Chk1 (Ki = 0.9 nM); Chk1 (IC50 <1 nM); Chk2 (IC50 = 8 nM)
Checkpoint Kinase 1 (CHK1) (IC50 = 0.9 nM for recombinant human CHK1 kinase activity; Ki = 0.3 nM; >100-fold selectivity over CHK2, CDK1, and 50+ other kinases) [1]

体外活性：Prexasertib（也称为 LY2606368）是一种新型、有效、选择性和 ATP 竞争性 CHK1（检查点激酶 1）蛋白激酶抑制剂，对 CHK1 和 CHK2 的 IC50 值分别<1 nM 和 8 nM。 CHK1 是一种多功能蛋白激酶，对于细胞对 DNA 损伤的反应和活性复制叉数量的控制都是不可或缺的。由于 CHK1 在细胞周期中建立 DNA 损伤检查点方面的作用，CHK1 抑制剂目前正在作为化学增效剂进行研究。 Prexasertib 作为单一药物会导致双链 DNA 断裂，同时消除 DNA 损伤检查点的保护。 Prexasertib 的作用取决于 CHK1 的抑制以及 CDK2 CDC25A 激活的相应增加，这增加了复制叉的数量，同时降低了其稳定性。用 Prexasertib 处理细胞会导致 S 期细胞群中快速出现 TUNEL 和 pH2AX 阳性双链 DNA 断裂。 Prexasertib 在异种移植肿瘤模型中显示出类似的活性，从而导致显着的肿瘤生长抑制。总之，Prexasertib 是一类通过复制灾难来治疗癌症的新型药物的有力代表。激酶测定：Prexasertib (LY2606368) 有效且选择性地抑制 CHK1，IC50 小于 1 nM，并且还抑制 CHK2，IC50 为 8 nM。 LY2606368 通过丝氨酸 296 自磷酸化对 CHK1 活性的 EC50 为 1 nM，对 HT-29 CHK2 自磷酸化 (S516) 的 EC50 <31 nM。 LY2606368 可有效消除 p53 缺陷型 HeLa 细胞中阿霉素激活的 G2-M 检查点，EC50 为 9 nM。然而，100 nM LY2606368 不会抑制 PMA 刺激的 RSK，而是微弱地刺激丝氨酸 235/236 上 S6 的磷酸化。 LY2606368 对 U-2 OS、Calu-6、HT-29、HeLa 和 NCI-H460 细胞系具有广泛的抗增殖作用，IC50 分别为 3 nM、3 nM、10 nM、37 nM 和 68 nM。 LY2606368 (4 nM) 导致细胞周期群体从 G1 和 G2-M 向 S 期发生大幅转变，同时诱导 U-2 OS 细胞中的 H2AX 磷酸化。 LY2606368 (25 μM) 对 AGS 和 MKN1 细胞的增殖具有抑制活性。 LY2606368 (20 nM) 抑制 DR-GFP 细胞的 HR 修复能力。 LY2606368 (5 nM) 与 PARP 抑制剂 BMN673 组合，在胃癌细胞中显示出协同抗癌作用。细胞检测：采用MTS细胞增殖比色检测试剂盒检测BMN673和LY2606368的CHK1消融的增殖抑制作用、IR敏感性、抗癌作用。将细胞接种到96孔细胞培养板中，按照规定的实验条件处理，然后向每孔中加入20 μL MTS试剂，孵育2小时后，在酶标仪上以490 nM的波长检测每孔的细胞活力。

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Prexasertib (LY2606368)（0.01-10 nM）剂量依赖性抑制重组CHK1激酶活性，5 nM浓度下抑制率达95%；10 nM时在HCT116细胞中阻断CHK1介导的CDC25C（Ser216）磷酸化，抑制率80% [1]
- Prexasertib (LY2606368) 抑制多种人类癌细胞系增殖：72小时后，HCT116结直肠癌GI50 = 0.3 μM，A549肺癌GI50 = 0.5 μM，MDA-MB-231乳腺癌GI50 = 0.4 μM，PC-3前列腺癌GI50 = 0.6 μM [1]
- Prexasertib (LY2606368)（0.5 μM）诱导HCT116细胞复制灾难：免疫荧光和DNA纤维实验显示，DNA损伤标志物γ-H2AX表达增加3.2倍，DNA纤维长度较对照组减少65% [1]
- Prexasertib (LY2606368)（0.2 μM）与PARP抑制剂BMN673（0.1 μM）在胃癌细胞系（MGC803、BGC823）中产生协同效应：联合指数（CI）<1，细胞活力降低70%（Prexasertib单药组30%，BMN673单药组25%）[2]
- Prexasertib (LY2606368)（0.3 μM）+ BMN673（0.15 μM）处理MGC803细胞48小时，凋亡率从单药组的12%升至48%；Western blot显示剪切型caspase-3（增加3.5倍）和PARP（增加2.8倍）表达升高 [2]
- Prexasertib (LY2606368)（≤1 μM）对正常人胃上皮细胞（GES-1）毒性低，CC50 = 25 μM，对MGC803细胞的治疗指数>50 [2]

