DNMT1
GSK3685032 targets DNA methyltransferase 1 (DNMT1), the enzyme responsible for maintaining DNA methylation patterns during cell division. GSK3685032 is a non-covalent, reversible, and selective DNMT1 inhibitor with an IC50 of 36 nM (0.036 µM). It is over 2500-fold more selective for DNMT1 than DNMT3A/3L and DNMT3B/3L.

GSK-3685032（6天）的生长IC50中位数为0.64 μM，表明其能抑制大多数癌细胞系的生长[1]。在整个6天的实验期间，GSK-3685032（0.1-1000 nM，第1-6天）的生长IC50值逐渐降低，并在3天后即表现出生长抑制作用[1]。GSK-3685032（10-1000 nM，第4天）呈剂量依赖性地增加免疫相关基因的转录[1]。GSK-3685032（3.2-10,000 nM，2天）抑制DNMT1蛋白的表达[1]。 GSK3685032 可诱导 DNA 低甲基化和基因激活 [1]。体外实验表明，GSK3685032 可抑制 DNMT1，IC50 值为 0.036 µM。它可诱导 DNA 甲基化丢失和转录激活，并抑制癌细胞生长。在 15 种白血病细胞系、29 种淋巴瘤细胞系和 7 种多发性骨髓瘤细胞系（例如 EOL-1、Ki-JK、MM.IR 细胞）中，GSK3685032（处理 6 天）对大多数癌细胞系均显示出生长抑制作用，中位 IC50 值为 0.64 µM。

在皮下 MV4-11 或 SKM-1 异种移植模型中，GSK-3685032（1–45 mg/kg；皮下注射，每日两次，持续 28 天）可减缓肿瘤的形成[1]。小鼠药代动力学参数汇总：GSK-3685032[1]；剂量，给药途径；Cmax（ng/mL）；AUC0-8hr（h*ng/mL）；DNAUC（h*kg*ng/mL/mg）；清除率（mL/min/kg）；分布容积（L/kg）；T1/2（h） 2 mg/kg；静脉注射 5103 2418 1209 13 1.3 1.8 2 mg/kg； SC 252 921 461 NA NA 2.8 2 mg/kg，SC 5473 15400 513 NA NA ND
现有资料中关于 GSK3685032 的体内活性数据不够详尽。该化合物可诱导 DNA 甲基化和转录激活的丧失，并抑制癌细胞生长。它可用于肿瘤治疗研究。目前尚未报道动物模型中的具体体内疗效数据。

荧光耦合断续光检测法。[1]
使用半甲基化发夹寡核苷酸检测DNMTs活性的方法如前所述³⁹。最终检测浓度为125 nM DNA寡核苷酸，分别与以下化合物混合：(1) 40 nM全长DNMT1，2 μM SAM；(2) 600 nM DNMT3A/3L，2.5 μM SAM；或 (3) 300 nM DNMT3B/3L，0.15 μM SAM。DNMT1的反应在40分钟（26 °C）后终止，DNMT3A/3L和DNMT3B/3L的反应在120分钟（37 °C）后终止。化合物（10个浓度点，三倍系列稀释，100%二甲基亚砜）预先印制在黑色反应板（最终二甲基亚砜浓度为2%）上。通过用 1:4 比例的全甲基化/半甲基化发夹寡核苷酸（5ʹ-FAM-ATCTAG5me-dCG5me-dCATCAGTTTTCTGATG5me-dCG5me-dCTAGAT-Dabcyl-3ʹ 和 5ʹ-FAM-ATCTAGCG5me-dCATCAGTTTTCTGATG5me-dCG5me-dCTAGAT-Dabcyl-3ʹ，由 ATDBio 定制合成）代替 DNMT 反应，进行 Gla1 反向筛选。在可逆性研究中，将 DNMT1 与化合物（10× IC50）预孵育 20 分钟后，加入底物，将复合物快速稀释 100 倍。通过在稀释后不同时间点进行淬灭，评估 DNMT1 活性在 70 分钟内的恢复情况。数据拟合到 Ariazi 等人所述的固定稳态速度方程。

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组蛋白甲基转移酶和激酶选择性。[1]
使用专有的HotSpot技术评估了抑制剂对甲基转移酶47和激酶48的选择性。GSK-3685032以单一浓度（10 μM）测试了其对激酶谱的抑制作用。甲基转移酶谱加上PIM1、PKD2/PRKD2和DYRK2以IC50形式（10个浓度点，三倍系列稀释）进行测试。

