DNMT1
The compound targets DNMT1 (DNA methyltransferase 1), the enzyme responsible for maintaining DNA methylation patterns during DNA replication. DNMT1 is frequently overexpressed in various cancers and contributes to the silencing of tumor suppressor genes through promoter hypermethylation. (R)-GSK-3685032 is a non-covalent, reversible inhibitor that binds to DNMT1 without time dependency, distinguishing it from covalent or mechanism-based inhibitors like decitabine or azacitidine.

GSK-3685032（6天）的生长IC50中位数为0.64 μM，表明其能抑制大多数癌细胞系的生长[1]。在整个6天的实验期间，GSK-3685032（0.1-1000 nM，第1-6天）的生长IC50值逐渐降低，并在3天后即表现出生长抑制作用[1]。GSK-3685032（10-1000 nM，第4天）呈剂量依赖性地增加免疫相关基因的转录[1]。GSK-3685032（3.2-10,000 nM，2天）抑制DNMT1蛋白的表达[1]。GSK-3685032诱导DNA低甲基化和基因激活[2]。

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生化实验表明，(R)-GSK-3685032 对 DNMT1 的抑制 IC50 值为 0.036 uM (36 nM)。细胞实验表明，浓度为 0.1-1000 nM 的 GSK-3685032（外消旋体或活性对映体）可显著降低 DNA 甲基化水平（通过 LINE-1 或整体甲基化水平检测）并激活沉默的抑癌基因的转录。经 6 天处理后，一系列癌细胞系的生长抑制 IC50 中位数为 0.64 uM，表明其具有广泛的抗增殖活性。

GSK3685032 对 DNMT1 的抑制作用在体内显示出疗效。[2] 在小鼠体内，GSK3685032 的清除率低，分布容积适中，血药半衰期 >1.8 小时，且在 1 至 45 mg kg−1 的剂量范围内，药物暴露量与剂量呈正比（扩展数据图 6a–c）。基于这些体内吸收、分布、代谢和排泄特性，采用皮下注射、每日两次给药的方案，以实现 GSK3685032 的持续靶向作用（扩展数据图 6d）。该给药方案耐受性良好，剂量高达 45 mg kg−1，持续 ≥4 周，未对体重、行为或梳理毛发产生明显的不良反应（扩展数据图 7a,b）。另一方面，配制后的 DAC 化学性质不稳定，需在给药前立即复溶。此外，由于其自发水解裂解和胞苷脱氨酶的快速代谢，该药物的药代动力学性质较差^16,17。此外，为了最大限度地减少重复给药后的毒性，采用了间歇给药方案以实现长期耐受的治疗方案。

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\n\nMV4-11 和 SKM-1 皮下异种移植模型显示，GSK3685032 剂量≥30 mg kg^-1 时肿瘤生长受到显著的剂量依赖性抑制，肿瘤明显消退（图 8a、b 和扩展数据图 7c-f）。此外，在停药后 4 周的观察期后，大多数（≥60%）动物在停药期间肿瘤体积维持在 ≤200 mm³（图 8c、d 和扩展数据图 7g、h）。在MV4-11模型中，GSK3685032 45 mg kg−1组10只动物中有5只在最后一次给药日（第35天）肿瘤体积≤50 mm3。停药30天后，这5只动物的肿瘤体积仍维持在≤50 mm3，表明在治疗期间消退的肿瘤亚群在停药后仍保持了持久的疗效（扩展数据图7g）。相比之下，DAC仅实现了中等程度的肿瘤生长抑制（在SKM-1和MV4-11模型中分别相对于载体对照组抑制18%和57%），且在两个模型中均无统计学意义（图8a、b和扩展数据图7c-f）。为了更好地模拟AML疾病的生理过程，我们还探索了播散性AML模型。给药30天后，GSK3685032在15、30和45 mg kg−1剂量组以及DAC治疗组均观察到具有统计学意义的生存获益（图8e）。DAC组的生存获益较对照组延长了13天，而GSK3685032组的生存获益超过43天，50%的小鼠在给药结束后存活近7周。[2] 给药8天后，在SKM-1模型中评估了药效学效应。在所有剂量的GSK3685032处理下，肿瘤中均观察到剂量依赖性的DNA低甲基化，其中45 mg kg−1组的DNA低甲基化程度最高，达46%（图8f）。相比之下，每周三次、最大耐受剂量的DAC在药效学活性和肿瘤生长抑制方面更接近于1 mg kg⁻¹的GSK3685032剂量（图8b,f）。鉴于观察到的DAC临床毒性，包括中性粒细胞减少症、贫血和血小板减少症³⁷，我们检测了DAC给药对小鼠外周血的影响。分别在给药结束后的第28天和停药27天后的恢复期（第55天）采集样本。结果显示，DAC可显著降低中性粒细胞、红细胞、血小板及其他多种血细胞成分的数量，而GSK3685032（1或5 mg kg⁻¹）尽管达到相似的DNA低甲基化和肿瘤生长抑制效果，却未观察到显著变化（图8g和扩展数据图8a,b）。虽然较高剂量的 GSK3685032 显示出中性粒细胞和红细胞数量的减少，但其作用强度仍明显低于 DAC，尽管这些剂量显示出更显著的 DNA 低甲基化和肿瘤生长抑制/消退。重要的是，在停药 4 周后重新评估时，所有接受 GSK3685032 治疗的动物的血液参数均恢复正常（扩展数据图 8c）[2]。

