sPLA2/secretory phospholipase A2 (IC50 = 9 nM)

在两个时间间隔的细胞裂解物中观察到的 RA 诱导的 MUC16 蛋白升高完全被Varespladib (LY-315920)（10 μM；24 和 48 小时；HCjE 细胞）疗法所抑制 [2]。用 Varaspladib（10 μM；24 和 48 小时；HCjE 细胞）治疗可显着减少 RA 产生的 MUC16 量，24 小时时减少 100%，48 小时时减少 99% [2]。

---

Varespladib（LY-315920）是重组人IIA组非胰腺分泌型PLA2（sPLA2）的强效选择性抑制剂。在显色分离酶测定中，Varespladib（LY-315920）抑制sPLA2活性，IC50为9+/-1 nM或7.3 x 10（-6）摩尔分数，接近该测定的刺激测量极限。Varespladib (LY-315920)的真实效力是通过脱氧胆酸盐/磷脂酰胆碱测定法确定的，摩尔分数为1.5 x 10（-6）。LY315920对人、IB组、胰腺sPLA2的活性低40倍，对细胞质PLA2和环氧化酶的组成型和诱导型没有活性。LY315920抑制了人sPLA2诱导的豚鼠肺支气管肺泡灌洗液细胞释放血栓素A2（TXA2），IC50为0.79微M。N-甲酰基-甲磺酰基-亮酰基-苯丙氨酸或花生四烯酸对这些细胞释放TXA2没有抑制作用。[1]

---

在使用广谱PLA2抑制剂ArA抑制RA诱导的MUC16上调后，我们试图确定IIA组sPLA2的特异性抑制剂Varespladib (LY-315920)是否会影响RA诱导的MUC16表达。我们通过实时PCR检测了HCjE培养物中MUC16 mRNA的表达水平，这些培养物分别用载体（DMSO）、100nM RA、100nM RA+10μmVarespladib（LY-315920）或单独使用10μm Varespladib (LY-315920)处理24和48小时。如图6所示，添加10μm LY315920显著抑制了RA诱导的MUC16表达，24小时时抑制率为100%，48小时时抑制了99%。如图7所示，添加sPLA2 IIA的特异性抑制剂LY315920可完全抑制RA诱导的MUC16蛋白在24（p<0.01）和48（p<0.0001）小时时在细胞裂解物中检测到的增加[2]。

Varespladib (LY-315920)治疗的 IC50 为 0.79 μM，可防止人 sPLA2 诱导的豚鼠肺支气管肺泡灌洗细胞释放血栓素 A2 (TXA2)。 Varespladib (LY-315920) 的 ED50 为 16.1 mg/kg[1]。
在采集支气管肺泡灌洗液细胞前5分钟静脉注射Varespladib（LY-315920），导致sPLA2诱导的TXA2产生受到抑制，ED50为16.1mg/kg。用sPLA2攻击豚鼠肺胸膜条产生收缩反应，这些反应被Varespladib（LY-31592 0）以浓度依赖的方式抑制，表观KB为83+/-14nM。花生四烯酸诱导的收缩反应没有改变。向表达人sPLA2蛋白的转基因小鼠静脉或口服Varespladib（LY-315920），在4小时的时间过程中以剂量相关的方式抑制血清sPLA2活性Varespladib（LY-315920）是一种强效且选择性的sPLA2抑制剂，代表了一类新的抗炎药SPI。该药物目前正在进行临床评估，应有助于确定sPLA2在各种炎症性疾病状态中的作用[1]。

---

ApoE−/−标准模型[3]
对照组或A-002（varespladib methyl/LY333013/S-3013处理组）动物的体重在时间0时相似（赋形剂：27.2±2.6，30mg/kg A-002:26.7±2.3，90mg/kg A-002:37.3±2.5）。在西方饮食的16周内，Vehicle, 30 mg/kga-002（varespladib methyl/LY333013/S-3013和90 mg/kg a-002组）的体重分别增加了约155%、150%和141%（图2）。使用重复测量的双向方差分析，以时间和治疗为变量，两组之间的体重没有统计学上的显著差异。

