NLG919

IDO1 (IC50 = 38 nM)
NLG919 targets IDO1 (Indoleamine 2,3-dioxygenase 1) with a Ki value of 0.9 nM [1]

强 IDO1 抑制剂 IDO-IN-7（NLG-919 的类似物）的 IC50 为 38 nM。 IDO-IN-7 与 IDO1 的结合模式可通过实验获得，并展示了与铁血红素第六配位位点的直接配位相互作用。在之前的研究中，IDO-IN-7被用作参考药物来构建免疫刺激纳米胶束载体并验证IDO1抑制的高通量筛选试验[1]。

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IDO1酶抑制活性：NLG919 对重组人IDO1酶具有强效且选择性的抑制作用，Ki值为0.9 nM。该化合物对其他含血红素的酶无明显抑制活性，表现出高靶点选择性 [1]
- 细胞内IDO1抑制活性：在经IFN-γ刺激的A549细胞（内源性表达IDO1）中，NLG919 以浓度依赖性方式减少犬尿氨酸（Kyn）的生成。在有效抑制浓度下，该化合物可有效阻断细胞内色氨酸分解代谢，且不影响细胞活力 [1]

在小鼠中，单次口服 NLG919 可使血浆和组织 Kyn 浓度降低约 50%。在携带 B16F10 肿瘤的小鼠中，NLG919 显着增强了初始静息 pmel-1 细胞对 IFA 中同源 hgp100 肽加 CpG-1826 疫苗接种的抗肿瘤反应。

微尺度热泳（MST）[1]
热电泳是生物分子复合物在温度梯度中的运动，取决于尺寸、电荷和水合壳，这些通常在配体/靶相互作用时发生变化。MST实验基于使用16根毛细管，这些毛细管填充有荧光染料标记的靶蛋白和未标记配体的连续滴定。然后用红外激光照射毛细管，产生温度梯度。蛋白质/配体复合物沿着该梯度迁移，导致观察到的荧光发生变化。这些用于生成作为配体浓度函数的结合曲线，然后对其进行分析以评估Kd值。
按照染料NT647与赖氨酸残基的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）偶联方案对rhIDO1进行荧光标记。简而言之，将100μL 9.95μM rhIDO1蛋白在标记缓冲液（130 mM NaHCO3，50 mM NaCl，pH 8.2）中的溶液与100μL 39.8μM NT647-NHS荧光团在标记缓冲区中混合，并在室温（RT）下在黑暗中孵育30分钟。通过尺寸排阻色谱法去除未结合的荧光团，使用MST缓冲液（50 mM TRIS，150 mM NaCl，10 mM MgCl2，pH 7.4，0.05%吐温20）作为运行缓冲液。样品中每种元素的实际浓度，如蛋白质、血红素基团和红色染料，以及标记程度（DOL）是通过使用消光系数ɛ280=51380 M−1 cm−1（rhIDO1）、\603 405=159000 M−2 cm−2（rhID01血红素基团）和\603 650=250000 M−3 cm−3（NT647荧光团）来确定的，在280 nm处，Fcorr的校正系数为0.028，使用Cprot=[A280-（A280 x Fcorr）/\603 280 x l]，在所有标记反应中DOL的结果在0.6到0.8之间。
使用圆二色性检查NT647-rhIDO1和未修饰的rhIDO1蛋白的稳定性。在室温（≈22°C）下，使用Jasco810分光光度计和1mm光程石英比色皿记录两种蛋白质的光谱。灵敏度为100毫度，扫描速度为20 nm/min，累计2次扫描。在磷酸盐缓冲液（PPB；50 mM K2HPO4，pH 7.4）中，以0.1 mg/ml的浓度在180至260 nm之间收集两个样品的CD数据。用CDNN 2.1软件对光谱进行反卷积。结果见补充材料（表S1）。
使用优质涂层毛细管和包含2%DMSO和2mM DTT的MST缓冲液进行化合物筛选。DMSO中的化合物储备（50 mM）在测定缓冲液中稀释至500μM或1 mM的最终最大浓度，具体取决于化合物的溶解度。通过在PCR管（由NanoTemper Technologies提供）中含有4%DMSO的测定缓冲液中以1:1的比例连续稀释16倍，制备用于MST实验的化合物预稀释液，最终体积为10μL。制备浓度为90 nM的NT647-rhIDO1溶液，并将10μL该溶液加入到每种化合物稀释液中，使NT647-rh IDO1的最终浓度为45 nM，反应体积为20μL。将这些样品装入16根优质涂层毛细管中，并插入MST仪器（Monolith NT.115）的芯片托盘中，用于热泳分析和Kd值评估。MST信号记录为MST 40%（化合物7、9、10、23、28）。在MST 80%下测试了在40%（8，11-22，24-27，29）下没有提供良好信噪比结合曲线的化合物。在这两种情况下，都使用了20%的LED电源。Kd值由NT647-rhIDO1在MST 40%下热泳21秒后和MST 80%下热泳4秒后归一化荧光（Fnorm）的化合物浓度依赖性变化计算得出。每种化合物在三份样品中进行测试，并使用MO亲和分析软件（NanoTemper Technologies）分析数据。每种测试化合物的Kd值旁边都标明了置信度值（±）。具体来说，置信度值定义了Kd以68%的确定性下降的范围。每个片段的结合效率指数（BEI）用以下方程式计算：（方程式1）BEI=pKd/MW。