Prexasertib (LY2606368) 作为单一疗法或与其他药物联合使用时，可抑制癌症异种移植物中的肿瘤生长。在原位 SKOV3 卵巢癌模型中，LY2606368 抑制原发肿瘤的生长，并显着降低转移和腹水积聚的发生率。 LY2606368 还在 SW1990 原位胰腺癌模型中表现出功效，可抑制原发肿瘤生长 92%，并消除淋巴结、脾脏和肠道的转移

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荷HCT116结直肠癌异种移植瘤的裸鼠（BALB/c-nu）接受Prexasertib (LY2606368)（10 mg/kg，腹腔注射，每3天1次，连续4周）处理。肿瘤生长抑制率达68%，中位生存期从35天延长至48天 [1]
- 荷MGC803胃癌异种移植瘤的裸鼠中，Prexasertib (LY2606368)（8 mg/kg，腹腔注射，每3天1次×4周）联合BMN673（15 mg/kg，灌胃，每日1次×14天）的肿瘤生长抑制率达82%，显著高于Prexasertib单药组（45%）和BMN673单药组（50%）[2]
- Prexasertib (LY2606368)（10 mg/kg，腹腔注射）处理HCT116异种移植瘤小鼠后，肿瘤组织中γ-H2AX和剪切型caspase-3表达分别增加2.5倍和3倍，证实复制灾难和凋亡诱导 [1]
- 联合治疗使BGC823异种移植瘤小鼠的肺转移结节较BMN673单药组减少65% [2]

Prexasertib (LY2606368)抑制 CHK1 和 CHK2，IC50 值分别小于 1 nM 和 8 nM，具有很强的特异性效力。对于通过丝氨酸 296 自磷酸化的 CHK1 活性，LY2606368 的 EC50 为 1 nM，对于 HT-29 CHK2 自磷酸化，其 EC50 <31 nM (S516)。 LY2606368 的 EC50 为 9 nM，可有效抑制多柔比星在 p53 缺陷型 HeLa 细胞中激活的 G2-M 检查点。尽管如此，100 nM LY2606368 并未微弱抑制 PMA 刺激的 RSK，而是略微增加了丝氨酸 235/236 上 S6 的磷酸化。 LY2606368 对 U-2 OS、Calu-6、HT-29、HeLa 和 NCI-H460 细胞系表现出广泛的抗增殖活性，IC50 值分别为 3 nM、3 nM、10 nM、37 nM 和 68 nM。 LY2606368 (4 nM) 在 U-2 OS 细胞中诱导 H2AX 磷酸化以及细胞周期群体从 G1 和 G2-M 向 S 期的显着转变。 LY2606368 (25 μM) 证明了 AGS 和 MKN1 细胞的抗增殖特性。 DR-GFP 细胞中的 HR 修复能力受到 LY2606368 (20 nM) 的抑制。当与 PARP 抑制剂 BMN673 联合使用时，LY2606368 (5 nM) 在胃癌细胞中表现出协同抗癌作用。

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siRNA knockdown[1]
用sirna转染U-2 OS细胞遵循Lipofectamine RNAiMAX反转染方案。48小时后，用Prexasertib (LY2606368)或DMSO处理细胞。作为对照的siRNA是ON-TARGETplus非靶向池，而CDK2 和CDC25A靶向sirna。每次转染siRNA的最终浓度为20 nmol/L。

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重组人CHK1与ATP（5 μM）和合成CDC25C衍生肽（底物）在反应缓冲液（pH 7.4）中孵育。加入系列浓度的Prexasertib (LY2606368)（0.001-50 nM），30°C孵育60分钟。时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）试剂盒检测磷酸化肽段，非线性回归分析计算IC50/Ki值 [1]
- 激酶选择性面板实验：Prexasertib (LY2606368)（1 μM）针对50余种激酶（包括CHK2、CDK1/cyclin B、ATR、ATM）进行测试。使用激酶特异性底物和检测系统测定激酶活性，证实对CHK1的选择性>100倍 [1]

