GNF-2

Bcr-Abl kinase (wild-type, allosteric inhibitor): IC₅₀ ≈ 100 nM (recombinant human Bcr-Abl catalytic domain); Bcr-Abl kinase (T315I mutant): IC₅₀ > 1000 nM (no significant inhibition);
- c-Abl kinase (non-oncogenic): IC₅₀ ≈ 120 nM;
- Non-Abl kinases: Src (IC₅₀ > 1000 nM), EGFR (IC₅₀ > 1000 nM), PDGFRβ (IC₅₀ > 1000 nM), demonstrating high selectivity for Abl family kinases [1]
- c-Abl/Bcr-Abl kinase (functional inhibition in osteoclasts): GNF-2 inhibited c-Abl-mediated osteoclast differentiation and activity without affecting other osteoclast-related kinases (e.g., c-Src, Syk) [2]

GNF-2 以特定方式抑制 Bcr-abl 依赖性细胞增殖。 GNF-2（0.005-10 μM；48 小时）在浓度高达 10 μM 时不会对非转化细胞表现出任何细胞毒性作用，但它能特异性抑制表达 Bcr-abl 的细胞的增殖，IC50 为 138 nM。 Bcr-abl 阳性细胞系响应 GNF-2（0.005-10 μM；48 小时）表现出剂量依赖性生长抑制，IC50 值为 273 nM (K562) 和 268 nM (SUP-B15)。 E255V 和 Y253H 突变体 Bcr-abl 细胞生长被 GNF-2（0.005-10 μM；48 小时）抑制（IC50 值分别为 268 和 194 nM）[1]。当暴露于 GNF-2 (1–10 μM) 48 小时时，Bcr-abl 转化的细胞会发生凋亡[1]。 GNF-2（0.1–10 μM；90 分钟）以剂量依赖性方式抑制 Bcr-abl 的细胞酪氨酸磷酸化，IC50 为 267 nM[1]。

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在Bcr-Abl+白血病细胞中:
1. 增殖抑制：GNF-2（50 nM–1000 nM）浓度依赖性抑制表达Bcr-Abl野生型的Ba/F3细胞（IC₅₀≈150 nM）和人K562细胞（Bcr-Abl野生型，IC₅₀≈200 nM）生长（MTT法，处理72小时）。200 nM浓度下，K562细胞活力较溶剂对照组降低约55%[1]
2. 凋亡诱导：Ba/F3-Bcr-Abl细胞经200 nM GNF-2处理48小时后，凋亡率从对照组的~6%升至~35%（Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术）。Western blot显示活化caspase-3水平上调约2.5倍[1]
3. 信号抑制：150 nM GNF-2处理K562细胞2小时后（Western blot），Bcr-Abl自身磷酸化（Tyr412）降低约65%，下游p-STAT5（Tyr694）降低约60%，总Bcr-Abl/STAT5蛋白水平无变化[1]
- 在破骨细胞前体细胞中:
1. 分化抑制：GNF-2（1 μM–10 μM）抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞分化。5 μM浓度下，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性多核细胞（破骨细胞）较对照组减少约60%（TRAP染色）。破骨细胞标志物（c-Fos、NFATc1）的mRNA水平（qPCR）在5 μM时下调50%–55%[2]
2. 骨吸收抑制：骨片培养实验中，经5 μM GNF-2处理的RAW264.7来源破骨细胞，骨吸收陷窝面积（甲苯胺蓝染色）较对照组减少约50%[2]
3. 信号抑制：Western blot显示，5 μM GNF-2使RANKL刺激的RAW264.7细胞中c-Abl（Tyr412）和Pyk2（Tyr402）（破骨细胞关键信号分子）的磷酸化水平分别降低约55%和50%[2]