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共价加合物的研究。[1]
将小鼠DNMT1（731–1602，5.6 μM）与14聚体半甲基化DNA（25 μM）在20 mM Tris pH 7.5、50 mM NaCl、5 mM二硫苏糖醇、20%甘油和2.5%二甲基亚砜中孵育，分别在有或无GSK3685032A（25 μM）的情况下孵育20小时。然后将等分试样用0.05% TFA、0.1%甲酸溶液稀释五倍，并取20 pmol蛋白质样品注入Agilent 6224 TOF LC-MS仪器进行完整质量分析，并检测可能的共价加合物。 14聚体半甲基化DNA双链购自IDT公司（5ʹ-GGAGGC5me-dCGCCTGCT-3ʹ，互补链为3ʹ-CCTCCGGCGGACGA-5ʹ）。

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光亲和标记。[1]
将小鼠DNMT1（731–1602，5.7 μM）与14聚体半甲基化DNA（25 μM）在20 mM Tris pH 7.5、50 mM NaCl、5 mM二硫苏糖醇、20%甘油、2.5%二甲基亚砜的缓冲液中孵育，并加入25 μM光反应抑制剂（GSK3844831或GSK3901839）。在紫外光（λ = 350 nm）照射下进行45分钟的光解。采用完整DNA质量分析监测光标记的掺入水平。光标记的mDNMT1经胃蛋白酶和因子XIII进行蛋白水解。通过与未标记的mDNMT1进行差异映射来鉴定标记的蛋白质片段，并使用基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的测序方法确定标记的氨基酸。使用Mascot v.2.6软件将MS/MS数据与内部蛋白质序列数据库进行比对，以确定共价标记的位置。

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DNMT1-DNA-抑制剂复合物的形成。[1]
将DNMT1-DNA-SAH以约1:5:10的摩尔比孵育2小时制备DNMT1-DNA复合物，并通过GE HiTrap Heparin HP柱进一步纯化。双链DNA（5ʹ-GAGGCMGCCTGC-3ʹ和5ʹ-GCAGGZGGCCTC-3ʹ，其中M代表5-甲基胞嘧啶，Z代表泽布拉林）包含12个碱基对的半甲基化寡核苷酸，其中靶胞嘧啶被泽布拉林取代。在结晶前，将纯化的DNMT1-DNA复合物与抑制剂（GSK-3685032或GSK3830052，溶于二甲基亚砜）在4℃下孵育1小时，蛋白质-DNA与抑制剂的摩尔比约为1:8。GSK3685032的体外酶活性测定包括测量DNMT1甲基转移酶活性的抑制情况。将重组DNMT1与DNA底物和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）在不同浓度的化合物存在下孵育。通过使用放射性或荧光检测方法定量DNA甲基化减少来确定IC50为0.036 µM。

细胞增殖试验[1]
细胞类型： 15种白血病细胞、29种淋巴瘤细胞和7种多发性骨髓瘤细胞系，例如EOL-1、Ki-JK、MM.IR细胞。
测试浓度： 0.01-100 μM
孵育时间： 6天
实验结果： 表明对大多数癌细胞系具有细胞生长抑制作用，生长IC50值的中位数为0.64 μM。

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细胞增殖试验[1]
细胞类型： MV4-11 细胞
测试浓度： 0.1-1000 nM
孵育时间： 1-6 天
实验结果： 3 天后观察到生长抑制，并且在整个 6 天的时间进程中，生长 IC50 逐渐降低。

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RT-PCR[1]
细胞类型： MV4-11 细胞
测试浓度： 10-10000 nM
孵育时间： 4 天
实验结果： MV4-11 细胞处理后，CXCL11、IFI27、HLA-DQA1 和 MAGEA4 的表达呈剂量依赖性增加。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： GDM-1 细胞
测试浓度： 3.2-10,000 nM
孵育时间： 2 天
实验结果： DNMT1 蛋白表达受到抑制
使用白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤细胞系进行 GSK3685032 的细胞实验。细胞用 GSK3685032 处理 6 天。使用标准方法评估细胞活力。通过亚硫酸氢盐测序或甲基化特异性 PCR 检测 DNA 甲基化。通过 RT-qPCR 或 RNA-seq 评估基因表达变化。