研究开始时，各组的血浆胆固醇水平没有显著差异。然而，与对照组相比，每天两次服用a-002（varespladib methyl/LY333013/S-3013，剂量为30或90 mg/kg，治疗1个月后，总胆固醇显著降低（图3）。在整个4个月的治疗期间，这种效果保持一致。每次治疗4个月后，赋形剂、30mg/kg A-002和90mg/kg A-002组的血浆胆固醇分别变化了+15%、-10%和-12%（图3）。血浆胆固醇浓度没有明显的剂量反应效应。

A-002（varespladib methyl/LY333013/S-3013）治疗对斑块含量有显著影响，斑块含量以动脉粥样硬化斑块在主动脉管腔表面的占有率表示。载体治疗的小鼠斑块覆盖率约为12.6%±0.7%，而每天两次用30mg/kg A-002治疗的小鼠为6.3%±0.6%，每天两次服用90mg/kg A-002的小鼠为6.7%±0.8%。这表明与仅接受制剂载体的治疗组相比，A-002治疗组的斑块含量显著降低（P<0.05）（图4）。

---

血管紧张素II ApoE−/−模型[3]
血管紧张素II在水中每天两次或在5%阿拉伯胶中每天两次配制，导致主动脉斑块覆盖率相似（分别为18%±3.3%和14.4%±4.8%，图5）A-002（varespladib methyl/LY333013/S-3013（30mg/kg）显著降低了主动脉的斑块覆盖率（8%±3%，而未经药物治疗输注血管紧张素II时为18%±3.3%，P<0.025）。在没有血管紧张素II的情况下，动脉粥样硬化的背景量（3.8%±0.6%，皮下盐水泵和每天两次水）明显低于输注血管紧张素Ⅱ的情况（18%±3.3%，P<0.025）。代表性的人脸图像如图6所示。

评估每组小鼠的主动脉瘤发生率。在未输注血管紧张素II的情况下，未观察到动脉瘤。输注水中配制的血管紧张素II导致25%的动脉瘤发生率，输注阿拉伯胶载体中配制的血管紧缩素II导致22.2%的动脉瘤发病率A-002（varespladib methyl/LY333013/S-3013治疗（30mg/kg，每天两次）在输注阿拉伯胶中配制的血管紧张素II的小鼠中完全预防了动脉瘤的形成（Prob>ChiSq=0.0096）（表1）。

sPLA2抑制[3]
根据其他地方描述的显色方法，测量了Varespladib（LY-315920）/A-001对sPLA2 V和X组酶抑制的内在活性。

---

磷脂酶A2抑制剂治疗[2]
为了研究RA对MUC16的调节是否与sPLA2有关，在如上所述与100 nM RA加100μM ArA（抑制剂或载体（DMSO）单独培养24和48小时的HCjE细胞中，测定了广谱PLA2抑制剂马兜铃酸（ArA）对MUC16mRNA水平的影响。在这些实验之后，测试了IIA组分泌型磷脂酶A2特异性抑制剂Varespladib (LY-315920)的效果。HCjE细胞分别用100nM RA、100nM RA加10μmVarespladib（LY-315920）、抑制剂或载体（DMSO）单独处理24和48小时。分别通过实时PCR和Western blot分析测定MUC16 mRNA和蛋白质水平。两种抑制剂都进行了两次实验，每次实验重复两次。

蛋白质印迹分析[2]
细胞类型： HCjE 细胞
测试浓度： 10 μM
孵育时间： 24 hrs（小时）和48 hrs（小时）
实验结果：在两个时间点均显着抑制RA诱导的MUC16蛋白表达。

---

RT-PCR[2]
细胞类型： HCjE 细胞
测试浓度： 10 μM
孵育时间：24小时和48小时
实验结果：显着抑制RA诱导的MUC16表达，24小时时为100％，48小时时为99％ hrs（小时）。

