The target of LYN-1604 HCl is UNC-51-like kinase 1 (ULK1); the EC₅₀ value for activating ULK1 kinase activity was calculated from the fitted curve of ULK1 kinase activity via ADP-Glo assay, and the key amino acid residues involved in the binding between LYN-1604 HCl and ULK1 are LYS50, LEU53, and TYR89. [1]

LYN-1604 有潜力成为 ULK1 激动剂（100 nM 时酶活性 = 195.7%，针对 MDA-MB-231 细胞的 IC50 = 1.66 μM）[1]。 LYN-1604 具有纳摩尔范围内的结合亲和力 (KD=291.4 nM)，可与野生型 ULK1 结合 [1]。在 MDA-MB-231 细胞上，LYN-1604（0.5、1.0 和 2.0 μM）通过 ULK 复合物导致细胞死亡[1].. 小时）显着增加 Beclin-1 表达，降解 p62，并导致 LC3-I在 MDA-MB-231 细胞中变成 LC3-II[1]。通过 ULK 复合物，LYN-1604 触发 ATG5 依赖性自噬[1]。此外，LYN-1604 能够触发细胞凋亡和促进 caspase3 裂解[1]。

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1. 激活ULK1激酶活性：LYN-1604 HCl通过疏水相互作用结合ULK1的激酶结构域，呈剂量依赖性增强ULK1激酶活性。定点突变实验显示，ULK1的LYS50、LEU53或TYR89残基发生突变后，LYN-1604 HCl对ULK1的激活作用完全消失。体外磷酸化实验证实，LYN-1604 HCl可促进ULK1下游底物mATG13在Ser318位点的磷酸化，而该促进作用在突变型ULK1（K50A、L53A、Y89A）中消失。表面等离子体共振（SPR）实验验证了LYN-1604 HCl与野生型ULK1的特异性结合亲和力，且在突变型ULK1中结合亲和力显著降低[1]
2. 诱导MDA-MB-231细胞自噬：
- 用LYN-1604 HCl（0.5μM、1.0μM、2.0μM）处理MDA-MB-231细胞，MDC染色结合荧光显微镜和流式细胞术检测显示，MDC阳性自噬小体数量及MDC阳性细胞比例呈剂量依赖性增加[1]
- 蛋白质印迹（western blot）分析表明，不同浓度LYN-1604 HCl处理24h后，自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-II（由LC3-I转化而来）的表达呈浓度依赖性上调，自噬底物p62的表达呈浓度依赖性下调[1]
- 转染GFP/mRFP-LC3质粒的MDA-MB-231细胞，经2.0μM LYN-1604 HCl单独处理或与10nM巴弗洛霉素A₁（BafA1，自噬流抑制剂）联合处理后，荧光显微镜观察显示，LYN-1604 HCl可增加GFP-LC3斑点数量，且与BafA1联合处理时斑点数量进一步增加，表明LYN-1604 HCl可增强自噬流[1]
3. 抑制细胞活力并诱导凋亡：
- MTT实验显示，LYN-1604 HCl可抑制MDA-MB-231细胞活力（IC₅₀值通过Prism 6.0计算得出）。在LYN-1604 HCl（2.0μM）处理前1h加入1mM 3-甲基腺嘌呤（3-MA，自噬抑制剂）预处理，可显著逆转LYN-1604 HCl诱导的细胞活力下降（p<0.001），证实LYN-1604 HCl诱导自噬依赖性细胞死亡[1]
- Annexin-V/PI双染色流式细胞术显示，LYN-1604 HCl（2.0μM）呈时间依赖性诱导MDA-MB-231细胞凋亡。Western blot分析显示，LYN-1604 HCl处理可导致凋亡关键标志物caspase3和PARP发生剪切，且该剪切作用可被ULK1沉默部分逆转[1]
4. 调控ULK复合物及下游信号分子：
- 免疫细胞化学和western blot分析显示，LYN-1604 HCl（2.0μM）可上调ULK1在Ser317位点的磷酸化水平，并增加ULK复合物组分（ULK1、mATG13、FIP200、ATG101）的表达[1]
- 经siRNA沉默ULK1或ATG5后，LYN-1604 HCl诱导的LC3转化及p62降解被完全阻断，且LYN-1604 HCl诱导的细胞活力下降被显著逆转，证实LYN-1604 HCl通过ULK复合物诱导ATG5依赖性自噬[1]
- 比较芯片分析鉴定ATF3、RAD21和caspase3为潜在的ULK1相互作用分子，western blot验证显示，LYN-1604 HCl可上调ATF3和剪切型caspase3的表达，下调RAD21的表达，且这些调控作用可被ULK1沉默所消除[1]

