ML329

Micropthalmia-associated transcription factor (MITF) (IC50 = 1.2 μM)

小眼相关转录因子 (MITF) 的许多靶基因被 ML329 抑制，这也阻止了许多依赖 MITF 的细胞系的生长。 MITF 或 MITF 监管网络的其他要素可能会直接或间接与 ML329 接触。由于 MITF 是控制色素沉着和细胞周期的转录因子，干扰 ML329 将有助于确定 MITF 在黑色素瘤中的精确功能，并确认阻断 MITF 功能可能是一种可行的黑色素瘤治疗方法。虽然 ML329 对 A375 细胞的活力没有影响，但它对依赖 MITF 的原代黑素细胞表现出特殊的活性。 ML329 抑制多种 MITF 靶基因的表达，包括与色素沉着和细胞周期调节因子 CDK2 相关的基因。作为一种工具化学品，ML329 将有助于阐明 MITF 如何在黑色素细胞谱系的建立和黑色素瘤疾病的进展中发挥作用[1]。

母乳菌株对宫内生长迟缓大鼠肠道形态的影响[2]
如图1a所示，喂食ML-446的IUGR新生大鼠的肠道比空白对照组长（p<0.01）。同时，喂食ML-446的幼崽肠道长度明显长于鼠李糖乳杆菌GG组（p<0.05）。喂食ML-446的IUGR新生大鼠的肠道重量明显重于空白对照组（p<0.01）。这些结果表明，母乳中的ML-446促进了IUGR新生大鼠的肠道生长。为了获得宫内生长迟缓新生大鼠肠道发育的更多信息，测量了宫内生长迟缓新生儿大鼠空肠、回肠和结肠的绒毛高度。在空肠中，喂食ML-446的大鼠幼崽的绒毛高度比空白对照组长（p<0.01）（图1b）。同时，在回肠中，ML-446喂养的幼崽的绒毛高度极显著长于空白对照组（p<0.01）（图1b）。在回肠和结肠中，与空白对照组和鼠李糖乳杆菌GG组相比，ML-329显示IUGR大鼠幼崽的绒毛高度显著增加（p<0.01）（图1b）。总的来说，ML-446和ML-329在肠道发育方面表现出更好的潜在作用，尤其是与鼠李糖乳杆菌GG相比。

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母乳菌株在肠道中的定殖能力[2]
为了进一步确认母乳来源的ML‐329和ML-446在肠道中的定植，IUGR新生大鼠服用了CFDASE标记的鼠李糖乳杆菌GG、ML‐329和ML446。通过使用IVIS Spectrum体内成像系统确定口服细菌后CFDASE信号的分布。如落射荧光图像所示（图2），在整个空肠、回肠和结肠中检测到所有三种菌株的荧光信号，表明所有菌株都有在肠道定植的能力。在空肠中，与ML-446和ML-329相比，使用CFDASE（Solarbio）标记的鼠李糖乳杆菌GG时观察到的荧光信号更多。在回肠中，ML-329的荧光信号高于ML-446。在结肠中，所有组都出现了高荧光信号。一般来说，这两种来自母乳的菌株具有在空肠、回肠和结肠定植的能力。

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母乳中的细菌对肠上皮细胞增殖的影响[2]
为了进一步研究ML-329和ML-446菌株如何改善肠道发育，使用使用ki67抗体免疫染色的肠道组织切片检查了肠上皮细胞的增殖。对于细胞增殖的标志物ki67，口服ML-329期间，空肠和结肠中ki67的表达明显高于空白对照组（p<0.01）。此外，与空白对照组相比，ML-446治疗组回肠和结肠中ki67的平均密度显著增加（p<0.01）（图3）。