动物/疾病模型：雄性哈特利豚鼠（300-500 g）[1]
剂量：3 mg/kg、10 mg/kg 和 30 mg/kg
给药途径：静脉注射（药代动力学/PK 研究）
实验结果：观察到支气管肺泡灌洗液中 sPLA2 活性持续受到抑制。降低了人 sPLA2 诱导的豚鼠支气管肺泡灌洗液细胞中 TXA2 的生成。

血浆浓度和剂量选择 [3]
图 1 显示了单次口服 A-002（varespladib methyl/LY333013/S-3013）后血清中 Varespladib (LY-315920)/A-001 的血浆浓度。在 10、30 和 90 mg/kg 剂量下，所有给药小鼠的样本中均可检测到 Varespladib (LY-315920)/A-001。最高两个剂量，即 30 和 90 mg/kg A-002（varespladib methyl/LY333013/S-3013），其血浆中 Varespladib (LY-315920)/A-001 的浓度均高于 IC50 值。在整个给药期间，分别检测了 sPLA2 V 组和 X 组。

---

血浆水平[3]
在 ApoE−/− 小鼠中进行的单剂量实验中，测定了 A-001/Varespladib (LY-315920)（A-002 (varespladib methyl/LY333013/S-3013) 的活性成分）的血浆水平。如上所述，通过灌胃法给动物分别给予 10、30 或 90 mg/kg 的 A-002 (varespladib methyl/LY333013/S-3013)。使用尾部剪取法在不同时间点采集血液样本。收集血浆并储存在 −70°C 下，用于分析 A-001/Varespladib 的存在。采用高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）分析LY-315920。将给药动物的血浆（25 μL）与5 μL 20 μM LY329722（内标）、25 μL异丙醇和50 μL乙腈混合于聚丙烯微量离心管中。涡旋混匀后，于37°C孵育10分钟，然后在室温下以12,000 g离心。取上清液（65 μL）倾入装有430 μL水和5 μL甲酸的800 μL玻璃自动进样器小瓶中。盖紧小瓶，涡旋混匀后置于Surveyor自动进样器中。将样品（25 μL）注入2.1 × 100 mm、5 μm、C8 Discovery反相色谱柱。色谱柱配备一根 2.1 × 4 mm 的 Phenomenex C8 保护柱。初始色谱条件设置为：流动相 A 为 95%（0.1% 甲酸的 5% 异丙醇溶液），流动相 B 为 5%（0.1% 甲酸的乙腈溶液，含 5% 异丙醇）。进样后 1 分钟，采用 6 分钟的梯度洗脱，流动相 B 的比例从 5% 升至 60%，得到 A-002（varespladib methyl/LY333013/S-3013）和内标的保留时间分别为 6.07 分钟和 6.47 分钟。采用电喷雾大气压电离离子阱质谱法检测分析物。毛细管电压为 4.5 kV，毛细管温度为 310°C。氮气鞘流速设置为 75 个任意单位。碰撞诱导解离 (CID) 的优化值为 35%（归一化）。碰撞能量。用于串联质谱检测A-001/Varespladib (LY-315920)和内标的选择性跃迁分别源于氨和一氧化碳自由基的丢失，其m/z分别为381→336和395→350。A-001和内标的峰面积用于计算响应因子，未知样品的响应因子则通过与未给药小鼠混合血浆中添加A-001的线性校准曲线进行插值计算得出。

[1]. Pharmacology of LY315920/S-5920, [[3-(aminooxoacetyl)-2-ethyl-1- (phenylmethyl)-1H-indol-4-yl]oxy] acetate, a potent and selective secretory phospholipase A2 inhibitor: A new class of anti-inflammatory drugs, SPI. J Pharmacol Exp Ther. 1999 Mar;288(3):1117-24.

[2]. Effect of retinoic acid on gene expression in human conjunctival epithelium: secretory phospholipase A2 mediates retinoic acid induction of MUC16. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005 Nov;46(11):4050-61.

