HIF-PHD (hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylases) (Ki = 5.3 nM)

缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶（PHDs）抑制剂稳定缺氧诱导因子α，通过缺氧反应元件增加促红细胞生成素（EPO）的表达。因此，PHDs抑制剂已被开发为治疗贫血的新型药物。在这里，我们描述了TP0463518，2-[[1-[[6-（4-氯苯氧基）吡啶-3-基]甲基]-4-羟基-6-氧代-2,3-二氢吡啶-5-羰基]氨基]乙酸的体外和体内药理学特征，这是一种新型的强效PHDs抑制剂。TP0463518以5.3 nM的Ki值竞争性抑制人PHD2。TP0463518还抑制了人PHD1/3，IC50值为18和63 nM，以及猴子PHD2，IC50值是22 nM。

---

抑制PHDs活性[1]
如前所述，当HIF1α肽用作底物时，TP0463518对人和大鼠PHD2的IC50值分别为13和18 nM（Hamada等人，2018）。为了阐明TP0463518的抑制作用，我们使用HIF1α肽评估了人PHD1和PHD3的IC50值。TP0463518抑制PHD1，IC50值为18 nM（表1）。尽管TP0463518也抑制PHD3，但IC50值比PHD1/2高3.5倍和4.8倍。当使用HIF2α肽作为底物时，TP0463518以与使用HIF1α肽作为基质获得的效力相当的效力抑制了所有PHD。还研究了其他物种的抑制特征。TP0463518抑制猴子PHD2，IC50值为22nM。 为了阐明抑制模式，在每种TP0463518浓度下测量了最大活性和Km值。对于0、20和40 nM的TP0463518，最大活性（mP值）分别为46、47和47。在没有TP0463518的情况下，Km值为0.10μM，而在20和40 nM的TP0463558的情况下分别为0.32和0.61μM，表明存在竞争性抑制。使用双倒数图证实了竞争性抑制（图2）。基于竞争性抑制，TP0463518的Ki值计算为5.3 nM。

在正常小鼠和大鼠中，TP0463518分别在5和20mg/kg的剂量下显著提高了血清EPO水平。小鼠血清EPO和血清TP0463518水平的相关系数分别为0.95和0.92。TP0463518还以10mg/kg的剂量增加了5/6肾切除慢性肾病模型大鼠的血清EPO水平，血清EPO和血清TP0463558水平的相关系数为0.82。最后，研究了TP0463518对猴子的影响。TP0463518迅速被移除，半衰期为5.2小时，并在5 mg/kg的剂量下增加了EPO的曲线下面积（AUC）。EPO和TP0463528水平也存在相关性。这些结果表明，TP0463518诱导内源性EPO具有很强的药代动力学-药效学相关性，可能有助于肾性贫血患者理想的血红蛋白控制。1.

---

TP0463518对健康啮齿动物血清EPO水平的影响[1]
接下来，为了阐明TP0463518在啮齿动物中产生EPO的作用，对健康小鼠和大鼠口服单剂量TP0463528。Balb/c小鼠给药后6小时的血清EPO浓度如图3A所示。血清EPO浓度以剂量依赖的方式增加，在5mg/kg或更高的剂量下观察到显著的EPO产生作用。药代动力学-药效学（PK/PD）分析显示，血浆TP0463518浓度与血清EPO水平之间存在极好的相关性，相关系数为0.95（图3B）。

---

TP0463518对CKD模型大鼠血清EPO水平的影响[1]
为了研究TP0463518在CKD模型中产生EPO的作用，将TP0463528施用于5/6 Nx大鼠。与SD大鼠一样，在获得最大血清EPO浓度时评估血清EPO水平。在10mg/kg或更高的剂量下，血清EPO水平以剂量依赖的方式显著升高（图5A）。血清TP0463518浓度也与血清EPO浓度密切相关（图5B）。当血清TP0463518浓度相同时，5/6 Nx大鼠的血清EPO浓度与SD大鼠相当（图4B和图5B）。

---

TP0463518对猴子血清EPO水平的影响[1]
最后，在猴子（猕猴）身上研究了TP0463518的效果。血浆TP0463518浓度在施用20mg/kg TP0463528后1.6小时达到峰值，然后在分配阶段迅速下降（图6A）。消除阶段的T1/2为5.2小时。所有给药组的血清EPO浓度在给药后8小时达到峰值，然后在24小时下降（图6B）。当剂量达到或超过5mg/kg时，血清EPO AUC显著增加（图6C）。血清EPO AUC与血浆TP0463518 AUC相关（图6D）。