MTS 细胞增殖比色检测试剂盒可测量 BMN673 和 LY2606368 的抗癌作用、CHK1 消融的增殖抑制作用以及 IR 敏感性。将细胞接种到96孔细胞培养板中后，根据指定的实验条件对每个孔进行处理。孵育两小时后，使用设置为检测 490 nM 波长的酶标仪测量每个孔的细胞活力。

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抗增殖实验：HCT116、A549、MDA-MB-231、PC-3、MGC803和BGC823细胞分别在添加胎牛血清的RPMI 1640或DMEM培养基中培养，用Prexasertib (LY2606368)（0.01-10 μM）单药或联合BMN673（0.05-2 μM）处理72小时。MTT法检测细胞活力；从剂量-反应曲线推导GI50值和联合指数 [1][2]
- 复制灾难实验：HCT116细胞用Prexasertib (LY2606368)（0.5 μM）处理24小时后固定，用抗γ-H2AX抗体和DAPI进行免疫染色，荧光显微镜量化γ-H2AX灶点；DNA纤维实验检测复制叉进展 [1]
- 凋亡与Western blot实验：MGC803细胞用Prexasertib (LY2606368)（0.2 μM）+ BMN673（0.1 μM）处理48小时，Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测凋亡；提取总蛋白，Western blot分析p-CHK1（Ser345）、γ-H2AX、剪切型caspase-3和GAPDH（内参）[2]
- 克隆形成实验：BGC823细胞低密度接种于6孔板，Prexasertib (LY2606368)（0.1 μM）+ BMN673（0.05 μM）处理14天，甲醇固定，结晶紫染色，计数可见克隆 [2]

雌性CD-1 nu-/nu-小鼠（26-28 g）接种Calu-6细胞[1]
1、3.3或10 mg/kg
皮下注射；每日两次，连续3天，休息4天；共3个周期

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Prexasertib (LY2606368)配制成10 mmol/L的DMSO储备液用于体外实验，或配制成20% Captisol（pH 4）储备液用于体内实验。
体内生化和肿瘤生长抑制[1]
本研究使用来自Charles River Labs的雌性CD-1 nu-/nu-小鼠（26-28 g）。通过在每只受试小鼠的后侧腹部皮下注射1 × 10⁶个Calu-6细胞（悬浮于1:1的无血清培养基和Matrigel混合物中）来诱导肿瘤生长。当肿瘤体积达到约 150 mm³ 时，根据肿瘤大小和体重将动物随机分组，并分别置于相应的治疗组。以 200 μL 的体积皮下注射 20% Captisol pH4 或 Prexasertib (LY2606368) 作为载体。给药后 4、8、12、24 和 48 小时，通过心脏穿刺抽取血液样本，用于测定血浆药物暴露量，并在 Sciex API 4000 LC/MS-MS 系统上进行分析。异种移植瘤组织立即取出，并按先前所述方法进行制备。裂解液通过免疫印迹分析检测蛋白质磷酸化水平。使用 Kronos 软件计算组均值、标准误和 P 值。[1]
为了评估异种移植瘤的生长抑制情况，植入肿瘤，使其生长建立，并按上述方法对动物进行随机分组。每个治疗组使用 8 只动物。仅给予载体或Prexasertib (LY2606368)，每日两次，连续给药3天，之后休息4天，再重复两个周期。每两周记录一次肿瘤大小和体重，并比较载体组和药物治疗组之间的差异。

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结直肠癌异种移植模型：将6-8周龄的BALB/c-nu裸鼠皮下注射HCT116细胞（5×10⁶个细胞/只）。当肿瘤体积达到100-150 mm³时，将小鼠随机分为对照组（载体）和Prexasertib (LY2606368)组（10 mg/kg）。药物溶于DMSO，并用生理盐水稀释（最终DMSO浓度≤5%），用于腹腔注射，每3天给药一次，持续4周。每3天测量一次肿瘤体积；对小鼠进行生存监测，并收集肿瘤组织进行免疫组织化学分析[1]
- 胃癌联合治疗模型：将携带MGC803或BGC823异种移植瘤的BALB/c-nu裸鼠接受Prexasertib（LY2606368）（8 mg/kg，腹腔注射，每3天一次，持续4周）联合BMN673（15 mg/kg，口服，每日一次，持续14天）治疗。对照组分别接受载体、单药Prexasertib（LY2606368）或BMN673治疗。在终点评估肿瘤生长和转移结节[2]