针对 ULK1 调节的细胞死亡，LYN-1604（低剂量：25 mg/kg；中剂量：50 mg/kg；高剂量：100 mg/kg）是一种胃内药物，每日一次，持续 14 天，可减少细胞的生长。异种移植TNBC [1]。

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1. 三阴性乳腺癌（TNBC）异种移植模型中的抗肿瘤活性：接种MDA-MB-231异种移植瘤的裸鼠（每组6只）接受LYN-1604 HCl或溶媒处理，与溶媒组相比，LYN-1604 HCl显著降低肿瘤体积和肿瘤重量（p<0.001，p<0.05）[1]
2. 调控肿瘤组织中自噬和凋亡相关蛋白：
- 肿瘤组织免疫组织化学显示，LYN-1604 HCl处理组p-ULK1（Ser317）阳性率显著高于溶媒组（p<0.001）[1]
- 肿瘤组织western blot分析显示，LYN-1604 HCl可上调ULK1、p-ULK1（Ser317）、LC3-II、Beclin-1的表达，并促进PARP剪切，与体外对自噬和凋亡的调控效应一致[1]
3. 体内安全性：治疗期间，LYN-1604 HCl处理组与溶媒组小鼠的相对体重、肝指数、脾指数、肾指数无显著差异，表明LYN-1604 HCl体内耐受性良好[1]

1. ULK1激酶活性实验（ADP-Glo实验）：
- 将纯化的野生型或突变型ULK1激酶与不同浓度的LYN-1604 HCl在反应缓冲液中孵育，特定孵育时间后加入ADP-Glo试剂终止激酶反应并将生成的ADP转化为ATP，随后加入发光试剂，检测发光强度（RLU）以量化激酶活性。以无ULK1激酶的空白组为0%激酶活性，无LYN-1604 HCl的对照组为100%激酶活性，通过标准化激酶活性的剂量-反应曲线拟合计算LYN-1604 HCl激活ULK1的EC₅₀值[1]
2. 体外ULK1底物磷酸化实验：
- 从HEK-293T细胞中表达并纯化野生型或突变型ULK1（K50A、L53A、Y89A），以纯化的mATG13蛋白为底物，在有无LYN-1604 HCl存在的条件下进行磷酸化反应。反应结束后，使用抗磷酸化mATG13（Ser318）特异性抗体进行western blot分析，检测mATG13的磷酸化水平；同时使用ULK1和mATG13对应抗体进行western blot，验证酶（ULK1）和底物（mATG13）的上样量是否一致[1]
3. 表面等离子体共振（SPR）结合实验：
- 将野生型或突变型ULK1蛋白固定在Biacore传感器芯片上，将不同浓度的LYN-1604 HCl溶液以恒定流速注入芯片通道，实时记录SPR信号（响应单位，RU）以获得结合曲线，使用Biacore评估软件对结合曲线进行拟合，计算LYN-1604 HCl与ULK1的结合亲和力（KD值）[1]
4. ULK1-LYN-1604 HCl结合的分子动力学模拟：
- 基于ULK1的晶体结构构建LYN-1604 HCl与野生型/突变型ULK1的初始结合模型，在生理条件下使用模拟软件进行10ns分子动力学模拟。通过分析蛋白-配体复合物的根均方偏差（RMSD）评估结合构象的稳定性，结果显示，10ns模拟后，LYN-1604 HCl与野生型ULK1及K50A/L53A突变型ULK1的结合构象稳定，而与Y89A突变型ULK1的结合构象不稳定[1]

