RO4929097 (RO4929097; R4733; RO04929097)

γ secretase (IC50 = 4 nM); Notch (IC50 = 5 nM); Aβ40 (IC50 = 14 nM)

体外活性：RO4929097 减少 HEK293 细胞中 Aβ 肽分泌到培养基中的量，EC50 为 14 nM。在基于 Notch 细胞的报告基因检测中，RO4929097 强烈抑制 Notch 加工，EC50 为 5 nM。 RO4929097 在无细胞和细胞测定中的效力处于低纳摩尔范围，相对于 75 种其他各种类型的蛋白质（包括受体、离子通道和酶）观察到 >100 倍的选择性（CEREP 小组）。治疗 5 天后，RO4929097 减少了人 NSCLC A549 细胞中 ICN 的产生，从而在组织培养中诱导扁平化且转化较少的肿瘤细胞表型。 RO4929097 阻断人非小细胞肺癌细胞中的 Notch 加工并降低 Notch 转录靶基因 Hes1 的表达。 RO4929097 处理显示 SUM149 中直接 Notch 靶基因 Hes1、Hey1 和 Heyl 的表达减少了 2 至 3 倍，SUM190 细胞中的表达减少了 3.5 至 8 倍。 RO4929097 以剂量依赖性方式适度抑制 SUM149 细胞的生长。相对于媒介物处理的对照，RO4929097 浓度为 1 μM 时，SUM149 细胞的生长抑制为 20%，SUM190 细胞的生长抑制为 10%。 RO4929097 减少 T 细胞产生炎症细胞因子。此外，通过 RO4929097 治疗，TH2 细胞因子优于 TH1 细胞因子。此外，RO4929097 会增加 T 细胞激活诱导的 IL-6 产生。 RO4929097 治疗后，选定的黑色素瘤细胞系显示出 NOTCH 下游效应子 HES1 的下调。检测到原代黑色素瘤细胞系经 RO4929097 处理后形成的黑色素球数量减少。激酶测定：使用 RO4929097 后，使用多种抗 Aβ 抗体和 Origen 1.5 分析仪通过 ECL 测定来测量 Aβ 肽。 4G8 鼠 mAb 结合 Aβ 肽（氨基酸 18-21 内）中紧邻 α-分泌酶裂解位点远端的表位。 G2–10 鼠 mAb 与 γ-分泌酶介导的切割后暴露的 C 末端结合，生成 Aβ40 肽的氨基酸 40。 FCA3542 兔抗体与 γ-分泌酶介导的切割后暴露的 C 末端结合，生成 Aβ42 肽的氨基酸 42。 4G8 mAb 采用生物素-LC-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺-酯进行生物素化。 G2–10 和 FCA3542 抗体用 TAG-N-羟基琥珀酰亚胺酯进行钌酰化。 Aβ(x-40) 可使用生物素化 4G8 和钌酰化 G2–10 进行检测。使用生物素化 4G8 和钌基化 FCA3542 检测 Aβ(x-42)。细胞测定：将原代黑色素瘤细胞系（包括 WM35 和 WM98.1）按每孔 2.5 × 103 个细胞接种在 12 孔培养皿中，一式三份。第二天（第 0 天）更换培养基，添加 DMSO 或 10 μM RO4929097，每 3-4 天更换一次。在指定的时间点，将细胞固定在 10% 福尔马林溶液中，并在 4°C 下储存在 PBS 中。第18-24天，所有板都用结晶紫染色。用 10% 乙酸洗脱颜色后，在 590 nm 处读取光密度。

与载体治疗的动物相比，在 21 天的方案中，每天一次或每天两次向携带 A549 NSCLC 异种移植物的裸鼠口服注射 3 至 60 mg/kg RO4929097，持续 7、14 或 21 天，结果显着抑制肿瘤生长。肿瘤生长抑制值范围为66%至91%。当小鼠按照 7+/14- 方案每天两次用 60 mg/kg RO4929097 治疗时，治疗最初会引起已建立的 A549 肿瘤的消退。在 21 天周期结束时（第 47 天），与载体对照小鼠相比，肿瘤生长预防率仍为 91%。肿瘤生长的抑制作用持续时间较长，可持续长达治疗后 34 天（第 67 天）。第 67 天，这些小鼠再次接受相同剂量的 RO4929097 治疗，进行第二个周期（7 天），直到第 74 天。重要的是，给药完成后，抗肿瘤作用仍然持续。 RO4929097 导致 A549 异种移植模型中与血管生成相关的基因表达减少。相比之下，RO4929097抗性H460a异种移植物在这些基因的表达方面几乎没有变化，强调了RO4929097的体内抗血管生成作用机制。对于 IL6 和 IL8 过表达的肿瘤，RO4929097 不再影响血管生成或肿瘤相关成纤维细胞的浸润。