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母乳中的细菌对肠上皮细胞分化的影响[2]
如图4a、b所示，用两种菌株处理的IUGR新生大鼠与空白对照组在空肠杯状细胞数量上没有显著差异。但经ML‐329（p<0.01）和ML-446（p<0.05）处理的大鼠回肠杯状细胞数量显著增加。同时，与空白对照组相比，ML‐329和ML-446治疗组的杯状细胞数量在结肠中显著增加（p<0.05）。此外，与空白对照组相比，用ML-446和ML-329治疗的IUGR新生大鼠空肠中溶菌酶的平均密度显著增加（p<0.01）（图4c，d）。此外，与鼠李糖乳杆菌GG相比，ML-446治疗的IUGR新生大鼠空肠中溶菌酶的平均密度显著增加（p<0.05）（图4d）。同时，与鼠李糖乳杆菌GG和空白对照组大鼠相比，ML-329处理的大鼠回肠中溶菌酶的表达显著增加（p<0.01）（图4d）。这些结果表明，用ML-446和ML-329治疗IUGR新生大鼠可促进肠道杯状细胞和Paneth细胞的分化，并显示出潜在的肠道发育调节能力。

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母乳中的细菌对Wnt和Notch信号通路表达和活性的影响[2]
为了进一步阐明母乳来源的ML-446和ML-329促进肠道发育的机制，通过RT-PCR和western blot检测了Wnt和Notch信号通路中蛋白质的表达和活性，这些蛋白质在驱动肠上皮细胞增殖和分化中起着重要作用。[2]
在空肠和结肠中，与空白对照组同时治疗的ML-446上调了lrp5基因的表达（p<0.05）（图5a）。在回肠中，与空白对照组相比，当用ML-329和ML-446治疗时，wnt的表达上调（p<0.05）（图5b）。与空白对照组相比，经ML-329和ML-446处理的空肠中β-catenin基因表达显著上调（p<0.05）（图5c）。在回肠中，与空白对照组相比，ML-446组的β-catenin基因表达也显著增加（p<0.05）（图5c）。相应地，免疫印迹分析显示，与空白对照组相比，用ML-329和ML-446治疗的回肠中β-catenin蛋白的丰度显著增加（p<0.05）（图5d，e）。相应地，免疫印迹分析显示，与空白对照组相比，用ML-329和ML-446治疗的肠道中调节Wnt信号通路的关键蛋白β-catenin的丰度显著增加（p<0.05）（图5d，e）。[2]
研究了ML-329和ML-446灌胃大鼠notch基因的表达和活化notch蛋白的丰度。与空白对照组相比，ML-446治疗的大鼠结肠中notch基因的表达下调（p<0.05）（图5f）。同时，与空白对照组相比，ML‐329和ML-446中活化缺口蛋白在空肠、回肠和结肠中的丰度较低（p<0.05）。

测试ML329在PBS/1%DMSO（图1A）、人血清和小鼠血清中的稳定性。还测试了ML329的溶解度和GSH/DTT加合物的形成（图1B/1C）。所有结果表明，ML329在PBS/1%DMSO、GSH/DTT加合物测定和不同血清中非常稳定。附录D[1]提供了分析测定的实验程序。

SK-MEL-5 TRPM-1萤光素酶报告物测定（初步测定AID编号：AID 493177、AID 493073、AID 493102、AID 540348、AID 624290、AID 624259、AID 624316、AID 624363、AID 624440、AID 625426、AID 624430、AID 651588、AID 651753）[1]
将TRPM1荧光素酶启动子构建体转染到SK-MEL-5黑色素瘤细胞系中，并产生稳定的细胞系。该启动子对MITF过表达和抑制非常敏感，在克隆的启动子片段中含有三个典型的E-box基序（17）。在第0天，以每孔2000个细胞的速度将细胞铺在无酚红培养基中的白色不透明384孔板上。在第1天，用化合物或阳性对照处理细胞24小时。在第2天，每孔加入20uL SteadyGlo（Promega），用Perkin-Elmer EnVision平板阅读器测定发光信号。在Genedata Screener检测分析仪中分析了主要的HTS数据。所有值均已针对DMSO处理的样品和阳性对照（18μM孤雌内酯，CID 6473881）进行了标准化。对于HTS，使用两次重复的平均值对活性进行排序，并选择化合物进行重新测试。对于剂量研究，确定每种浓度的活性百分比（%），并使用Genedata Screener的Condoseo生成浓度反应曲线（CRC）。