细胞活力测定[1]
细胞类型： MDA-MB-231 细胞
测试浓度： 0.5、1.0 和 2.0 μM
孵育时间：
实验结果：诱导细胞死亡。自噬比率以剂量依赖性方式增加。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： MDA-MB-231 细胞
测试浓度： 0、0.5、1、和 2 μM
孵育时间： 24 小时
实验结果： 诱导 Beclin-1 显着上调和 p62 降解作为 LC3-I 到 LC3-II 的转化。

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1. 细胞活力实验（MTT实验）：
- 将MDA-MB-231细胞以一定密度接种于96孔板，过夜培养后，向孔中加入不同浓度的LYN-1604 HCl溶液，每个浓度设3个复孔；自噬抑制组在LYN-1604 HCl处理前1h加入1mM 3-MA。孵育24h后，每孔加入MTT试剂并孵育4h，使用酶标仪检测490nm处吸光度，以无LYN-1604 HCl的对照组吸光度为参照，计算细胞活力（处理组吸光度/对照组吸光度×100%）。根据细胞活力的剂量-反应曲线，使用Prism 6.0软件计算IC₅₀值[1]
2. 自噬小体检测（MDC染色）：
- 将MDA-MB-231细胞接种于盖玻片或6孔板中，用LYN-1604 HCl（0.5μM、1.0μM、2.0μM）处理24h。PBS洗涤后，加入MDC染色液，37°C孵育30min。荧光显微镜观察组：将盖玻片上的细胞用抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下拍摄图像，计数MDC阳性自噬小体数量；流式细胞术分析组：将6孔板中的细胞消化后用PBS重悬，通过流式细胞仪检测MDC阳性细胞比例[1]
3. 自噬流实验：
- 使用转染试剂将GFP/mRFP-LC3质粒转染至MDA-MB-231细胞，转染24h后，用2.0μM LYN-1604 HCl单独处理或与10nM BafA1联合处理细胞。处理24h后固定细胞，在共聚焦荧光显微镜下观察GFP-LC3斑点的分布情况，分析自噬小体的积累情况；同时通过western blot检测细胞中p62和LC3的表达水平，评估LYN-1604 HCl对自噬流的影响[1]
4. 蛋白质表达western blot分析：
- 用指定浓度和时间的LYN-1604 HCl处理MDA-MB-231细胞，或转染siRNA（对照、ULK1、ATG5）后再用LYN-1604 HCl处理，用RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭后，加入抗ULK1、p-ULK1（Ser317/Ser757）、mATG13、FIP200、ATG101、ATG5、Beclin-1、p62、LC3、caspase3、PARP、ATF3、RAD21及β-肌动蛋白（内参）的一抗，4°C孵育过夜。洗涤后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1h。使用ECL化学发光试剂盒显影蛋白条带，ImageJ软件定量条带灰度值[1]
5. 免疫细胞化学实验：
- 将MDA-MB-231细胞接种于盖玻片，用2.0μM LYN-1604 HCl处理24h，或转染对照/siULK1后再用LYN-1604 HCl处理。用4%多聚甲醛固定细胞，0.1% Triton X-100透化，5% BSA封闭。加入抗p-ULK1（Ser317）或LC3B一抗，4°C孵育过夜；洗涤后加入TRITC标记（p-ULK1）或FITC标记（LC3B）的二抗，室温孵育1h；DAPI染核后封片，在荧光显微镜下观察蛋白表达与分布情况，计数每细胞LC3B斑点数量以评估自噬水平[1]
6. 凋亡实验（Annexin-V/PI双染色）：
- 用2.0μM LYN-1604 HCl处理MDA-MB-231细胞不同时间（0h、12h、24h、48h），自噬抑制组在LYN-1604 HCl处理前1h加入1mM 3-MA。用无EDTA的胰酶消化细胞，冷PBS洗涤后重悬于结合缓冲液，依次加入Annexin-V-FITC和PI染色液，避光孵育15min，通过流式细胞仪检测凋亡比例（早期凋亡：Annexin-V阳性/PI阴性；晚期凋亡：Annexin-V阳性/PI阳性）[1]
7. siRNA转染实验：
- 将MDA-MB-231细胞接种于6孔板，培养至融合度达50%-60%时，按照说明书使用转染试剂将对照siRNA、ULK1 siRNA或ATG5 siRNA转染至细胞。转染48h后，用2.0μM LYN-1604 HCl处理细胞24h。通过western blot检测ULK1/ATG5的沉默效率及自噬/凋亡相关蛋白的表达；通过免疫细胞化学（LC3B斑点）观察siRNA转染对LYN-1604 HCl诱导自噬的影响；通过MTT实验检测siRNA转染对细胞活力的影响[1]
8. ULK1调控基因芯片分析：
- 将MDA-MB-231细胞分为对照组、ULK1 siRNA转染组和pcDNA3.1-ULK1过表达组，转染48h后，用Trizol试剂提取细胞总RNA，通过NanoDrop分光光度计和琼脂糖凝胶电泳验证RNA质量与完整性。对RNA进行标记后与基因表达芯片杂交，以|log2倍变化|>1且p<0.05为标准筛选差异表达基因（DEGs），筛选出ULK1沉默组与过表达组中表达趋势相反的DEGs作为核心ULK1调控基因。从中选取ATF3、RAD21和caspase3，通过western blot验证其是否受ULK1及LYN-1604 HCl调控[1]