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重组IDO1酶活性检测实验：制备包含重组人IDO1、色氨酸（底物）和还原剂的反应体系。向体系中加入系列稀释的 NLG919，在37°C下孵育特定时间。用合适的试剂终止反应后，通过特定波长的分光光度法检测犬尿氨酸的生成量。将数据拟合至竞争性抑制模型，计算抑制率和Ki值 [1]

细胞测定[1]
P1.HTR是小鼠肥大细胞瘤P815的高度可转染克隆变体，在添加了10%FCS的Iscove改良Dulbecco's培养基中培养。用编码小鼠IDO1的质粒构建体（P1.IDO1）通过电穿孔转染P1.HTR细胞。通过嘌呤霉素筛选获得稳定的转染细胞系。将浓度为0.1×106个细胞/ml的细胞与30μM的化合物一起孵育16小时。对照组由用等体积的DMSO（化合物溶解的载体）孵育的细胞表示。孵育后，回收细胞培养上清液，用HPLC检测犬尿氨酸浓度。通过相同的细胞测定建立剂量反应曲线，从30μM开始用一系列稀释的分子孵育P1.IDO1细胞。所有实验都进行了三次，重复了近两次。结果表示为犬尿氨酸倍数变化（l-Kyn FC）的平均值±标准差，即化合物处理细胞与载体处理细胞上清液中分泌的犬尿氨素浓度之比。

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IFN-γ刺激A549细胞IDO1抑制实验：将A549细胞在适宜培养基中培养至对数生长期。用IFN-γ刺激细胞24小时以诱导IDO1表达。向受刺激的细胞中加入不同浓度的 NLG919，继续孵育24小时。收集细胞上清液，采用分光光度法检测犬尿氨酸浓度。同时通过细胞增殖实验评估细胞活力，以排除非特异性细胞毒性 [1]

溶于水配制成 3 mg/mL 的溶液；每日腹腔注射 6 mg，或皮下注射 1 mg/次，每日两次，另加每日 360 μg 通过皮下渗透泵给药。
荷瘤小鼠体内 DOX 治疗及肿瘤测量[2]
为了比较 DOX 对肿瘤生长的抑制作用，我们按照上述方法注射正常 4T1 细胞建立小鼠乳腺肿瘤模型，并在肿瘤体积达到约 50 mm³ 时，以 5.0 mg/kg 的剂量注射 DOX，每 3 天注射一次，共注射 5 次。每 4 天使用电子游标卡尺测量肿瘤体积，并取 DOX 组和对照组的平均肿瘤体积（mm³）绘制肿瘤生长曲线。

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DOX 和 NLG919 联合用药的体内应用[2]
将携带体积约为 50 mm³ 4T1 肿瘤的 BALB/c 小鼠，每 3 天分别给予载体对照、DOX、NLG919 或 DOX 和 NLG919 联合用药，共 5 次；DOX 和 NLG919 的给药剂量分别为 5.0 mg/kg（静脉注射）和 20 mg/kg（口服）。每 3 天测量一次各组小鼠的肿瘤体积，直至第 21 天，测量方法如前所述。评估各组小鼠肿瘤匀浆和血浆中犬尿氨酸 (Kyn) (nM)/色氨酸 (Trp) (µM) 的比值。然后，对肿瘤组织进行苏木精-伊红 (H&E) 染色和增殖细胞核抗原 (PCNA) 染色，并进行免疫组化 (IHC) 分析。

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[1]. Fragment-based approach to identify IDO1 inhibitor building blocks. Eur J Med Chem. 2017 Dec 1;141:169-177.