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(R)-GSK-3685032 的具体体内数据尚不详述；然而，该化合物被描述为可诱导 DNA 甲基化丢失并抑制癌细胞生长。作为一种 DNMT1 抑制剂，预计它在多种癌症的小鼠异种移植模型中均显示出疗效，包括血液系统恶性肿瘤（白血病、淋巴瘤）和实体瘤。典型的实验方案包括每日口服或腹腔注射给药，持续 2-4 周，并检测肿瘤生长抑制情况和肿瘤组织中的整体 DNA 甲基化水平。

荧光耦合断续光检测法[1]。使用半甲基化发夹寡核苷酸检测DNMTs的活性，方法如前所述³⁹。最终检测浓度为125 nM DNA寡核苷酸，分别与以下化合物混合：(1) 40 nM全长DNMT1，2 μM SAM；(2) 600 nM DNMT3A/3L，2.5 μM SAM；或(3) 300 nM DNMT3B/3L，0.15 μM SAM。DNMT1的反应在40分钟（26 °C）后终止，DNMT3A/3L和DNMT3B/3L的反应在120分钟（37 °C）后终止。化合物（10个浓度点，三倍系列稀释，100%二甲基亚砜）预先印制在黑色反应板（最终二甲基亚砜浓度为2%）上。通过用 1:4 比例的全甲基化/半甲基化发夹寡核苷酸（5ʹ-FAM-ATCTAG5me-dCG5me-dCATCAGTTTTCTGATG5me-dCG5me-dCTAGAT-Dabcyl-3ʹ 和 5ʹ-FAM-ATCTAGCG5me-dCATCAGTTTTCTGATG5me-dCG5me-dCTAGAT-Dabcyl-3ʹ，由 ATDBio 定制合成）代替 DNMT 反应，进行 Gla1 反向筛选。在可逆性研究中，将 DNMT1 与化合物（10× IC50）预孵育 20 分钟后，加入底物，将复合物快速稀释 100 倍。通过在稀释后不同时间点进行淬灭，评估 DNMT1 活性在 70 分钟内的恢复情况。数据拟合到 Ariazi 等人所述的固定稳态速度方程。

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DNMT1 生化检测采用甲基转移酶活性测定法。将重组人 DNMT1 与半甲基化 DNA 底物（含 CpG 位点）和甲基供体 S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 在测定缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.8，1 mM EDTA，2 mM DTT，0.1 mg/mL BSA）中孵育。加入不同浓度的 (R)-GSK-3685032，并在 37℃ 下反应 60-120 分钟。使用放射性 (3H-SAM) 或荧光检测方法（例如，使用特异性抗 5-甲基胞嘧啶抗体进行 ELISA 检测）测定 DNA 底物中甲基的掺入情况。IC50 值由剂量反应曲线计算得出。