动物/疾病模型： 24只雌性裸鼠（BALB/c，6-8周龄，20-22克）[1]
剂量： 低剂量，25毫克/千克；中剂量，50毫克/千克；高剂量，100毫克/千克
给药途径： 灌胃（po）给药；每日一次，连续14天
实验结果： 显著抑制异种移植MDA-MB-231细胞的生长。小鼠体重稳定。实验结束时，部分组小鼠的肝脏和脾脏重量指数略有增加，而所有剂量组的肾脏重量指数均未受到影响。

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1. TNBC异种移植模型的建立：
- 收集处于对数生长期的MDA-MB-231细胞，并将其重悬于无血清培养基和Matrigel（体积比1:1）的混合液中，最终浓度为5×10⁶个细胞/mL。使用4-6周龄的雌性裸鼠，将0.2mL细胞悬液皮下注射到每只小鼠的右侧腹部。小鼠在SPF级条件下饲养，每3天用游标卡尺测量一次肿瘤体积。当肿瘤体积达到约100mm³时，将小鼠随机分为载体组和LYN-1604 HCl治疗组（每组n=6）[1]
2. 给药和样本采集：
- 将LYN-1604 HCl溶解于合适的载体中（文献中未明确说明具体溶剂），配制成不同剂量的药物溶液。通过未指明的给药途径（文献中未明确说明给药途径）以一定的频率（未明确说明给药频率）给小鼠给药，总疗程为21天。治疗期间，每3天测量一次小鼠体重，以监测其一般状况。治疗结束后，采用颈椎脱臼法处死小鼠。切除肿瘤并称重，肿瘤体积按以下公式计算：肿瘤体积 = 长 × 宽² / 2。同时切除肝脏、脾脏和肾脏并称重，计算器官指数（器官重量/体重 × 100%）。部分肿瘤组织用4%多聚甲醛固定用于免疫组织化学染色，剩余部分保存于-80℃用于Western blot分析[1]。
3. 肿瘤组织的免疫组织化学染色：
- 将多聚甲醛固定的肿瘤组织脱水，石蜡包埋，切成4μm厚的切片。切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水。采用柠檬酸缓冲液煮沸进行抗原修复。切片用3% H₂O₂封闭以消除内源性过氧化物酶活性，然后用5% BSA封闭。加入针对 p-ULK1 (Ser317) 的一抗，于 4°C 孵育过夜。洗涤后，加入生物素标记的二抗，于室温孵育 1 小时。随后，将切片与链霉亲和素-过氧化物酶复合物孵育，并使用 DAB 显色试剂盒显色。切片经苏木精复染、脱水、透明和封片后，使用 Image-Pro Plus 软件 [1] 计数 10 个随机高倍视野（×100 倍）中的阳性细胞数，从而定量 p-ULK1 的阳性率。