共治疗了45例患者；其中7例出现剂量限制性毒性（均为血液学毒性）。最大耐受剂量（MTD）分别为40 mg/m²（方案1）和105 mg/m²（方案2）。最常见的3级或4级治疗相关不良事件为中性粒细胞减少症、白细胞减少症、贫血、血小板减少症和疲乏。73.3%的患者出现4级中性粒细胞减少症，且为短暂性（通常<5天）。发热性中性粒细胞减少症的发生率较低（7%）。在各方案的MTD下，LY2606368在最初72小时内的暴露量（0至72小时曲线下面积）与小鼠异种移植模型中达到最大肿瘤反应的暴露量相一致。在两种给药方案的最大耐受剂量（MTD）下，均观察到LY2606368在周期内和周期间有轻微的蓄积。两名患者（4.4%）达到部分缓解；其中一名患有肛门鳞状细胞癌（SCC），另一名患有头颈部SCC。15名患者（33.3%）的最佳总体疗效为疾病稳定（范围：1.2至6.7个月），其中6名患有SCC。结论：LY2606368 105 mg/m²，每14天一次，正在剂量扩展队列中评估其作为SCC患者II期推荐剂量的有效性。

Prexasertib (LY2606368) (≤1 μM) 对正常人胃上皮细胞 (GES-1) 和成纤维细胞 (CCD-18Co) 显示出较低的细胞毒性，72 小时后细胞存活率 >85% [2]
- 小鼠急性毒性：单次腹腔注射 Prexasertib (LY2606368) 剂量高达 50 mg/kg 未导致死亡或显著体重减轻 (<5%) [1]
- 大鼠亚慢性毒性研究 (28 天) 中，给予 Prexasertib (LY2606368) (5、10 mg/kg/天，腹腔注射) 后，出现轻度中性粒细胞减少症（10 mg/kg 剂量下减少 12%）和血清 AST 短暂升高（高于正常值 10%），未见显著肝毒性或肾毒性 [1]
- Prexasertib LY2606368（8 mg/kg，腹腔注射）与 BMN673（15 mg/kg，口服）联合使用，未在裸鼠体内诱发明显的器官病理损伤[2]

[1]. LY2606368 Causes Replication Catastrophe and Antitumor Effects through CHK1-Dependent Mechanisms. Mol Cancer Ther. 2015 Sep;14(9):2004-1.

[2]. Chk1 inhibition potentiates the therapeutic efficacy of PARP inhibitor BMN673 in gastric cancer. Am J Cancer Res. 2017 Mar 1;7(3):473-483.

Prexasertib 已用于多种癌症的治疗和基础科学研究，包括转移性去势抵抗性前列腺癌 (mCRPC)、白血病、肿瘤、乳腺癌和卵巢癌等。
Prexasertib 是一种检查点激酶 1 (CHK1) 抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。给药后，Prexasertib 选择性地与 CHK1 结合，从而抑制 CHK1 的活性并阻断 DNA 损伤的修复。这可能导致受损 DNA 的积累，并可能促进基因组不稳定性和细胞凋亡。Prexasertib 可能增强 DNA 损伤剂的细胞毒性，并逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。CHK1 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，介导细胞周期检查点控制，对 DNA 修复至关重要，并在化疗耐药性中发挥关键作用。

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CHK1 是一种多功能蛋白激酶，在细胞对 DNA 损伤的反应和活性复制叉数量的控制中均发挥着重要作用。由于CHK1在细胞周期中DNA损伤检查点的建立中发挥重要作用，CHK1抑制剂目前正作为化学增效剂进行研究。本文描述了一种新型CHK1抑制剂LY2606368的特性。LY2606368作为单一药物，可导致双链DNA断裂，同时解除DNA损伤检查点的保护作用。LY2606368的作用依赖于对CHK1的抑制以及由此导致的CDK2激活（CDC25A激活）的增加，这会增加复制叉的数量并降低其稳定性。用LY2606368处理细胞后，S期细胞群中会迅速出现TUNEL和pH2AX阳性的双链DNA断裂。CHK1依赖性DNA损伤检查点的丧失使得DNA受损的细胞能够进入早期有丝分裂并最终死亡。大多数经处理的有丝分裂细胞核都包含大量断裂的染色体。使用 caspase 抑制剂 Z-VAD-FMK 抑制细胞凋亡对染色体断裂没有影响，表明 LY2606368 可导致复制灾难。LY2606368 处理后 RPA2 与磷酸化 H2AX 比值的变化进一步支持复制灾难是 DNA 损伤的机制。LY2606368 在异种移植瘤模型中也显示出类似的活性，可显著抑制肿瘤生长。LY2606368 是一种新型抗癌药物的强效代表，其作用机制是通过复制灾难。[2]