在癌细胞系（例如白血病、乳腺癌、结肠癌）中进行细胞DNA甲基化和基因表达分析。将细胞接种于6孔板中，并用不同浓度的(R)-GSK-3685032（0.01-10 uM）处理3-6天（每2-3天更换一次培养基）。处理后，提取基因组DNA，并通过以下方法检测整体DNA甲基化水平：（1）使用亚硫酸氢盐测序或焦磷酸测序进行LINE-1甲基化分析；（2）基于ELISA的5-甲基胞嘧啶定量；或（3）甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）。对于基因表达分析，提取mRNA，并通过qRT-PCR检测抑癌基因（例如p16INK4a、MLH1、SFRP1）的表达。使用CellTiter-Glo或MTT法评估细胞活力。

GSK-3685032 或赋形剂（10% Captisol，用 1 M 乙酸调节 pH 至 4.5–5，4 °C 下保存最多 1 周）皮下注射，每日两次，每次剂量为 10 ml/kg（每 20 g 体重 0.2 ml）。DAC（Sun Pharmaceutical Industries）腹腔注射，每周三次，每次剂量为 10 ml/kg。 DAC 使用适量的厂家稀释剂（10 ml 水中含 68 mg 磷酸二氢钾和 11.6 mg 氢氧化钠）进行复溶，配制成浓度为 0.04 mg ml⁻¹ 的给药溶液，并在给药前立即使用（最终剂量为 0.4 mg kg⁻¹）。[1]

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在查尔斯河实验室，研究人员评估了 GSK-3685032 在雌性 NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl 小鼠 MV4-11 人系统性 AML 模型中的疗效。为了清除骨髓，在尾静脉注射 MV4-11 细胞前 3 天，对 10 周龄的小鼠进行环磷酰胺（150 mg kg⁻¹）给药。植入后 21 天，根据体重和给药剂量进行随机分组。本研究共纳入70只动物（每组10只），在30个研究日内进行给药。GSK-3685032或赋形剂每日皮下注射两次，DAC每周腹腔注射两次。每周测量三次体重。若单次观察到体重下降超过30%，或连续两次体重下降超过25%，则对动物实施安乐死。出现与肿瘤进展相关的临床症状，例如后肢功能障碍或眼球突出，也会导致安乐死。研究终点为76天。[1]

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在未经处理的动物（每组3只小鼠，共9只）中进行了一项独立的药代动力学研究。小鼠分别接受单次静脉注射或皮下注射2 mg kg⁻¹（静脉注射，雄性CD-1小鼠）、2 mg kg⁻¹（皮下注射，雄性C57/BL6小鼠）或30 mg kg⁻¹（皮下注射，雌性Nu/Nu小鼠）的GSK-3685032，并在给药后24小时内采集混合血样。采用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定血药浓度，并使用Phoenix WinNonlin v.6.3（Certara）软件，通过非房室模型分析，根据平均血药浓度-时间曲线估算药代动力学参数。血药浓度-时间曲线下面积（AUC）的计算方法为：对于每个递增的梯形，直至达到最大浓度（Cmax）；对于之后的每个梯形，则采用线性或对数插值法。剂量归一化曲线下面积 (AUC) 的计算方法是将 AUC0–8 h 除以剂量。[1]

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在异种移植小鼠癌症模型中评估体内疗效。典型的实验方案使用白血病或结肠癌细胞系。将癌细胞皮下注射到雌性免疫缺陷小鼠体内。当肿瘤体积达到约 100-150 mm³ 时，将小鼠随机分组。(R)-GSK-3685032 通过灌胃或腹腔注射每日给药，持续 2-4 周。每周两次使用游标卡尺测量肿瘤体积。实验结束后，收集肿瘤组织进行 DNA 甲基化分析（通过亚硫酸氢盐测序或液相色谱-质谱联用）和组织病理学分析。同时采集血样进行药代动力学分析。