[3]. Varespladib (A-002), a Secretory Phospholipase A2 Inhibitor, Reduces Atherosclerosis and Aneurysm Formation in ApoE−/− Mice J Cardiovasc Pharmacol. 2009 Jan;53(1):60-5.

瓦瑞斯普拉地布（Varespladib）属于吲哚类化合物，其结构为1H-吲哚，分别在1、2、3和4位被苄基、乙基、草酰氧基和羧甲氧基取代。它是一种口服分泌型磷脂酶A2抑制剂，具有抗炎作用。它可作为EC 3.1.1.4（磷脂酶A2）抑制剂、抗炎药和解毒剂。它属于吲哚类、苯类、芳香醚类、二羧酸单酰胺类、单羧酸类和伯羧酰胺类化合物。它是varespladib(1-)的共轭酸。
Varespladib已被研究用于治疗和预防镰状细胞病、血管闭塞危象和急性冠脉综合征。

---

LY315920是一种强效、选择性的重组人IIA组非胰腺分泌型PLA2 (sPLA2)抑制剂。在显色分离酶测定中，LY315920抑制sPLA2活性的IC50为9±1 nM或7.3×10⁻⁶摩尔分数，接近该测定的化学计量极限。LY315920的真实效力通过脱氧胆酸/磷脂酰胆碱测定确定，摩尔分数为1.5×10⁻⁶。 LY315920 对人 IB 组胰腺 sPLA2 的活性降低了 40 倍，并且对胞质 PLA2 以及组成型和诱导型环氧合酶均无活性。LY315920 可抑制人 sPLA2 诱导的豚鼠肺支气管肺泡灌洗细胞释放血栓素 A2 (TXA2)，IC50 为 0.79 μM。N-甲酰甲硫氨酰亮氨酰苯丙氨酸或花生四烯酸诱导的这些细胞释放 TXA2 则不受抑制。在收集支气管肺泡灌洗细胞前 5 分钟静脉注射 LY315920，可抑制 sPLA2 诱导的 TXA2 生成，ED50 为 16.1 mg/kg。用 sPLA2 刺激豚鼠肺胸膜条可产生收缩反应，该反应可被 LY315920 以浓度依赖的方式抑制，其表观 KB 值为 83 ± 14 nM。花生四烯酸诱导的收缩反应未受影响。向表达人 sPLA2 蛋白的转基因小鼠静脉或口服 LY315920，可在 4 小时内以剂量依赖的方式抑制血清 sPLA2 活性。LY315920 是一种强效且选择性的 sPLA2 抑制剂，代表了一类新型抗炎药，命名为 SPI。该药物目前正在进行临床评估，有望帮助阐明 sPLA2 在各种炎症性疾病中的作用。[1]

---

目的：维生素 A 如何维持眼表湿润表型尚不清楚。本研究旨在利用基因芯片分析，鉴定眼表上皮细胞中对维生素A有反应的基因。研究对象为用全反式维甲酸（RA）培养的人结膜上皮（HCjE）细胞系。分析结果显示，分泌型磷脂酶A2 IIA组（sPLA2-IIA）是RA上调最显著的基因，其次是膜相关黏蛋白MUC16，但上调时间较晚。由于PLA2家族产生的花生四烯酸产物——类花生酸已被证实能够增加黏蛋白的生成，因此本研究旨在探究sPLA2是否介导RA诱导MUC16的表达。
方法：将HCjE细胞在有或无RA的培养基中培养3、6、24和48小时。从HCjE细胞RNA制备的互补RNA与人基因芯片杂交，并使用商业软件进行分析。通过实时PCR验证了粘蛋白表达的微阵列数据。为了研究sPLA(2)是否与RA诱导的MUC16上调相关，将HCjE细胞与RA和广谱PLA(2)抑制剂马兜铃酸(ArA)或特异性sPLA(2)-IIA抑制剂LY315920孵育，然后通过实时PCR和Western blot分析MUC16 mRNA和蛋白的表达。
结果：加入RA后，在3小时和6小时（早期），有28个转录本上调，6个转录本下调超过2倍（P < 0.01）。在24小时和48小时（晚期），有80个基因转录本上调，45个基因转录本下调。 IIA组sPLA(2)在24小时显著上调，而MUC16是RA处理48小时后上调最显著的RNA。Western blot分析证实了RA对sPLA(2)的上调作用。当HCjE细胞与RA联合ArA或sPLA(2)-IIA特异性抑制剂LY315920孵育时，RA诱导的MUC16 mRNA表达显著降低（P < 0.01）。
结论：RA在后期诱导的膜相关黏蛋白MUC16的上调似乎是通过sPLA(2)-IIA介导的。这种亲水性膜相关黏蛋白的上调可能是维生素A维持眼表湿润表型的重要机制之一。 [2]