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SK-MEL-5细胞毒性试验（SA 1：AID编号：AID 493240、AID 540347、AID 624289、AID 624315、AID 624366、AID 624427、AID 624499、AID 625428、AID 651586）[1]
SK-MEL-5细胞用化合物处理24小时，然后使用CellTiter Glo Assay测量细胞存活率，CellTiter Glo Assay是一种基于萤光素酶的试剂，用于测量细胞ATP水平。在不同浓度下测试化合物以确定IC50值。在初步测定中具有活性且在24小时内毒性低于30μM的化合物被考虑用于探针开发。在Genedata Screener的检测分析仪中，数据已针对DMSO进行了标准化处理。曲线是用Genedata Screener的Condoseo生成的，显示了各个剂量的活性百分比（%）。

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A-375细胞毒性试验（SA1:AID编号：AID 540335、AID 540346、AID 624489、AID 624324、AID 624364、AID 624 368、AID 62448、AID 624490、AID 62449、AID 651591）[1]
A375细胞用化合物处理24小时，然后使用CellTiter-Glo Assay测量细胞存活率，CellTiter-Glo Assay是一种基于萤光素酶的试剂，用于测量细胞ATP水平。在不同浓度下测试化合物以确定IC50值。在初步测定中具有活性且在24小时内低于30μM无毒的化合物被考虑用于探针开发。在Genedata Screener的检测分析仪中，数据已针对DMSO进行了标准化处理。曲线是用Genedata Screener的Condoseo生成的，显示了各个剂量的活性百分比（%）。

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MALME-3M细胞毒性试验（SA1:AID编号：AID 493191、AID 540339、AID 624299、AID 624362、AID 651584、AID 651575）[1]
MALME-3M细胞用化合物处理24小时，然后使用CellTiter Glo Assay测量细胞存活率，CellTiter Glo Assay是一种基于萤光素酶的试剂，用于测量细胞ATP水平。在不同浓度下测试化合物以确定IC50值。在初步测定中具有活性且在24小时内毒性低于30μM的化合物被考虑用于探针开发。在Genedata Screener的检测分析仪中，数据已针对DMSO进行了标准化处理。曲线是用Genedata Screener的Condoseo生成的，显示了各个剂量的活性百分比（%）。

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MITF表达的qPCR检测（SAI:AID 651773）[1]
SK-MEL-5细胞用化合物处理24小时。接下来，用DNase I裂解细胞。将裂解的细胞递送到RT-PCR板上，然后对板进行逆转录处理以产生cDNA。qPCR是通过将cDNA从RT-PCR板转移到含有PCR主混合物、靶基因（人MITF）的FAM-Taqman探针/引物组、管家基因（人GAPDH）的VIC-Taqman探头/引物组和水的qPCR板上进行的。使用实时PCR仪器循环qPCR板。使用仪器软件，当每口井进入对数相位放大（Ct）时，会生成一个循环调用。通过从每个孔中的靶基因（MITF）的Ct值中减去对照基因（GAPDH）的Cts值来确定ΔCt值。通过将每个板上的模拟孔的ΔCt值取平均值，并从每个化合物孔的ΔCt值中减去该平均值，来确定每种化合物处理的ΔΔCt价值。在不同浓度下测试化合物以确定IC50值。在Genedata Screener的检测分析仪中，数据已针对DMSO进行了标准化处理。曲线是用Genedata Screener的Condoseo生成的，显示了各个剂量的活性百分比（%）。

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TRPM1表达的qPCR检测（SAI:AID 651770）[1]
除了使用以下引物和探针外，方案与2.1.5相同：FAM-Taqman探针/靶基因（人TRPM1）引物组，VIC-Taqman引物/管家基因引物组。

