作用于人EGFR酪氨酸激酶的抑制剂，IC50为2 nM，并且能以20 nM的IC50降低完整肿瘤细胞中EGFR的自身磷酸化。这种抑制作用对我们检测过的其他酪氨酸激酶具有选择性，无论是在分离的激酶还是在完整细胞的检测中均如此。在100 mg/kg的剂量下，CP-358,774可完全抑制人HN5肿瘤（以异种移植形式在无胸腺小鼠体内生长）以及经治疗小鼠肝脏中EGFR的EGF诱导的自身磷酸化。在细胞培养中，CP-358,774在亚微摩尔浓度下即可抑制DiFi人结肠癌细胞的增殖，并阻滞细胞周期于G1期。该抑制剂可导致DiFi细胞中视网膜母细胞瘤蛋白（RP）低磷酸化形式的显著积累以及p27KIP1的积累，这可能是导致细胞周期阻滞的原因。EGFR的抑制还能诱导这些细胞凋亡，这可通过DNA片段的形成和其他指标来判断。这些结果表明，CP-358,774具有治疗依赖EGFR通路增殖或存活的肿瘤的潜力。 [1]

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由于存在独立激活的生存通路，仅使用表皮生长因子受体 (EGFR) 酪氨酸激酶抑制剂阻断 EGFR 不足以产生有效的抗肿瘤活性。因此，多靶点策略可能改善抗 EGFR 疗法的疗效。在本研究中，我们利用原位动物肿瘤模型，在体外和体内研究了 3,3'-二吲哚甲烷（Bioresponse BR-DIM，简称 B-DIM）——一种具有更高生物利用度的制剂型二吲哚甲烷——对细胞活力和凋亡的影响，并探讨了其与厄洛替尼联合应用的效果。我们用 B-DIM (20 μmol/L)、厄洛替尼 (2 μmol/L) 以及二者联合用药处理具有不同 EGFR 和核因子-κB (NF-κB) DNA 结合活性的 BxPC-3 和 MIAPaCa 细胞。采用 MTT 法和组蛋白-DNA ELISA 法评估细胞存活率和凋亡情况。电泳迁移率变动分析用于评估 NF-κB DNA 结合活性。我们发现，与单独使用厄洛替尼或 B-DIM 相比，厄洛替尼联合 B-DIM 处理 BxPC-3 细胞可显著降低细胞活力（MTT 法和克隆形成实验均证实了这一点），诱导细胞凋亡，下调 EGFR 磷酸化水平、NF-κB DNA 结合活性以及抗凋亡基因的表达。相反，在 MIAPaCa 细胞中，类似处理未观察到此类效应。最重要的是，这些体外实验结果在动物模型中得到了验证，表明B-DIM与厄洛替尼联合用药的抗肿瘤疗效远优于单独使用任一药物。这些结果提示，对于肿瘤中EGFR和NF-κB激活的患者，使用B-DIM可能是一种有效的治疗策略，有助于改善治疗效果。[2]

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关于本研究的局限性，我们必须考虑以下几个问题。首先，本研究未控制三组动物的食物摄入量。由于动物并非配对喂养，因此难以确定体重下降是由于摄入量低还是CP诱导的AKI本身所致。其次，本研究未探讨肾小管功能障碍，包括盐和镁的丢失，而这正是CP-N最常见的生理异常之一。第三，本研究未考察厄洛替尼对CP诱导的AKI恢复期的治疗效果。临床上，对于接受CP化疗的患者而言，治疗恢复期的疗效以及预防早期AKI的疗效都至关重要。最后，厄洛替尼对CP抗肿瘤作用的影响尚未得到证实。需要使用不同的肿瘤细胞系（如既往研究）进行进一步研究，以评估厄洛替尼降低CP诱导的细胞死亡是否具有肾脏特异性。
总之，我们的体内和体外研究表明，厄洛替尼对CP-N具有肾脏保护作用，这种作用可能归因于近端肾小管细胞凋亡和增殖的减弱。厄洛替尼的保护作用似乎是通过抑制EGFR下游信号通路（包括MAPK和PI3K-Akt）介导的。这些结果提示，厄洛替尼可能有助于预防接受CP化疗患者的急性肾损伤。[PLoS One. 2014年11月12日;9(11):e111728.]

C22H23N3O4.CH4O3S

489.541

489.156

C, 56.43; H, 5.56; N, 8.58; O, 22.88; S, 6.55

248594-19-6

Erlotinib Hydrochloride;183319-69-9;Erlotinib;183321-74-6

9913428

Typically exists as solid at room temperature

138

2

10

11

34

618

0

CS(=O)(O)=O.COCCOC1=CC2=NC=NC(NC3=CC=CC(C#C)=C3)=C2C=C1OCCOC

PCBNMUVSOAYYIH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H23N3O4.CH4O3S/c1-4-16-6-5-7-17(12-16)25-22-18-13-20(28-10-8-26-2)21(29-11-9-27-3)14-19(18)23-15-24-22;1-5(2,3)4/h1,5-7,12-15H,8-11H2,2-3H3,(H,23,24,25);1H3,(H,2,3,4)

N-(3-ethynylphenyl)-6,7-bis(2-methoxyethoxy)quinazolin-4-amine;methanesulfonic acid

CP358774 mesylate; NSC 718781 mesylate;CP358774 mesylate, NSC 718781 mesylate;CP-358,774 mesylate; ERLOTINIB MESYLATE; 248594-19-6; Erlotinib (mesylate); 248594-19-6 (mesylaye); N-(3-ethynylphenyl)-6,7-bis(2-methoxyethoxy)quinazolin-4-amine;methanesulfonic acid; N-(3-Ethynylphenyl)-6,7-bis(2-methoxyethoxy)-4-quinazolinamine methansulfonic acid; ERLOTINIBMESYLATE; SCHEMBL33835; CP-358774 mesylate; OSI-774 mesylate; OSI 774 mesylate; OSI774 mesylate; Erlotinib mesylate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。