1. 体外毒性：MTS 试验表明，在测试浓度下，LYN-1604 HCl 仅抑制 MDA-MB-231 细胞（肿瘤细胞）的活力，而不影响正常细胞的活力（文献未提及具体的正常细胞类型）[1]
2. 体内毒性：LYN-1604 HCl 处理后，治疗组与对照组的相对体重、肝脏指数、脾脏指数和肾脏指数均无显著差异。肝脏、脾脏和肾脏组织未观察到明显的病理变化（文献未提供详细的病理切片结果），表明在测试剂量下，LYN-1604 HCl 对小鼠主要器官无明显的急性毒性。[1]

[1]. Discovery of a small molecule targeting ULK1-modulated cell death of triple negative breast cancer in vitro and in vivo. Chem Sci. 2017 Apr 1;8(4):2687-2701.

1. 背景信息：ULK1 是一种启动自噬的关键调控蛋白。TCGA 数据库分析和组织芯片 (TMA) 分析表明，ULK1 在乳腺癌组织中表达显著下调，尤其是在三阴性乳腺癌 (TNBC) 组织中。这种下调导致肿瘤细胞自噬功能受损，从而促进肿瘤进展。因此，激活 ULK1 调控的自噬被认为是 TNBC 的一种潜在治疗策略 [1]。
2. 作用机制：LYN-1604 HCl 是一种 ULK1 特异性激动剂。它通过 LYS50、LEU53 和 TYR89 残基与 ULK1 结合，激活 ULK1 激酶活性，进而促进 ULK 复合物 (ULK1-mATG13-FIP200-ATG101) 的形成。活化的ULK复合物诱导ATG5依赖性自噬，导致肿瘤细胞自噬性死亡。同时，LYN-1604 HCl通过ULK1调节ATF3、RAD21和caspase3的表达，并通过激活caspase3-PARP信号通路促进肿瘤细胞凋亡。因此，LYN-1604 HCl通过诱导TNBC细胞的自噬和凋亡发挥抗肿瘤作用[1]。
3. 治疗潜力：LYN-1604 HCl在体外MDA-MB-231细胞模型和体内TNBC异种移植模型中均显示出显著的抗肿瘤活性，且具有良好的体内耐受性。它是一种潜在的用于治疗三阴性乳腺癌的小分子候选药物[1]
4. 化学结构：文献中的LYN-1604 HCl化学结构如图5A所示，它属于靶向ULK1的小分子化合物[1]

C₃₃H₄₄CL₃N₃O₂

621.08

619.249

C, 63.82; H, 7.14; Cl, 17.12; N, 6.77; O, 5.15

2216753-86-3

LYN-1604 dihydrochloride;2310109-38-5;LYN-1604;2088939-99-3

131801112

White to off-white solid powder

36

1

4

12

41

750

0

ClC1C=C(C=CC=1C(CN1CCN(C(CN(CC(C)C)CC(C)C)=O)CC1)OCC1C=CC2C=CC=CC=2C=1)Cl.Cl

KWFDUNOLEJSFBQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C33H43Cl2N3O2.ClH/c1-24(2)19-37(20-25(3)4)22-33(39)38-15-13-36(14-16-38)21-32(30-12-11-29(34)18-31(30)35)40-23-26-9-10-27-7-5-6-8-28(27)17-26;/h5-12,17-18,24-25,32H,13-16,19-23H2,1-4H3;1H

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.03 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.03 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.03 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。