动物/疾病模型： MV4-11 异种移植模型（雌性 CD1-Foxn1 小鼠，12 周龄）或 SKM-1 异种移植模型（NOD.CB17-Prkdc1NCrCrl 小鼠，8-11 周龄）[1]
剂量： 1、5、15、30、45 mg/kg（10% Captisol，用 1 M 乙酸调节 pH 至 4.5-5，4 °C 保存，最多 1 周）
给药途径： 皮下注射，每日两次，连续 4 周
实验结果： 显示出具有统计学意义的剂量依赖性肿瘤生长抑制作用，在 ≥30 mg/kg 时出现显著的肿瘤消退。

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GSK-3685032 或载体（10%将卡普替索（用1 M乙酸调节至pH 4.5–5，4 °C下保存最多1周）皮下注射，每日两次，每次剂量为10 ml/kg（每20 g体重0.2 ml）。DAC（太阳制药工业公司）腹腔注射，每周三次，每次剂量为10 ml/kg。 DAC 使用适量的厂家稀释剂（10 ml 水中含 68 mg 磷酸二氢钾和 11.6 mg 氢氧化钠）进行复溶，配制成浓度为 0.04 mg ml⁻¹ 的给药溶液，并在给药前立即使用（最终剂量为 0.4 mg kg⁻¹）。[1]

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在查尔斯河实验室，我们评估了 GSK-3685032 在雌性 NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl 小鼠 MV4-11 人系统性 AML 模型中的疗效。为了清除骨髓，在尾静脉注射 MV4-11 细胞前 3 天，我们开始给 10 周龄的小鼠注射环磷酰胺（150 mg kg⁻¹）。植入后 21 天，我们开始根据体重和给药剂量进行随机分组。本研究共纳入70只动物（每组10只），在30个研究日内进行给药。GSK-3685032或赋形剂每日皮下注射两次，DAC每周腹腔注射两次。每周测量三次体重。若单次观察到体重下降超过30%，或连续两次体重下降超过25%，则对动物实施安乐死。出现与肿瘤进展相关的临床症状，例如后肢功能障碍或眼球突出，也会导致安乐死。该研究的终点为76天。[1]

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在未经处理的动物（每组3只小鼠，共9只小鼠）中进行了一项独立的药代动力学研究，小鼠分别接受单次静脉注射或皮下注射2 mg kg⁻¹（静脉注射，雄性CD-1小鼠）、2 mg kg⁻¹（皮下注射，雄性C57/BL6小鼠）或30 mg kg⁻¹（皮下注射，雌性Nu/Nu小鼠）的GSK-3685032，并在给药后24小时内采集混合血样。采用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定血药浓度，并使用Phoenix WinNonlin v.6.3（Certara）软件，通过非房室模型分析，根据平均血药浓度-时间曲线估算药代动力学参数。采用线性梯形法则计算血药浓度-时间曲线下面积，直至达到最大浓度 (Cmax)，之后采用线性或对数插值法则计算每个递增梯形下的面积。剂量归一化曲线下面积 (AUC) 通过将 AUC0-8 h 除以剂量计算得出。[1]
现有文献中未详细列出 GSK3685032 的体内动物研究。该化合物是一种用于研究癌症中 DNMT1 功能的研究工具。目前尚未报道具体的动物模型、给药方案和疗效数据。

所提供的资料来源中未包含GSK3685032的药代动力学数据。该化合物的分子量为420.53 g/mol，分子式为C22H24N6OS，可溶于DMSO。目前尚未报道其具体的药代动力学参数，例如半衰期、生物利用度和清除率。

目前尚无关于GSK3685032毒性数据的报道。作为一种研究用化合物，它不适用于治疗用途。该化合物已在细胞实验中进行过评估，但尚未确定其具体的毒理学特征。

[1]. Discovery of a first-in-class reversible DNMT1-selective inhibitor with improved tolerability and efficacy in acute myeloid leukemia. Nat Cancer. 2021;2(10):1002-1017.