---

已知脯氨酰羟化酶（PHD）1/2/3泛抑制剂可能诱导肾脏和肝脏产生促红细胞生成素（EPO）。2-[1-[[6-（4-氯苯氧基）吡啶-3-基]甲基]-4-羟基-6-氧代-2,3-二氢吡啶-5-羰基]氨基]乙酸（TP0463518）是一种新型的PHD 1/2/3 pan抑制剂；然而，TP0463518给药后EPO产生的主要来源仍有待调查。我们通过测量正常和双侧肾切除大鼠的缺氧诱导因子2α（HIF-2α）、EPO mRNA和血清EPO水平，研究了TP0463518在诱导肾脏和肝脏产生EPO方面的作用。此外，我们还研究了肝脏来源的EPO是否改善了5/6肾切除（5/6Nx）大鼠的贫血。TP0463518几乎没有增加肾皮质中HIF-2α和EPO mRNA的表达水平，而口服40mg/kg的TP0463558显著增加了健康大鼠肝脏中HIF-2β水平，从0.27 fmol/mg增加到1.53fmol/mg，EPO mRNA表达水平增加了1300倍。以20mg/kg的剂量给药TP0463518后，整个肝脏中EPO mRNA的总表达水平是整个肾脏的22倍。在双侧肾切除的大鼠中，TP0463518在20 mg/kg的剂量下将血清EPO浓度从0提高到180 pg/ml。此外，重复服用10 mg/kg的TP0463528在第7天增加了5/6 Nx大鼠的网织红细胞计数，并在第14天提高了血红蛋白水平。本研究表明，TP0463518特异性诱导肝脏产生EPO并改善贫血。TP0463518的特征不仅可以更详细地了解红细胞生成中的PHD-HIF2α-EPO通路，而且可以为肾性贫血提供新的治疗选择。意义陈述：已知脯氨酰羟化酶（PHD）1/2/3泛抑制剂可能诱导肾脏和肝脏产生促红细胞生成素（EPO）；然而，它们对肾脏EPO产生的影响已被证明因实验条件而异。作者发现，2-[[1-[[6-（4-氯苯氧基）吡啶-3-基]甲基]-4-羟基-6-氧代-2,3-二氢吡啶-5-羰基]氨基]乙酸（TP0463518），一种PHD 1/2/3 pan抑制剂，特异性诱导肝脏产生EPO，并且肝脏衍生的EPO在药理学上有效。对TP0463518作用的研究可能为开发肾性贫血患者的新治疗方案铺平道路[2]。

酶法测定[1]
使用荧光偏振进行PHDs抑制研究。将FITC-HIF和2-酮戊二酸与酶溶液在反应缓冲液（20mM Tris-HCl[pH 7.5]，5mM KCl，1.5mM MgCl2，10μM硫酸亚铁，2mM抗坏血酸，1 mM DTT）与或不与不同浓度的TP0463518混合。FITC-HIF和2-酮戊二酸的浓度是每种酶Km值的两倍。反应温度为30°C，对每种PHD酶的反应时间进行优化，以获得初始速度（9-20分钟）。在反应结束时，将含有20mM EDTA和抗羟基化HIF抗体（Cell Signaling Technology，股份有限公司）的终止溶液加入到反应缓冲液中。然后，荧光（例如：480纳米，电磁：535nm）使用EnVision（PerkinElmer Japan Co.，有限公司）测量以计算毫极化（mP）值。mP值和相应的羟基化HIF浓度成正比，因此我们使用mP值作为活性。IC50值使用SAS 9.2版（日本东京SAS研究所）使用非线性最小二乘法计算。 为了确定抑制模式，用不同浓度的2-酮戊二酸（0.025-8μM）和TP0463518（0-40μM）测量了PHD2的活性。然后比较了每种TP0463518浓度对应的表观Vmax和Km。使用双倒数图确认了抑制模式。Ki值根据抑制模式计算（SAS 9.2）。

血清EPO的测定[1]
根据制造商手册，使用市售的EPO ELISA试剂盒测量小鼠、5/6 Nx大鼠和猴子的血清EPO水平，并稍作修改。使用夹心免疫测定系统测量健康大鼠的血清EPO水平。BioLegend和Meso Scale Diagnostics的大鼠EPO浓度被证实具有可比性。低于检测限的EPO水平被计算为零。

---

血浆/血清TP0463518浓度的测定[1]
使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测量TP0463518的血浆/血清浓度，该质谱由LC-30AD HPLC系统和Triple Quad 5500质谱仪组成。