使用 RO4929097 后，使用 Origen 1.5 分析仪和一系列抗 Aβ 抗体通过 ECL 测定对 Aβ 肽进行定量。 α-分泌酶裂解位点紧邻 4G8 鼠 mAb 结合的 Aβ 肽（氨基酸 18-21 内）表位的远端。 C 末端在 γ-分泌酶介导的裂解产生 Aβ40 肽的氨基酸 40 后暴露，与 G2–10 鼠 mAb 结合。 Aβ42 肽的 C 末端通过 γ-分泌酶介导的裂解产生氨基酸 42，与兔抗体 FCA3542 结合。生物素-LC-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺-酯用于对 4G8 mAb 进行生物素化。使用 TAG-N-羟基琥珀酰亚胺酯，G2-10 和 FCA3542 抗体被钌酰化。生物素化 4G8 和钌基化 G2–10 用于检测 Aβ(x–40)。生物素化 4G8 和钌基化 FCA3542 用于检测 Aβ(x-42)。

以 5 × 10⁴ 细胞的密度接种 IBC 细胞系 SUM149 和 SUM190。 0.1 nM 至 10 μM 的 RO4929097 作为媒介物施用或在第二天逐渐增加剂量。 72小时后对细胞进行胰蛋白酶消化，并使用血细胞计数器对活细胞进行计数。

Mice: Mice treated with RO4929097 are given oral doses of suspensions ranging from 3 to 60 mg/kg RO4929097 in accordance with the prescribed regimens. RO4929097 is dosed at 60 mg/kg/d every other week for 4 weeks (7+/7- × 2 cycles) in the Calu-6 xenograft model. RO4929097 is dosed once daily at 10 mg/kg for 21 days for all other xenograft models. One-way ANOVA, the post hoc Bonferroni t test, and the Mann-Whitney rank-sum test are used to determine statistical analysis. When P ≤ 0.05, differences between groups are deemed significant. A549 tumors from both the vehicle-treated and specific RO4929097-treated groups are taken, processed, and embedded in paraffin for an overnight fix. They are then sectioned at 5 μM and stained with H&E for histopathology evaluation. The histology images were obtained with an Olympus BX51 microscope (×40 objective) mounted on a Nikon DS-Fi1 equipped with the NIS-Elements F2.20 software. Three A549 tumours are flash-frozen for Western blot analysis, one for each of the two groups (7 (60 mg/kg) or 21 days (3 and 30 mg/kg). H-200 antibody is used at a dilution of 1:1,000 to detect collagen type V, and at a dilution of 1:5,000 to detect MFAP5.

[1]. Luistro L, et al. Preclinical profile of a potent gamma-secretase inhibitor targeting notch signaling with in vivo efficacy and pharmacodynamic properties. Cancer Res. 2009, 69(19), 7672-7680.

[2]. Debeb BG, et al. Pre-clinical studies of Notch signaling inhibitor RO4929097 in inflammatory breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat. 2012.

[3]. Huynh C, et al. The novel gamma secretase inhibitor RO4929097 reduces the tumor initiating potential of melanoma. PLoS One. 2011, 6(9), e25264.

C22H20F5N3O3

469.4

469.14

C, 56.29; H, 4.29; F, 20.24; N, 8.95; O, 10.23

847925-91-1

Solid powder

CC(C)(C(=O)NCC(C(F)(F)F)(F)F)C(=O)N[C@H]1C2=CC=CC=C2C3=CC=CC=C3NC1=O

OJPLJFIFUQPSJR-INIZCTEOSA-N

InChI=1S/C22H20F5N3O3/c1-20(2,18(32)28-11-21(23,24)22(25,26)27)19(33)30-16-14-9-4-3-7-12(14)13-8-5-6-10-15(13)29-17(16)31/h3-10,16H,11H2,1-2H3,(H,28,32)(H,29,31)(H,30,33)/t16-/m0/s1

2,2-dimethyl-N-[(7S)-6-oxo-5,7-dihydrobenzo[d][1]benzazepin-7-yl]-N'-(2,2,3,3,3-pentafluoropropyl)propanediamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

Solubility in Formulation 1: ≥ 2.5 mg/mL (5.33 mM) (saturation unknown) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (add these co-solvents sequentially from left to right, and one by one), clear solution.
For example, if 1 mL of working solution is to be prepared, you can add 100 μL of 25.0 mg/mL clear DMSO stock solution to 400 μL PEG300 and mix evenly; then add 50 μL Tween-80 to the above solution and mix evenly; then add 450 μL normal saline to adjust the volume to 1 mL.
Preparation of saline: Dissolve 0.9 g of sodium chloride in 100 mL ddH₂ O to obtain a clear solution.

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Solubility in Formulation 2: ≥ 2.5 mg/mL (5.33 mM) (saturation unknown) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (add these co-solvents sequentially from left to right, and one by one), clear solution.
For example, if 1 mL of working solution is to be prepared, you can add 100 μL of 25.0 mg/mL clear DMSO stock solution to 900 μL of corn oil and mix evenly.

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Solubility in Formulation 3: 2% DMSO+30% PEG 300+5% Tween+ddH2O: 10 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。