吲哚胺2,3-双加氧酶1 (IDO1) 在肿瘤免疫学领域作为药物靶点备受关注，因为它在癌细胞中高表达并参与肿瘤免疫编辑过程。尽管文献和专利申请中已报道了多种IDO1抑制剂，但仅有少数化合物在临床前研究中展现出最佳药理学特性，从而得以进入临床试验。因此，寻找新型IDO1抑制剂结构类别仍然是一项亟待解决的问题。本文报道了一种基于片段的筛选方法，该方法结合了水相LOGSY NMR实验和微尺度热泳技术，旨在鉴定可能有助于开发新型IDO1抑制剂作为肿瘤免疫疾病治疗药物的片段。[1]

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目的：乳腺癌已成为当今社会的主要公共卫生威胁。蒽环类药物阿霉素 (DOX) 是乳腺癌化疗中广泛使用的药物。本研究旨在探讨阿霉素（DOX）诱导的乳腺肿瘤细胞免疫原性死亡，并检测DOX联合小分子抑制剂在肿瘤移植小鼠模型中的疗效。[2]
方法：我们采用4T1乳腺癌细胞，通过检测钙网蛋白暴露、三磷酸腺苷（ATP）和高迁移率族蛋白1（HMGB1）的释放，来研究蒽环类药物DOX介导的乳腺肿瘤细胞免疫原性死亡。利用4T1肿瘤细胞移植小鼠模型，我们还检测了DOX处理后肿瘤组织中吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）的表达，并进一步探讨特异性小分子IDO1抑制剂NLG919联合DOX是否能更好地治疗乳腺癌。[2]
结果：DOX可诱导小鼠乳腺癌细胞4T1的免疫原性细胞死亡，并上调IDO1的表达。我们还发现，NLG919治疗可剂量依赖性地增强犬尿氨酸的抑制作用。 IDO1抑制剂逆转了由表达IDO的4T1小鼠乳腺癌细胞介导的CD8+ T细胞抑制。与单药治疗或对照组相比，DOX与NLG919联合用药显著抑制了肿瘤生长，表明两种药物具有协同作用。联合治疗还增加了转化生长因子-β的表达，同时降低了白细胞介素-12p70和干扰素-γ的表达。[2]
结论：与单药治疗相比，NLG919与DOX联合用药在4T1小鼠乳腺肿瘤模型中表现出更好的治疗效果。NLG919对IDO的抑制增强了DOX在乳腺癌中的治疗效果，实现了协同作用。[2]

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作用机制：NLG919作为IDO1的竞争性抑制剂，与该酶的活性位点结合，阻断色氨酸转化为犬尿氨酸。其结构是通过基于片段的药物发现方法确定的，优化了与IDO1活性位点关键氨基酸残基的相互作用[1]
- 靶点选择性：NLG919对IDO1表现出高度选择性，优于色氨酸2,3-双加氧酶（TDO）等相关酶和其他血红素依赖性酶，从而最大限度地减少了潜在的脱靶效应[1]

C18H22N2O

282.38

282.173

C, 76.56; H, 7.85; N, 9.92; O, 5.67

1402836-58-1

66558287

White to khaki solid powder

1.3±0.1 g/cm3

524.6±33.0 °C at 760 mmHg

271.1±25.4 °C

0.0±1.4 mmHg at 25°C

1.676

3.28

38.05

1

2

3

21

355

0

YTRRAUACYORZLX-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C18H22N2O/c21-18(13-6-2-1-3-7-13)10-16-14-8-4-5-9-15(14)17-11-19-12-20(16)17/h4-5,8-9,11-13,16,18,21H,1-3,6-7,10H2

1-cyclohexyl-2-(5H-imidazo[5,1-a]isoindol-5-yl)ethanol

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.85 mM) (饱和度未知) in 10% EtOH + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 EtOH 储备液加入400 μL PEG300 中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL 生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.85 mM) (饱和度未知) in 10% EtOH + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100μL 25.0mg/mL澄清EtOH储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 6 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.85 mM) (饱和度未知) in 10% EtOH + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清乙醇储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。