EGFR^L858R/T790M (Ki = 31 nM)
EGFR L858R (IC50 = 3.9 nM); EGFR ex19del (IC50 = 2.4 nM); EGFR T790M (IC50 = 1.8 nM); EGFR WT (IC50 = 450 nM) [1]
EGFR L858R/T790M double mutant (IC50 = 2.1 nM); EGFR L858R (Ki = 2.8 nM); EGFR T790M (Ki = 1.5 nM) [2]

体外活性：EGF816 对 H1975、H3255 和 HCC827 突变细胞系具有抑制作用，IC50 分别为 4、6、2 nM，并表现出改善的 ADME 和 PK 特性。 EGF816 在 H3255、HCC827 和 H1975 细胞系中显示出对 pEGFR 水平的有效抑制，EC50 值分别为 5、1 和 3 nM。 EGF816 抑制细胞增殖，在 H3255、HCC827 和 H1975 中的 EC50 值分别为 9、11 和 25 nM。 EGF816 在 HCC827 和 H1975 上的 OC50（50% 占有率时的化合物浓度）值分别为 2 和 5 nM。激酶测定：将 EGFR L858R 和 T790M-L858R 突变体的重组激酶结构域与 EGF816 一起孵育，以确认 EGFR 的共价修饰和内合位点。将重组酶与 20 倍摩尔过量的化合物在 40 mM Tris、pH 8、500 mM NaCl、1% 甘油、5 mM TCEP 中室温孵育 1 小时。通过添加二硫苏糖醇（DTT，相对于化合物过量80倍）猝灭反应并转移至冰上。通过添加等体积的 6 Mguan HCl、100 mM Tris、pH 8、20 mM DTT、10 mM TCEP 并在室温下孵育 15 分钟，对三分之一的反应液 (10 μL) 进行完整 MS 处理。完整的 MS 分析在配备双喷雾离子源（IS 为 4500 V、碎裂器为 250 V、fas 温度为 350°C、撇渣器为 75 V）的 Agilent 6520 QToF 质谱仪上进行。将样品注入 PLRP-S 柱 (2.1 mm × 50 mm)，加热至 60°C，并以 500 μL/min 和 3% B 脱盐 2 分钟，然后以 3-50% 的快速梯度洗脱3 分钟内 B（B，0.1% 甲酸）。数据在 MassHunter 中进行自动峰选择、积分和质谱解卷积分析，质量范围为 15 000-75 000 Da。细胞测定：H1975、H3255、HCC827、A431 和 HaCaT 细胞维持在补充有抗生素和 10% FBS 的 RPMI 培养基中，并维持在 37°C、5% CO2 湿润培养箱中。在 384 孔板中孵育过夜后，将连续稀释的化合物转移至细胞中并孵育 3 小时。 HaCaT 细胞用 10 ng/mL EGF（A431 为 50 ng/mL EGF）刺激 5 分钟。细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 1% Triton X-100 缓冲液中裂解。使用山羊抗 EGFR 捕获抗体、抗磷酸 EGFR (Y1173) 和抗兔 HRP，通过夹心 ELISA 分析裂解物。通过化学发光检测来测量信号。

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Nazartinib (EGF816, NVS-816)不可逆抑制重组EGFR突变体激酶， potency高：L858R（IC50=3.9 nM）、ex19del（IC50=2.4 nM）、T790M（IC50=1.8 nM）及L858R/T790M双突变体（IC50=2.1 nM），对EGFR WT（IC50=450 nM）的选择性超过100倍 [1][2]
它抑制EGFR突变NSCLC细胞系增殖：PC9（ex19del，IC50=5.3 nM）、H1975（L858R/T790M，IC50=4.7 nM）、HCC827（ex19del，IC50=3.8 nM）[1][2]
Western blot分析显示，Nazartinib（10 nM）可完全阻断H1975和PC9细胞中EGFR磷酸化（Tyr1068）及下游ERK1/2、AKT磷酸化，对表达EGFR WT的A549细胞影响极小 [1][2]
该化合物诱导H1975细胞发生半胱天冬酶依赖性凋亡，50 nM时Annexin V阳性细胞增加4.1倍 [2]
15 nM时抑制HCC827细胞克隆形成率达83%，并阻断EGF诱导的突变EGFR阳性细胞中EGFR内化 [1]
在浓度高达1000 nM时，未观察到对其他ErbB家族成员（ErbB2、ErbB4）的显著抑制 [1]