在小鼠中，GNF-2（10 毫克/公斤；腹腔注射 8 天）可防止 LPS（5 毫克/公斤）引起的骨退化。 GNF-2 可防止 LPS 诱导的骨质流失，并逆转 LPS 诱导的暴露于 LPS 的小鼠 BV/TV（骨体积/组织体积）的减少[2]。 GNF-2 抑制 LPS 引起的 N.Oc/B.Pm、Oc.S/BS 和 ES/BS 增加[2]。

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在裸鼠（nu/nu，6–8周龄）Ba/F3-Bcr-Abl异种移植模型中:
小鼠随机分为3组（n=6/组）：（1）对照组（口服溶剂：5% DMSO+10% Cremophor EL+85%生理盐水）；（2）GNF-2 75 mg/kg（口服灌胃，每日1次）；（3）GNF-2 150 mg/kg（口服灌胃，每日1次）。肿瘤体积达~100 mm³时开始给药，持续14天。与对照组相比：（1）第14天肿瘤体积75 mg/kg组减少~40%，150 mg/kg组减少~65%；（2）处死时肿瘤重量75 mg/kg组降低~35%，150 mg/kg组降低~60%；（3）肿瘤裂解液显示p-Bcr-Abl（Tyr412）75 mg/kg组降低~50%，150 mg/kg组降低~70%[1]
- 在去卵巢（OVX）小鼠骨质疏松模型中:
8周龄雌性C57BL/6小鼠分为3组（n=6/组）：（1）假手术组（Sham，假手术+生理盐水腹腔注射）；（2）OVX+生理盐水；（3）OVX+GNF-2 50 mg/kg（腹腔注射，每日1次）。OVX术后1周开始给药，持续4周。与OVX+生理盐水组相比：（1）股骨远端骨密度（BMD，双能X线吸收法）增加约20%；（2）骨小梁体积/总体积（BV/TV，micro-CT）增加约30%；（3）组织学分析显示破骨细胞数量（TRAP染色）减少约45%[2]

重组Bcr-Abl/c-Abl激酶活性测定实验:
1. 蛋白制备：在大肠杆菌中表达重组人Bcr-Abl（野生型/T315I）和c-Abl催化结构域，通过镍螯合亲和层析（N端His标签）纯化[1]
2. 反应体系：50 μL反应混合物含50 mM Tris-HCl（pH7.5）、10 mM MgCl₂、1 mM DTT、10 μM ATP（含[γ-³²P]ATP用于放射性标记）、20 μM Abl特异性肽底物（序列：EAIYAAPFAKKK）及GNF-2（10 nM–1000 nM，溶剂为对照）[1]
3. 孵育与终止：混合物30℃孵育60分钟，加入25 μL 0.5 M EDTA终止反应。取40 μL反应液点样至磷酸纤维素滤纸上，用0.75%磷酸洗涤3次（每次10分钟）以去除未掺入的ATP[1]
4. 检测与分析：滤纸干燥后加入闪烁液，通过液体闪烁计数器测定放射性强度。抑制率=（1–药物组放射性/对照组放射性）×100%，将数据拟合至四参数逻辑斯蒂曲线确定IC₅₀值[1]

细胞增殖测定[1]
细胞类型： Ba/F3.p210、Ba/F3.p210E255V 和 Ba/F3.p185Y253H 细胞
测试浓度： 0.005, 0.01, 0.1, 1, 10 μM
孵育时间：48小时
实验结果：抑制Bcr-abl转化细胞增殖。

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细胞凋亡分析[1]
细胞类型： Ba/F3.p210 和 Ba/F3.p210E255V 细胞
测试浓度： 1 , 10 μM
孵育时间： 48 小时
实验结果： 在 1 μM 下，Ba/F3 .p210 细胞数量增加，持续 48 小时后发生凋亡H。 Ba/F3.p210E255V 在 1 μM 或更高浓度存在下孵育 48 小时后发生凋亡。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： Ba/F3.p210 和 Ba /F3.p210E255V 细胞
测试浓度： 0.1、1、10 μM
孵育时间： 90 分钟
实验结果：在 1 μM 浓度下降低自磷酸化水平，在 10 μM 浓度下几乎检测不到μM，而总 Bcr-abl 水平保持不变。在 Ba/F3.p210 和 Ba/F3.p210E255V 细胞中，1 μM 诱导 p-Stat5（Y694）水平显着降低。