---

分泌型磷脂酶 A2 (sPLA2) 酶家族与炎症性疾病和组织损伤（包括动脉粥样硬化）有关。 A-001 是一种通过基于结构的药物设计发现的新型 sPLA2 酶抑制剂，而 A-002（varespladib methyl/LY333013/S-3013）是目前正在进行临床开发的口服生物利用度较高的前药。A-001 可抑制人和小鼠的 sPLA2 IIA、V 和 X 组酶，其 IC50 值在低纳摩尔范围内。在 C57BL/6J 背景中过表达人 sPLA2 IIA 组的转基因小鼠中，A-002（1 mg/kg）可使血清中 A-001 浓度升高，并抑制 PLA2 活性。此外，还使用表面分析法评估了 A-002 对两种 ApoE−/− 小鼠模型动脉粥样硬化的影响。(1) 在高脂饮食模型中，A-002（30 和 90 mg/kg，每日两次，持续 16 周）可降低主动脉粥样硬化程度。动脉粥样硬化程度降低了 50% (P < 0.05)。血浆总胆固醇在 1 个月内显著降低 (P < 0.05)，并在整个研究期间保持较低水平。(2) 在血管紧张素 II 诱导主动脉病变和动脉瘤的加速动脉粥样硬化模型中，A-002（30 mg/kg，每日两次）使主动脉粥样硬化程度降低了约 40% (P < 0.05)，并减轻了动脉瘤的形成 (P = 0.0096)。因此，A-002 能有效显著降低这两种 ApoE−/− 小鼠模型中的总胆固醇、动脉粥样硬化和动脉瘤形成。[3]

C21H20N2O5

380.39

380.137

C, 66.31; H, 5.30; N, 7.36; O, 21.03

172732-68-2

Varespladib sodium;172733-42-5;Varespladib methyl;172733-08-3

155815

White to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

667.9±65.0 °C at 760 mmHg

357.7±34.3 °C

0.0±2.1 mmHg at 25°C

1.630

2.45

111.62

2

5

8

28

589

0

CCC1=C(C2=C(N1CC3=CC=CC=C3)C=CC=C2OCC(=O)O)C(=O)C(=O)N

BHLXTPHDSZUFHR-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C21H20N2O5/c1-2-14-19(20(26)21(22)27)18-15(9-6-10-16(18)28-12-17(24)25)23(14)11-13-7-4-3-5-8-13/h3-10H,2,11-12H2,1H3,(H2,22,27)(H,24,25)

2-((3-(2-amino-2-oxoacetyl)-1-benzyl-2-ethyl-1H-indol-4-yl)oxy)acetic acid

A002; A 002; LY315920; Varespladib; 172732-68-2; LY315920; Varespladib (LY315,920); LY-315,920; S-5920; VAREPLADIB; 2Q3P98DATH; LY-315920; LY 315920; A-002;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (6.57 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: 30% PEG400+0.5% Tween80+5% propylene glycol:30 mg/mL

---

View More

配方 3 中的溶解度: 1.5 mg/mL (3.94 mM) in 17% Polyethylene glycol 12-hydroxystearate in Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。