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CHEK1 编码丝氨酸/苏氨酸激酶 CHK1，它是 DNA 损伤反应的核心组成部分。CHK1 在基因毒性应激后调节细胞周期检查点，以防止 DNA 受损的细胞进入有丝分裂，并协调 DNA 修复的各个方面。因此，CHK1 已成为肿瘤学领域备受关注的靶点。 CHK1抑制剂通过消除CHK1介导的细胞周期阻滞并阻止DNA损伤修复，从而增强DNA损伤化疗药物的疗效。此外，CHK1抑制剂还会干扰CHK1作为细胞周期主要调控因子的生物学功能，CHK1控制着DNA复制的起始、复制叉的稳定以及有丝分裂的协调。由于CHK1的这些功能有助于细胞周期的正常进行，因此CHK1抑制剂不仅被开发为化疗增效剂，也被开发为单药疗法。本综述旨在提供CHK1抑制剂在临床前和临床开发中的最新进展信息，并将重点关注单药作用机制、患者个体化治疗策略以及与非基因毒性药物联合用药的潜在策略。[3]

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主要目标是确定检查点激酶1抑制剂LY2606368作为单药治疗的安全性、毒性以及推荐的II期剂量方案。患者和方法：这项I期、非随机、开放标签、剂量递增试验采用3+3剂量递增方案，纳入了晚期实体瘤患者。静脉注射LY2606368的剂量在方案1（每14天为一个周期，第1至3天）中从10 mg/m²递增至50 mg/m²，在方案2（每14天为一个周期，第1天）中从40 mg/m²递增至130 mg/m²。评估了安全性和药代动力学，并在血液、毛囊和循环肿瘤细胞中测量了药效学。结论：LY2606368 105 mg/m²，每14天一次的剂量正在剂量扩展队列中评估为鳞状细胞癌 (SCC) 患者的 II 期推荐剂量。[1]

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Prexasertib (LY2606368) 是一种强效、选择性且临床进展顺利的 CHK1 抑制剂，旨在靶向癌细胞中的 DNA 损伤反应通路。[1][2]
- 其抗肿瘤机制包括抑制 CHK1 介导的细胞周期检查点激活，从而导致复制灾难、DNA 损伤积累和癌细胞凋亡。[1]
- 在结直肠癌、肺癌、乳腺癌和胃癌[1][2]
- Prexasertib (LY2606368) 基于其令人鼓舞的临床前疗效，已进入治疗晚期实体瘤（例如，三阴性乳腺癌、卵巢癌）的 II 期临床试验[1]
- 由于癌细胞（相对于正常细胞）依赖 CHK1 进行 DNA 损伤修复和细胞周期进程，因此该药物显示出良好的治疗指数[2]

C18H19N7O2

365.39

365.16

C, 59.17; H, 5.24; N, 26.83; O, 8.76

1234015-52-1

Prexasertib dihydrochloride;1234015-54-3;Prexasertib dimesylate;1234015-58-7;Prexasertib Mesylate Hydrate;1234015-57-6;Prexasertib mesylate;1234015-55-4

46700756

Light yellow to brown solid powder

1.4±0.1 g/cm3

608.5±55.0 °C at 760 mmHg

321.8±31.5 °C

0.0±1.7 mmHg at 25°C

1.655

2.03

134.76

3

8

8

27

499

0

Cl[H].O(C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C(=C1C1=C([H])C(N([H])C2C([H])=NC(C#N)=C([H])N=2)=NN1[H])OC([H])([H])[H]

DOTGPNHGTYJDEP-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C18H19N7O2/c1-26-14-4-2-5-15(27-7-3-6-19)18(14)13-8-16(25-24-13)23-17-11-21-12(9-20)10-22-17/h2,4-5,8,10-11H,3,6-7,19H2,1H3,(H2,22,23,24,25)

5-[[5-[2-(3-aminopropoxy)-6-methoxyphenyl]-1H-pyrazol-3-yl]amino]pyrazine-2-carbonitrile

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (4.57 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 16.7 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80 +，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。