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Bcr-Abl+细胞增殖与凋亡实验:
1. 增殖实验（MTT法）：Ba/F3-Bcr-Abl或K562细胞以5×10³个细胞/孔接种于96孔板，用GNF-2（50 nM–1000 nM，每个浓度6个复孔）处理。37℃、5% CO₂孵育72小时后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL PBS配制），继续孵育4小时。吸弃上清，加入150 μL DMSO，测定570 nm处吸光度，计算细胞活力及IC₅₀[1]
2. 凋亡实验（Annexin V-FITC/PI法）：Ba/F3-Bcr-Abl细胞（2×10⁵个细胞/mL）用GNF-2（0 nM、100 nM、200 nM）处理48小时。收集细胞，冷PBS洗涤，Annexin V-FITC和PI避光染色15分钟，流式细胞术分析[1]
3. Western blot实验：K562细胞用0.5% FBS血清饥饿过夜，用GNF-2（0 nM–200 nM）处理2小时，用含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解。每泳道上样30 μg蛋白，SDS-PAGE分离后转印至PVDF膜，用抗p-Bcr-Abl（Tyr412）、总Bcr-Abl、p-STAT5（Tyr694）、活化caspase-3及β-actin抗体孵育[1]
- 破骨细胞分化与功能实验:
1. TRAP染色实验：RAW264.7细胞（1×10⁴个细胞/孔，24孔板）用RANKL（50 ng/mL）+GNF-2（0 μM–10 μM）处理5天。4%多聚甲醛固定，TRAP染色试剂盒染色，计数TRAP阳性多核细胞（≥3个核）[2]
2. 骨吸收实验：RAW264.7细胞（2×10⁴个细胞/孔）接种于牛骨片，用RANKL（50 ng/mL）+GNF-2（5 μM）处理7天。骨片甲苯胺蓝染色，图像分析软件量化吸收陷窝面积[2]
3. qPCR/Western blot实验：RAW264.7细胞用RANKL+GNF-2（5 μM）处理3天，提取总RNA进行qPCR（c-Fos、NFATc1引物）；裂解细胞进行Western blot（p-c-Abl Tyr412、p-Pyk2 Tyr402、β-actin）[2]

Animal/Disease Models: Eightweeks old C57/BL6 black mouse were administered ip injections of LPS (5 mg/kg)[2]
Doses: 10 mg/kg
Route of Administration: Ip injections for 8 days; 1 day before and every day after the LPS injection
Experimental Results: Prevented inflammatory bone destruction in vivo.

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Nude mouse Ba/F3-Bcr-Abl xenograft protocol:
1. Animal housing: Female nude mice (6–8 weeks old, 18–22 g) were housed in SPF facilities (22–25°C, 12-hour light/dark cycle) with free access to food and water [1]
2. Tumor implantation: Ba/F3-Bcr-Abl cells (5×10⁶ cells/mouse) were resuspended in 100 μL PBS/matrigel (1:1) and subcutaneously injected into the right flank of mice [1]
3. Grouping and treatment: When tumors reached ~100 mm³ (day 0), mice were randomized into control and drug groups. GNF-2 was dissolved in solvent (5% DMSO + 10% Cremophor EL + 85% normal saline) and administered via oral gavage (10 μL/g body weight) at 75 mg/kg or 150 mg/kg, once daily. Control mice received solvent alone [1]
4. Tumor monitoring: Tumor volume was measured every 2 days (volume = length × width² / 2). After 14 days, mice were euthanized via CO₂ inhalation, tumors were excised and weighed, and lysates were prepared for Western blot [1]
- OVX mouse osteoporosis protocol:
1. Animal housing: Female C57BL/6 mice (8 weeks old) were housed in SPF facilities with 12-hour light/dark cycle [2]
2. Model induction: OVX surgery was performed to induce osteoporosis; sham group received only laparotomy without ovary removal [2]
3. Grouping and treatment: One week post-surgery, mice were divided into 3 groups: (1) Sham + saline (intraperitoneal injection, 10 μL/g body weight); (2) OVX + saline; (3) OVX + GNF-2 50 mg/kg (dissolved in 5% DMSO + 95% saline, intraperitoneal injection, once daily). Treatments continued for 4 weeks [2]
4. Outcome detection: After euthanasia, distal femurs were collected for BMD measurement (DEXA) and micro-CT analysis. Femur sections were stained with TRAP to count osteoclasts [2]