9周龄Balb/c小鼠被随机分为载体组和TP0463518（5–40 mg/kg剂量）组。小鼠经口给予0.5%甲基纤维素或TP0463518给药混悬液。给药6小时后，在深度麻醉下从眼眶静脉丛采集血液，并在不唤醒的情况下实施安乐死。取一部分血液与EDTA混合，剩余血液样本在室温下静置15分钟。然后将样本离心（2130×g，4℃，10分钟）以制备血浆和血清。
在健康大鼠研究中，7周龄SD大鼠（日本SLC公司）被随机分为载体组和TP0463518（1.25–160 mg/kg剂量）组。为了构建慢性肾脏病（CKD）模型，日本SLC公司制备了5/6肾切除的SD大鼠（5/6 Nx）。具体方法如下：4周龄时切除左肾三分之二，5周龄时切除右肾。随后将大鼠转移至本实验室饲养至10周龄，此时大鼠已出现贫血症状。为确保各组全血血红蛋白水平的方差和均值无不平衡，将大鼠随机分为溶剂对照组和TP0463518 2.5–80 mg/kg剂量组。SD大鼠和5/6 Nx大鼠均经口给予0.5%甲基纤维素溶液或TP0463518给药混悬液。给药后8小时（SD大鼠）或4小时（5/6 Nx大鼠），从尾静脉采集约0.6 mL血液。血清样本的制备方法与小鼠相同。
8只猴子（9-12岁食蟹猴）在给药前禁食16小时，给药后8小时恢复喂食。分别于给药前（0）和给药后0.5、1、2、4、8、12和24小时，从头静脉或股静脉采集血液。在所有时间点制备血浆样本，并在给药后0、4、8、12和24小时制备血清样本。每周重复实验，TP0463518剂量从0（溶剂对照）递增至20 mg/kg。

TP0463518 在猴子体内的半衰期 (T1/2) 为 5.2 小时。该值与根据大鼠和犬的药代动力学参数预测的人体 T1/2 值 1.3–5.6 小时非常接近（Hamada 等，2018）。5 小时的 T1/2 可能已足够，因为在猴子研究中，2.5 mg/kg（有效剂量 20 mg/kg 的八分之一）无效。基于这些结果，目前正在进行 TP0463518 的临床试验，该药物为每日一次给药方案。由于 PHD 抑制剂可调节多种基因表达，我们认为有必要关注其作用机制相关的副作用，尤其是 VEGF 诱导。在达普司他（daprodustat）中，其抑制活性接近TP0463518，且制剂为每日一次给药，但VEGF的变化趋势并不明显（Holdstock等，2016；Akizawa等，2017）。为了安全地开展临床试验，我们在首次人体试验中，对健康志愿者进行了剂量滴定和VEGF监测。[1]

[1]. TP0463518, a novel inhibitor for hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylases, increases erythropoietin in rodents and monkeys with a good pharmacokinetics-pharmacodynamics correlation. Eur J Pharmacol. 2018 Nov 5;838:138-144.

[2]. TP0463518, a Novel Prolyl Hydroxylase Inhibitor, Specifically Induces Erythropoietin Production in the Liver. J Pharmacol Exp Ther. 2019 Dec;371(3):675-683.