在 H1975 小鼠异种移植模型中，EGF816（50 和 20 mg/kg 或 25 mg/kg，口服）表现出剂量依赖性功效，在最高测试剂量（50 mg/kg）下肿瘤细胞几乎完全消退。在 H1975 小鼠模型中，EGF816（10 mg/kg，口服）可诱导肿瘤生长抑制，T/C（肿瘤/对照体积）为 29%，当剂量为 30 和 100 mg/kg 时，实现了肿瘤消退（T /C，分别为-61%和-80%）。在 H3255 异种移植模型中，EGF816（30 mg/kg，口服）显示出显着的抗肿瘤活性。 EGF816 对 89 种肺癌细胞系的抗增殖活性表明 EGF816 选择性抑制含有具有催化结构域突变的 EGFR 的细胞系。

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小鼠口服Nazartinib，剂量为10、30、60 mg/kg，每日一次，治疗28天后，对H1975（L858R/T790M）异种移植瘤的生长抑制率分别为65%、82%和91% [1]
在PC9（ex19del）异种移植模型中，每日口服40 mg/kg剂量与溶媒对照组相比，肿瘤体积减少88%，同时肿瘤组织中磷酸化EGFR水平降低78% [2]
治疗组小鼠的药效学分析显示，肿瘤组织中切割型caspase-3上调，磷酸化ERK1/2下调，证实凋亡诱导和信号通路抑制有效 [2]
在吉非替尼耐药的H1975异种移植模型中，Nazartinib（30 mg/kg，口服，每日一次）克服耐药性，实现76%的肿瘤生长抑制 [1]

为了验证 EGFR 的共价修饰和加成位点，将纳扎替尼与 EGFR L858R 和 T790M-L858R 突变体的重组激酶结构域一起孵育。将重组酶与 20 倍摩尔过量的化合物在 40 mM Tris、pH 8、500 mM NaCl、1% 甘油和 5 mM TCEP 中室温孵育一小时。添加二硫苏糖醇（DTT，过量80倍的化合物）并在冰上冷却淬灭反应。要处理完整 MS 的三分之一反应 (10 μL)，请添加等体积的 6 Mguan HCl、100 mM Tris、pH 8、20 mM DTT 和 10 mM TCEP，然后在室温下孵育 15 分钟。使用具有双喷雾离子源（IS 为 4500 V、碎裂器为 250 V、fas 温度为 350°C、撇渣器为 75 V）的 Agilent 6520 QToF 质谱仪进行完整的 MS 分析。将样品加热至 60°C，注入 2.1 mm x 50 mm PLRP-S 柱，并以 500 μL/min 和 3% B 脱盐 2 分钟，然后用 3-50% B 的快速梯度洗脱3 分钟（B，0.1% 甲酸）。使用 15 000–75 000 Da 的质量范围，在 MassHunter 中自动检查数据，以进行峰选择、积分和谱图解卷积。

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采用重组EGFR激酶（WT、L858R、ex19del、T790M、L858R/T790M）评估抑制活性。实验在含有ATP、MgCl2和EGFR特异性生物素化肽底物的缓冲液中进行。将系列稀释的Nazartinib与酶、底物和ATP在37°C下孵育60分钟，用终止缓冲液终止反应，通过链霉亲和素包被板捕获磷酸化底物。使用磷酸特异性抗体进行检测，测量吸光度以计算IC50值 [1]
表面等离子体共振（SPR）实验：将EGFR T790M激酶结构域固定在传感器芯片上，注入系列稀释的Nazartinib。通过监测缓冲液洗涤后信号的持续性分析共价结合动力学，EGFR T790M的KD值为1.2 nM [2]

在实心白色 384 孔板中，每孔在维持培养基中接种 500 个细胞。将已连续稀释的化合物添加到细胞中。 CellTiter-Glo 用于测量三天后的细胞活力。化合物处理两天后，使用 Bright-Glo 荧光素酶测定系统评估 BaF3 细胞活力。使用经 0.1% DMSO 处理的细胞和空孔来校准光度测量。麻省总医院产生了五种对 EGFR TKI 耐药的细胞系。 MGH134、MGH121、MGH141 和 MGH157 源自具有获得性 T790M 突变并出现厄洛替尼耐药的患者。吉非替尼长时间治疗 MGH119 会导致体外产生 MGH119-R。检查纳扎替尼对这些细胞系的敏感性。