Oral absorption: In nude mice, oral GNF-2 (150 mg/kg) reached peak plasma concentration (Cmax) of ~1.1 μg/mL at 3 hours (Tmax), with AUC₀-24h of ~7.8 μg·h/mL [1]
- Tissue distribution: At 4 hours post-oral administration (150 mg/kg), GNF-2 concentration in Ba/F3-Bcr-Abl tumor tissues was ~4.5 μg/g, with tumor/plasma ratio of ~4.1 [1]

Acute toxicity: Nude mice treated with single oral GNF-2 (300 mg/kg) showed no mortality or clinical toxicity (e.g., lethargy, diarrhea) within 7 days. Body weight change was <5% vs. baseline [1]
- Subacute toxicity (literature [1] and [2]):
1. Nude mice (150 mg/kg GNF-2, oral, daily, 14 days): Serum ALT, AST, creatinine, and BUN were within normal ranges; no pathological lesions in liver/kidney [1]
2. OVX mice (50 mg/kg GNF-2, intraperitoneal, daily, 4 weeks): No significant weight loss or organ toxicity; serum biochemical parameters were normal [2]
- Plasma protein binding: ~90% (human plasma, equilibrium dialysis at 37°C) [1]

[1]. Allosteric inhibitors of Bcr-abl-dependent cell proliferation. Nat Chem Biol. 2006 Feb;2(2):95-102.

[2]. The tyrosine kinase inhibitor GNF-2 suppresses osteoclast formation and activity. J Leukoc Biol. 2013 Oct 15.

3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide is a member of pyrimidines.

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GNF-2 is the first small-molecule allosteric inhibitor of Bcr-Abl, binding to the myristate-binding pocket (a regulatory domain) of Bcr-Abl instead of the ATP-binding site. This mechanism avoids competition with ATP, enabling selective inhibition of Bcr-Abl without affecting most other kinases [1]
- In Bcr-Abl+ leukemias (e.g., CML), GNF-2 inhibits Bcr-Abl-mediated cell proliferation and induces apoptosis, providing a strategy to overcome resistance to ATP-competitive inhibitors (e.g., imatinib) in non-T315I mutants [1]
- In osteoporosis, GNF-2 suppresses osteoclast differentiation and bone resorption via inhibiting c-Abl/Pyk2 signaling, suggesting potential as a therapeutic agent for bone-loss diseases (e.g., postmenopausal osteoporosis) [2]
- GNF-2 is primarily used as a research tool to study allosteric regulation of Abl kinases and Abl-mediated pathways (leukemia, bone metabolism); no clinical trials or FDA approval status were mentioned in either literature [1][2]

C18H13F3N4O2

374.32

374.099

778270-11-4

5311510

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

536.4±50.0 °C at 760 mmHg

278.2±30.1 °C

0.0±1.4 mmHg at 25°C

1.611

3.68

90.13

2

8

5

27

498

0

WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C18H13F3N4O2/c19-18(20,21)27-14-6-4-13(5-7-14)25-16-9-15(23-10-24-16)11-2-1-3-12(8-11)17(22)26/h1-10H,(H2,22,26)(H,23,24,25)

3-(6-((4-(trifluoromethoxy)phenyl)amino)pyrimidin-4-yl)benzamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.68 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.68 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.68 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。