PHD抑制剂通过抑制HIFα羟基化来保护HIFα免受蛋白酶体降解（Schmid和Jelkmann，2016）。随后，位于HIF反应元件下游的Epo表达上调，诱导造血（Haase，2006；Percy等，2008）。近年来，PHD抑制剂已在临床研究中用于改善肾性贫血，一些公司也报道了一系列临床概念验证结果（Akizawa等，2017；Martin等，2017；Provenzano等，2016）。TP0463518是一种甘氨酰胺类PHD抑制剂（Hamada等，2018），目前正在进行临床试验。本报告总结了TP0463518在体外和体内研究中的特性。TP0463518抑制了HIF1α上的所有人类PHD1/2/3，并且也抑制了大鼠和猴的PHD2。TP0463518是2-酮戊二酸的竞争性抑制剂，其对人类PHD2的Ki值为5.3 nM。这些结果表明，TP0463518的效力与目前正在进行III期临床试验的达普司他（daprodustat）相似（Ariazi等，2017）。TP0463518对PHD3的IC50值分别是对PHD1/2的3.5倍和4.8倍，表明TP0463518对PHD1/2具有更高的抑制活性。尽管TP0463518对PHD1/2具有选择性，但其在猴子体内的Cmax远高于IC50值（例如，人PHD3的IC50为63 nM，而人PHD3的IC50为27 ng/mL），因此TP0463518被认为能够抑制所有PHD。当底物为HIF2α时，TP0463518也能抑制PHD2。由于HIF2α在EPO生成中发挥重要作用（Appelhoff等，2004；Kapitsinou等，2010），因此，研究人员随后开展了体内研究，以探讨TP0463518对EPO生成的影响。[1]
TP0463518在健康小鼠和大鼠中分别以5 mg/kg和20 mg/kg的剂量显示出显著的EPO诱导作用，且具有良好的药代动力学/药效学相关性。在肾性贫血中，缺氧刺激下促红细胞生成素（EPO）的产生受损。为了研究TP0463518在肾性贫血模型动物中的EPO诱导作用，我们对5/6肾切除（5/6 Nx）大鼠进行了TP0463518给药。结果显示，TP0463518能够诱导EPO的产生，且具有显著的药代动力学/药效学（PK/PD）相关性。在相同给药剂量下，5/6 Nx大鼠的血清EPO浓度与健康SD大鼠相当。5/6 Nx大鼠肾脏中产生EPO的细胞（REP）数量估计约为健康SD大鼠的六分之一。因此，我们推测，无论残余肾脏的多少，TP0463518给药后血清EPO水平升高至一定水平可能存在某种机制。以下三种可能性可以解释这些机制。 [1]
首先，TP0463518 使 5/6 肾切除 (Nx) 大鼠残余受损肾脏中的 EPO 生成水平提高了约 6 倍。据报道，在 EPO 生成细胞中缺乏 PHD1/2/3 的基因敲除小鼠中，当建立单侧输尿管梗阻时，受损肾脏中的 EPO mRNA 水平高于健康肾脏（Souma 等，2016）。该论文指出，在转化前为 REP 细胞的肌成纤维细胞具有响应 PHD 缺乏而表达 EPO 的能力。因此，在我们的实验中，5/6 Nx 大鼠受损的 REP 细胞可能比正常的 REP 细胞产生更多的 EPO。[1]
第二种可能性是，TP0463518 在 5/6 Nx 大鼠的缺氧条件下诱导了更多的 EPO。一篇论文报道，缺氧和铁螯合剂环吡咯烷酮（CPX）通过EPO HRE协同增强报告基因的表达（Wanner等，2000）。铁螯合剂从酶中夺取铁，似乎抑制了反应的第一步（Hoffart等，2006）。TP0463518与2-酮戊二酸竞争，似乎也抑制了反应的第一步。因此，与CPX的情况类似，我们预期TP0463518和缺氧在我们的实验中也会产生协同效应。[1]
最后，TP0463518可能在不增加肾脏EPO生成的情况下增加肾外EPO的生成。已知肝脏特异性PHD1/2/3三重敲除小鼠的肝脏EPO生成增加（Minamishima和Kaelin，2010）。 TP0463518 是一种 PHD1/2/3 泛抑制剂，但对 PHD3 的抑制效力略弱。在这种情况下，TP0463518 无法到达 REP 细胞，因为肾脏中 EPO 的产生是通过单独抑制 PHD2 而上调的（Takeda 等，2008）。我们目前正在研究哪个器官是 EPO 的主要来源，所有这些可能性都将在未来的研究中进行探讨。[1]
接下来，我们在食蟹猴（Macaca fascicularis）中研究了 TP0463518 的促 EPO 生成作用。血清 EPO 的 AUC 与血浆 TP0463518 的 AUC 呈正相关，并且在 5 mg/kg 或更高剂量下显著增加。EPO 的 AUC 而非 EPO 的 Cmax 是提高血红蛋白水平的关键因素（Masunaga 等，1989）。由于高血红蛋白水平会增加心血管疾病和中风的风险（Pfeffer等，2009；Singh等，2006），因此控制EPO的AUC对于维持足够的血红蛋白水平至关重要。与外源性促红细胞生成剂不同，由于PHD抑制剂能够调节内源性EPO水平，因此其药代动力学/药效学（PK/PD）相关性越强，越有利于血红蛋白水平的控制。既往研究表明，用于治疗贫血患者的高剂量重组EPO（远超正常生理范围）可能会增加心血管事件的风险，且这种风险与血压升高无关（Szczech等，2008；Inrig等，2012）。在我们的猴子实验中，给予20 mg/kg剂量的重组EPO后，血清EPO水平升高至60 mU/mL。这种增加与在高海拔地区观察到的内源性EPO的生理性增加相当（Klausen等人，1996），并且足以在每日一次给药后改善猴子和人类的贫血（Akizawa等人，2017；Flamme等人，2014；Holdstock等人，2016）。正如Flamme等人所讨论的，促红细胞生成素治疗会导致血清EPO浓度超过正常生理范围，存在长期安全性问题，而使用PHD抑制剂的治疗可能不需要如此高的EPO暴露量。因此，TP0463518能够诱导有效水平但不会超过正常生理范围的EPO，因此在改善贫血的同时，其心血管事件风险低于重组EPO。 [1]
系统性条件性敲除PHD2可提高血清VEGF浓度（Takeda等，2007）。为了减少机制相关的不良反应，PHD抑制剂的无效作用时间被认为至关重要。TP0463518在猴子体内的半衰期（T1/2）为5.2小时。该值与根据大鼠和犬的药代动力学参数预测的人类T1/2值1.3-5.6小时非常接近（Hamada等，2018）。5小时的T1/2可能是一个足够的时间，因为在猴子研究中，2.5 mg/kg（有效剂量20 mg/kg的八分之一）无效。基于这些结果，目前正在进行TP0463518的临床试验，该药物为每日一次给药方案。由于PHD抑制剂调控多种基因表达，我们认为有必要关注其作用机制相关的副作用，尤其是VEGF诱导。在达普司他（daprodustat）中，其抑制活性与TP0463518相近，且每日仅需给药一次，但VEGF的变化趋势并不明显（Holdstock等，2016；Akizawa等，2017）。为了安全地开展临床试验，我们在首次人体试验中，对健康志愿者进行了剂量滴定和VEGF监测。[1] 高血压是促红细胞生成治疗中常见的副作用。由于TP0463518诱导的EPO水平未超过正常生理范围，我们认为高血压的风险较低。事实上，在vadadustat的II期临床研究中，并未观察到血压变化趋势。vadadustat可诱导EPO水平不超过正常生理范围（Martin等，2017；Pergola等，2016）。而daprodustat的效力接近TP0463518，仅在少数患者中观察到高血压（Akizawa等，2017）。即将有报道称，TP0463518单次给药后不影响包括血压在内的生命体征（Shinfuku等，2018）。基于这些信息，我们认为TP0463518引起高血压的风险较低。尽管如此，我们计划在未来的临床试验中密切监测血压。[1]
总之，TP0463518可竞争性抑制人PHD，并抑制大鼠和猴的PHD2。 TP0463518不仅能提高健康啮齿动物的血清EPO水平，还能提高贫血大鼠和猴子的血清EPO水平。在所有受试动物中，血清EPO浓度与TP0463518的暴露量均呈显著正相关。目前，TP0463518正在进行一项每日一次给药方案的临床试验，未来将公布TP0463518的临床概念验证结果。TP0463518有望成为肾性贫血患者轻松控制血红蛋白水平的一种新的治疗选择。