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CDK2表达的qPCR检测（SAI:AID 651772）[1]
除了使用以下引物和探针外，方案与2.1.5相同：FAM-Taqman探针/靶基因（人CDK2）引物组，VIC-Taqman引物/管家基因引物组。

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DCT表达的qPCR检测（SAI:AID 651771）[1]
除了使用以下引物和探针外，方案与2.1.5相同：FAM-Taqman探针/靶基因（人类DCT）引物组，VIC-Taqman引物/管家基因引物组。

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MLANA表达的qPCR检测（SAI:AID 651795）[1]
方案与2.1.5相同，但使用了以下引物和探针：用于靶基因（人类MLANA）的FAM-Taqman探针/引物组，用于管家基因的VIC-Taqman引物/引物组。

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原代人黑素细胞增殖试验（SAI:AID 651920）[1]
通过温和的分散酶处理从丢弃的包皮中分离出原代人类新生儿黑素细胞，并在添加了7%FBS、青霉素/链霉素/谷氨酰胺、0.1 mM 1-甲基-3-（2-甲基丙基）-7H-嘌呤-2,6-二酮（IBMX）、50 ng/mL 12-十四酰佛波醇13-乙酸酯（TPA）、1μM Na3VO4和1μM N（6）、2′-O-二丁基腺苷3′：5′环单磷酸（dbcAMP）的Ham's F10培养基中生长。在384孔板上，以每孔4000个细胞的速度进行细胞铺板。第二天，每孔加入10nL化合物并孵育24小时。在不同浓度下测试化合物以确定IC50值。在化合物处理结束时，用CellTiter Glo测量细胞活力，用PerkinElmer EnVision平板读数器测量发光。在Genedata Screener的检测分析仪中，数据已针对DMSO进行了标准化处理。曲线是用Genedata Screener的Condoseo生成的，显示了各个剂量的活性百分比（%）。

动物处理和IUGR新生大鼠模型[2]
IUGR新生大鼠模型的建立方法如前所述（Ding et al., 2016），即通过限制母体营养来建立。简而言之，将单独饲养的妊娠大鼠随机分为正常饮食组和限制饮食组。正常饮食组的妊娠大鼠饲喂标准大鼠饲料和水，不限制摄入量（每日食物摄入量22-28 g）；限制饮食组的妊娠大鼠从妊娠第一天起，食物摄入量减少50%。分娩当天，两组大鼠均饲喂标准大鼠饲料和水。从限制饮食组的新生大鼠中，根据体重比正常饮食组低两个标准差的标准，筛选出IUGR模型大鼠。造模成功后，将所有IUGR新生大鼠随机分为四组，每组九只。空白对照组为母乳喂养并口服0.01 mol/L PBS，阳性对照组为母乳喂养并口服鼠李糖乳杆菌GG，其余各组分别为母乳喂养并口服ML-329和ML-446。IUGR大鼠于第1至10天灌胃100 μl PBS或等体积的PBS悬浮液（1 × 10⁷ CFU）中的菌株。

[1]. A Small Molecule Inhibitor of the MITF Molecular Pathway. Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program [Internet]. Bethesda (MD): National Center for Biotechnology Information (US); 2010-2012 Dec 13.

[2]. Lactobacillus derived from breast milk facilitates intestinal development in IUGR rats. J Appl Microbiol. 2022 Aug;133(2):503-514.