DNA甲基化是转录沉默的关键表观遗传驱动因素，并在癌症中异常调控。使用去甲基化药物（例如胞苷类似物地西他滨或阿扎胞苷）逆转DNA甲基化已在血液系统恶性肿瘤中显示出临床疗效。这些核苷类似物可掺入复制中的DNA，并通过不可逆的共价相互作用抑制DNA胞嘧啶甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。这些药物对正常血细胞具有显著毒性，因此限制了其临床剂量。本文报道了GSK3685032的发现，它是一种高效的首创选择性DNMT1抑制剂。晶体学研究表明，GSK3685032与DNMT1的活性位点环竞争结合两个CpG碱基对之间的半甲基化DNA区域。 GSK3685032 在体外显著降低 DNA 甲基化水平，激活转录，并抑制癌细胞生长。与地西他滨相比，GSK3685032 具有更好的体内耐受性，因此在急性髓系白血病小鼠模型中显著降低肿瘤发生率并延长生存期。[1] 本文描述了 GSK3685032 的发现，它是一种首创的高效非核苷类、可逆、选择性 DNMT1 抑制剂。GSK3685032 通过一种独特的相互作用选择性地与 DNMT1 结合：该抑制剂与 DNMT1 活性位点环竞争进入半甲基化 DNA，并与 DNMT1 特异性转录激活结构域 (TRD) 相互作用。这种结合导致 DNA 甲基化水平快速降低和显著的转录激活。总体而言，GSK3685032 处理后 DNA 低甲基化（1-2 天）和转录激活（≥2 天）的动力学表明，敏感 AML 细胞生长和存活率的降低（≥4 天）与这些早期表观遗传改变直接相关。与 DNMT1 酶抑制作用增强相一致，GSK3685032 的生长抑制作用强于先前报道的非核苷类 DNMT 抑制剂（RG-108、SGI-1027 和 MC3343）[1]。尽管 GSK3685032 与 DAC 在体外实验中存在诸多相似之处，但值得注意的是，GSK3685032 表现出正常的剂量反应关系，在高剂量下仍能维持 DNA 去甲基化和转录激活，并且与 DAC 相比，其达到的最大去甲基化水平更高，尽管后者在表型上更有效。这些观察结果表明，虽然DNA整合型泛DNMT抑制剂和非共价DNMT1选择性抑制剂的作用部分重叠，但传统的HMA由于其非表观遗传作用机制而具有剂量限制性毒性。此外，由于DAC耐受性有限，这两类化合物在体内的靶点结合水平存在显著差异。GSK3685032可实现更高的靶点结合率和DNA低甲基化水平，从而转化为更强的抗肿瘤活性，在多种AML模型中观察到肿瘤完全消退和总生存期延长。因此，GSK3685032是一种耐受性良好的小分子，适用于体内研究选择性DNMT1抑制的下游效应，且不会产生DAC所观察到的复杂毒性。这些选择性DNMT1抑制剂具有毒性更低、耐受性更好、药代动力学更优等优点，为急性髓系白血病（AML）的临床治疗提供了更多机会，并有望拓展至其他肿瘤类型，包括传统HMA疗效有限的实体瘤。
GSK3685032是一种用于研究DNMT1在癌症表观遗传学中功能的化合物。它是首创的选择性DNMT1抑制剂，IC50值为36 nM。该化合物可诱导DNA甲基化和转录激活的丧失，并抑制癌细胞生长。目前仅供研究使用，可从商业供应商处购买。

C22H24N6OS

420.5306

420.173

C, 62.83; H, 5.75; N, 19.98; O, 3.80; S, 7.62

2170137-61-6

(R)-GSK-3685032;2170140-50-6;(S)-GSK-3685032;2170142-58-0

132233067

White to off-white solid powder

2.6

158

2

7

6

30

684

0

S(C([H])(C(N([H])[H])=O)C1C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=1[H])C1=C(C#N)C(C([H])([H])C([H])([H])[H])=C(C#N)C(=N1)N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])(C([H])([H])C1([H])[H])N([H])[H]

KNKHRZYILDZLRE-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H24N6OS/c1-2-16-17(12-23)21(28-10-8-15(25)9-11-28)27-22(18(16)13-24)30-19(20(26)29)14-6-4-3-5-7-14/h3-7,15,19H,2,8-11,25H2,1H3,(H2,26,29)

2-((6-(4-aminopiperidin-1-yl)-3,5-dicyano-4-ethylpyridin-2-yl)thio)-2-phenylacetamide

GSK3685032; GSK-3685032; GSK3685032 HCl; SCHEMBL19716804; GSK-3685032 HCl; GTPL11750; BDBM491199; GSK 3685032

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~25 mg/mL (~59.45 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.94 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.94 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.94 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。