C20H18CLN3O6

431.826424121857

431.088

C, 55.63; H, 4.20; Cl, 8.21; N, 9.73; O, 22.23

1558021-37-6

1558021-37-0

73052863

Light yellow to yellow solid powder

2.8

129

3

7

7

30

692

0

ClC1C=CC(=CC=1)OC1=CC=C(C=N1)CN1C(C(C(NCC(=O)O)=O)=C(CC1)O)=O

HMMHKGLPKAQOOH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H18ClN3O6/c21-13-2-4-14(5-3-13)30-16-6-1-12(9-22-16)11-24-8-7-15(25)18(20(24)29)19(28)23-10-17(26)27/h1-6,9,25H,7-8,10-11H2,(H,23,28)(H,26,27)

2-[[1-[[6-(4-chlorophenoxy)pyridin-3-yl]methyl]-4-hydroxy-6-oxo-2,3-dihydropyridine-5-carbonyl]amino]acetic acid

TP0463518; 1558021-37-6; 2-(1-((6-(4-Chlorophenoxy)pyridin-3-yl)methyl)-4-hydroxy-2-oxo-1,2,5,6-tetrahydropyridine-3-carboxamido)acetic acid; V65GPE6NTB; 2-[[1-[[6-(4-chlorophenoxy)pyridin-3-yl]methyl]-4-hydroxy-6-oxo-2,3-dihydropyridine-5-carbonyl]amino]acetic acid; TP-0463518; (1-((6-(4-Chlorophenoxy)pyridin-3-yl)methyl)-2,4-dioxopiperidine-3-carbonyl)glycine; 2-((1-((6-(4-Chlorophenoxy)pyridin-3-yl)methyl)-4-hydroxy-6-oxo-2,3-dihydropyridine-5-carbonyl)amino)acetic acid;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 125 mg/mL (~289.47 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.82 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.82 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.82 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。