4-[(1,4-二氧代-2-萘基)氨基]苯磺酰胺属于1,4-萘醌类化合物。

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小眼畸形相关转录因子 (MITF) 是一种谱系限制性碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子，对黑素细胞的发育、功能和存活至关重要。15% 的人类黑色素瘤存在 MITF 基因扩增 (1)。此外，绝大多数黑色素瘤的存活依赖于 MITF。我们旨在寻找 MITF 活性的小分子抑制剂，以便更好地从分子层面表征 MITF 在黑色素瘤中的作用。我们使用 MITF 依赖性黑色素瘤细胞系 SK-MEL-5，通过基于细胞的发光检测，在高通量筛选 (HTS) 中测量了 MITF 靶基因黑素瘤抑制素 (TRPM-1) 的启动子活性。从NIH MLPCN化合物库中筛选了331,578个化合物。其中，3,206个化合物具有活性（命中率为0.96%）。在初步高通量筛选中，鉴定出一种氯萘醌（CID 1716436/SID 22416871）为TRPM-1启动子活性抑制剂。在初步筛选中，该化合物及其几个结构密切相关的类似物均表现出强效活性。为了提高活性并最大限度地减少不良性质，开展了构效关系（SAR）研究。这些努力最终获得了一种具有改进化学性质和选择性的探针（CID 12387471/ML329）。特别是，ML329不易发生亲核谷胱甘肽加成反应，而最初的先导化合物则发生了加合物形成。 ML329 在两种 MITF 依赖性黑色素瘤细胞活力检测方法（SK-MEL-5 和 MALME-3M）以及一种 MITF 非依赖性细胞系 A375 中进行了测试。ML329 对 MITF 依赖性细胞（原代黑素细胞）表现出特异性活性，但对 A375 细胞的活力没有影响。ML329 降低了多个 MITF 靶基因的表达，包括色素相关基因和细胞周期调节因子 CDK2。作为一种工具化合物，ML329 将有助于阐明 MITF 在黑素细胞谱系发育和黑色素瘤疾病进展中的作用。[1]

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目的：肠道菌群有助于维持婴儿肠道稳态。本研究旨在分析母乳来源的益生菌如何促进幼鼠的肠道发育。方法与结果：本研究探讨了源自母乳的潜在益生菌对宫内生长受限（IUGR）新生大鼠肠道发育的影响。乳酸杆菌ML-329和副干酪乳杆菌ML-446均表现出良好的疏水性（p < 0.05）。ML-446对肠道长度和重量有显著影响（p < 0.05）。同时，与饲喂鼠李糖乳杆菌GG的IUGR新生大鼠相比，饲喂ML-329的IUGR新生大鼠的肠绒毛高度显著增加（p < 0.05）。此外，ML-329 和 ML-446 均通过 Wnt 和 Notch 信号通路显著促进肠上皮细胞的增殖和分化，增加 Ki67 阳性细胞、杯状细胞和溶菌酶阳性潘氏细胞的数量（p < 0.05）。结论：ML-329 和 ML-446 对空肠、回肠和结肠肠上皮细胞的增殖和分化刺激作用是通过激活 Wnt 信号通路（增加 Wnt、LRP5 和 β-catenin 基因的表达以及 β-catenin 的积累）和下调 Notch 信号通路（降低活化 Notch 蛋白的表达）介导的。研究意义及影响：乳酸杆菌可能促进宫内生长受限（IUGR）幼鼠的肠道发育，并增强潘氏细胞和杯状细胞的增殖。这些研究结果进一步揭示了母乳中的有益微生物在 IUGR 新生大鼠早期生活中促进肠道发育的作用。[2]

C₁₆H₁₂N₂O₄S

328.34

328.052

C, 58.53; H, 3.68; N, 8.53; O, 19.49; S, 9.76

19992-50-8

12387471

White to off-white solid powder

3.563

114.71

2

6

3

23

627

0

O=S(C1=CC=C(NC(C2=O)=CC(C3=C2C=CC=C3)=O)C=C1)(N)=O

CSYFFQVEQXEIAB-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H12N2O4S/c17-23(21,22)11-7-5-10(6-8-11)18-14-9-15(19)12-3-1-2-4-13(12)16(14)20/h1-9,18H,(H2,17,21,22)

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 5 mg/mL (15.23 mM) in 0.5% CMC-Na/saline water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。