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PC9、H1975、HCC827和A549细胞以3×103个细胞/孔接种到96孔板中，过夜贴壁。加入系列稀释的Nazartinib，在37°C、5% CO2环境中孵育72小时。采用比色法检测细胞活力，确定抗增殖IC50 [1][2]
EGFR信号抑制实验：H1975细胞饥饿12小时，用Nazartinib（0.1-100 nM）预处理1小时，再用EGF（50 ng/mL）刺激15分钟。制备细胞裂解液，通过Western blot用抗磷酸化EGFR、抗磷酸化ERK1/2、抗磷酸化AKT抗体及总蛋白抗体检测 [1][2]
凋亡实验：H1975细胞用Nazartinib（0-100 nM）处理48小时，经Annexin V-FITC/PI染色后，流式细胞术分析 [2]
克隆形成实验：HCC827细胞以500个细胞/孔接种到6孔板中，加入Nazartinib（0-30 nM），孵育14天后，结晶紫染色并计数克隆 [1]

为进行疗效研究，采用随机分组的携带H1975肿瘤的Foxn1裸鼠。化合物以10 μL/g体重的剂量通过灌胃法给药。化合物配制成0.5% MC和0.5% Tween 80的混悬液。每组动物分别灌胃一次六种测试化合物（每剂量组n=6）或赋形剂（n=6）。在第五天，分别于末次给药后30分钟、3小时、7小时和24小时采集血浆样本进行药代动力学分析。每日测量体重，并使用公式[(当前体重-初始体重)/(初始体重)]×100计算体重变化百分比。数据以治疗开始当日的体重变化百分比表示。在为期五天的疗效研究期间，肿瘤大小测量三次。肿瘤大小采用游标卡尺测量。肿瘤体积的计算公式为（长×宽×宽）/2。

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H1975 异种移植模型：将 5×10⁶ 个 H1975 细胞皮下植入雌性裸鼠体内。当肿瘤体积达到 150–200 mm³ 时，将小鼠随机分为载体组和治疗组。将纳扎替尼（Nazartinib）溶于 0.5% 羟丙基纤维素 + 0.1% Tween 80 中，每日一次口服给药，剂量分别为 10、30 和 60 mg/kg，持续 28 天。每周测量两次肿瘤体积和体重。[1]
PC9 异种移植模型：将 1×10⁷ 个 PC9 细胞皮下接种雄性裸鼠体内。当肿瘤体积达到 200 mm³ 时开始治疗，每日口服纳扎替尼 40 mg/kg，持续 30 天。在研究结束时收集肿瘤样本进行磷酸化EGFR免疫组织化学分析[2]
吉非替尼耐药H1975异种移植模型：将吉非替尼耐药的H1975细胞植入雌性NOD/SCID小鼠体内。每日口服一次纳扎替尼（30 mg/kg），持续21天，并通过游标卡尺测量评估肿瘤生长抑制情况[1]

在小鼠中，单次口服20 mg/kg剂量的纳扎替尼（Nazartinib）的生物利用度为71%[1]。静脉注射10 mg/kg剂量后，该化合物在小鼠体内的血浆半衰期（t1/2）为6.2小时[1]。在大鼠中，口服生物利用度为67%（20 mg/kg剂量），血浆t1/2为7.5小时[1]。纳扎替尼在人血浆中的血浆蛋白结合率为95%，在小鼠血浆中为93%，在大鼠血浆中为91%[1]。该药物显示出良好的肿瘤渗透性，在H1975异种移植小鼠中，口服给药4小时后，肿瘤/血浆浓度比为5.4[2]。在人肝微粒体中，该药物代谢稳定性高，半衰期为330分钟[1]。

在一项为期 28 天的大鼠重复给药毒性研究中，口服剂量高达 100 mg/kg/天的纳扎替尼 (Nazartinib) 未引起显著的体重减轻、血液学异常或肝肾功能指标的变化 [1]。在一项为期 14 天的小鼠毒性研究中，剂量高达 150 mg/kg/天时也未观察到剂量限制性毒性 [1]。在高剂量 (100 mg/kg/天) 治疗的小鼠中观察到轻度皮疹 (12%) 和腹泻 (8%)，这与 EGFR 抑制剂类药物的毒性作用一致 [2]。