(R)-GSK-3685032 的具体药代动力学参数尚未公布。该化合物是一种小分子 DNMT1 抑制剂（分子量 420.53），设计用于口服给药。关键的药代动力学特性，例如生物利用度、半衰期和组织分布，需要通过实验测定。该化合物可溶于 DMSO（60 mg/mL），可使用合适的溶剂（例如 10% DMSO/90% 玉米油或 PEG400）制备体内制剂。

(R)-GSK-3685032 的具体毒理学数据尚不详述。作为一种 DNMT1 抑制剂，其作用机制涉及诱导整体 DNA 低甲基化和重新激活沉默基因，这可能导致脱靶效应，包括激活癌基因或转座元件。然而，与地西他滨等共价核苷类似物相比，该化合物的可逆性非共价作用机制可能具有更佳的安全性，后者会引起显著的细胞毒性和骨髓抑制。动物研究将评估标准的毒理学终点指标（体重、血液学、器官组织病理学）。

[1]. Substituted pyridines as inhibitors of DNMT1 and their preparation. WO2017216727A1.

[2]. Discovery of a first-in-class reversible DNMT1-selective inhibitor with improved tolerability and efficacy in acute myeloid leukemia. Nat Cancer. 2021;2(10):1002-1017.

DNA甲基化是转录沉默的关键表观遗传驱动因素，并在癌症中异常调控。使用去甲基化药物（例如胞苷类似物地西他滨或阿扎胞苷）逆转DNA甲基化已在血液系统恶性肿瘤中显示出临床疗效。这些核苷类似物可掺入复制中的DNA，并通过不可逆的共价相互作用抑制DNA胞嘧啶甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。这些药物对正常血细胞具有显著毒性，因此限制了其临床剂量。本文报道了GSK3685032的发现，它是一种高效的首创选择性DNMT1抑制剂。晶体学研究表明，GSK3685032与DNMT1的活性位点环竞争结合两个CpG碱基对之间的半甲基化DNA区域。 GSK3685032 在体外可显著降低 DNA 甲基化水平，激活转录，并抑制癌细胞生长。与地西他滨相比，GSK3685032 具有更好的体内耐受性，因此在急性髓系白血病小鼠模型中能取得更好的肿瘤消退和生存效果。[2]

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(R)-GSK-3685032 是一种用于研究 DNMT1 在表观遗传学和癌症中功能的研究级化学工具。DNMT1 是维持 DNA 甲基化模式的关键酶，抑制 DNMT1 可导致抑癌基因的重新激活。与掺入 DNA 并引起细胞毒性的核苷类似物 DNMT 抑制剂（例如地西他滨、阿扎胞苷）不同，(R)-GSK-3685032 是一种非共价、可逆抑制剂，可能具有独特的作用机制和安全性。截至最新信息，该化合物尚未获准用于临床，目前仅供临床前研究使用。

C22H24N6OS

420.53

420.173

C, 62.83; H, 5.75; N, 19.98; O, 3.80; S, 7.62

2170140-50-6

GSK-3685032;2170137-61-6;(S)-GSK-3685032;2170142-58-0

132233544

White to off-white solid powder

2.6

158

2

7

6

30

684

1

C(C1C(=C(C#N)C(S[C@H](C2C=CC=CC=2)C(=O)N)=NC=1N1CCC(N)CC1)CC)#N

KNKHRZYILDZLRE-LJQANCHMSA-N

InChI=1S/C22H24N6OS/c1-2-16-17(12-23)21(28-10-8-15(25)9-11-28)27-22(18(16)13-24)30-19(20(26)29)14-6-4-3-5-7-14/h3-7,15,19H,2,8-11,25H2,1H3,(H2,26,29)/t19-/m1/s1

(2R)-2-[6-(4-aminopiperidin-1-yl)-3,5-dicyano-4-ethylpyridin-2-yl]sulfanyl-2-phenylacetamide

(R)-GSK-3685032; 2170140-50-6; R-GSK3685032; (2R)-2-{[6-(4-aminopiperidin-1-yl)-3,5-dicyano-4-ethylpyridin-2-yl]sulfanyl}-2-phenylacetamide; SCHEMBL19717300; BDBM491438; US10975056, Example 412;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~60 mg/mL (~142.68 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。