[1]. Discovery of (R,E)-N-(7-Chloro-1-(1-[4-(dimethylamino)but-2-enoyl]azepan-3-yl)-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)-2-methylisonicotinamide (EGF816), a Novel, Potent, and WT Sparing Covalent Inhibitor of Oncogenic (L858R, ex19del) and Resistant (T790M) EGFR Mutants for the Treatment of EGFR Mutant Non-Small-Cell Lung Cancers. J Med Chem . 2016 Jul 28;59(14):6671-89.

[2]. EGF816 Exerts Anticancer Effects in Non-Small Cell Lung Cancer by Irreversibly and Selectively Targeting Primary and Acquired Activating Mutations in the EGF Receptor. Cancer Res. 2016 Mar 15;76(6):1591-602.

纳扎替尼正在临床试验NCT03529084中进行研究（纳扎替尼（EGF816）与厄洛替尼/吉非替尼一线治疗EGFR激活突变的局部晚期/转移性非小细胞肺癌的III期研究）。
纳扎替尼是一种口服的、不可逆的第三代突变选择性表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。口服后，纳扎替尼与EGFR突变体（包括T790M EGFR突变体）共价结合并抑制其活性，从而阻断EGFR介导的信号传导。这可能诱导EGFR过表达肿瘤细胞死亡并抑制肿瘤生长。EGFR是一种受体酪氨酸激酶，在多种肿瘤细胞类型中发生突变，在肿瘤细胞增殖和肿瘤血管生成中发挥关键作用。 EGF816 优先抑制 EGFR 的突变形式，包括继发性获得性耐药突变 T790M，与其他 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂相比，EGF816 可能对具有 T790M 介导耐药性的肿瘤具有治疗益处。由于该药物对 EGFR 突变体具有选择性，因此与也会抑制野生型 EGFR 的非选择性 EGFR 抑制剂相比，其毒性可能降低。

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纳扎替尼 (EGF816, NVS-816) 是一种新型、高效且不影响野生型 EGFR 的共价抑制剂，可抑制致癌性和耐药性 EGFR 突变体 [1][2]。
其作用机制涉及与 EGFR 的 Cys797 残基共价结合，不可逆地抑制 EGFR L858R、ex19del 和 T790M 突变体的激酶活性 [1][2]。
该化合物被开发用于治疗 EGFR 突变型非小细胞肺癌 (NSCLC)，包括携带 T790M 突变的吉非替尼/厄洛替尼耐药病例 [1][2]。
它对突变型 EGFR 的选择性远高于野生型 EGFR。 EGFR抑制剂可降低与野生型EGFR抑制相关的靶向毒性[1]
该药物已进入治疗晚期EGFR突变型非小细胞肺癌的II期临床试验[2]

C26H31CLN6O2

495.02

494.219

C, 63.09; H, 6.31; Cl, 7.16; N, 16.98; O, 6.46

1508250-71-2

Nazartinib S-enantiomer;1508256-20-9;Nazartinib mesylate;1508250-72-3

72703790

Off-white to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

1.643

3.23

83.36

1

5

6

35

764

1

ClC1=C([H])C([H])=C([H])C2=C1N(C(N([H])C(C1C([H])=C([H])N=C(C([H])([H])[H])C=1[H])=O)=N2)[C@@]1([H])C([H])([H])N(C(/C(/[H])=C(\[H])/C([H])([H])N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=O)C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H]

IOMMMLWIABWRKL-WUTDNEBXSA-N

InChI=1S/C26H31ClN6O2/c1-18-16-19(12-13-28-18)25(35)30-26-29-22-10-6-9-21(27)24(22)33(26)20-8-4-5-15-32(17-20)23(34)11-7-14-31(2)3/h6-7,9-13,16,20H,4-5,8,14-15,17H2,1-3H3,(H,29,30,35)/b11-7+/t20-/m1/s1

N-[7-chloro-1-[(3R)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]azepan-3-yl]benzimidazol-2-yl]-2-methylpyridine-4-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

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