YM-58483(BTP2)   中文名称: N-(4-(3,5-二(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯基)-4-甲基-1,2,3-噻二唑-5-甲酰胺

Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels; store-operated Ca2+ entry (SOCE)

在不改变 CD11b 和 GFAP 表达的情况下，YM-58483 可以降低 P-ERK 和 P-CREB 的水平。此外，YM-58483 还可抑制肠道 IL-1β、TNF-α 和 PGE2 的产生 [1]。在单向混合溶液反应 (mLR) 中，YM-58483 和环孢菌素 A 均抑制 T 细胞生长，IC50 值分别为 330 和 12.7 nM [2]。 YM-58483 的 IC50 值为 460 和 310 nM，可抑制 RBL-2H3 细胞（梯度碱性稀释细胞系）中 IgE 刺激的白三烯 (LT) 和组胺的合成。 YM-58483 的 IC50 值分别为 125 和 148 nM，还抑制由植物血凝素-P (PHA) 触发的人外周血细胞中 IL-5 和 IL-13 的产生，该机制的效力比泼尼松龙[3]。在用植物血凝素刺激的人全血细胞中，YM-58483 减少用亮氨酸刺激的鼠 Th2 T 细胞克隆 (D10.G4) 中 IL-5 和 IL-4 的产生。 IC50值与已发表的CRAC通道抑制值相似（约100 nM）[4]。

鞘内注射 300 μM（1.5 nmol）和 1000 μM（10 nmol）剂量的 YM-58483 对 SNL 产生强烈的中枢镇痛作用[1]。 YM-58483（1-30 mg/kg，po）和环孢素A（1-30 mg/kg，po）抑制供体抗细胞毒性T（CTL）活性和IFN-γ产生，并减少供体T的量脾脏中的细胞，特别是供体 CD8+ T 细胞。 YM-58483（1-10 mg/kg，口服）和环孢素 A（2、10 mg/kg，口服）可降低绵羊红细胞 (SRBC) 引起的迟发型超敏反应 (DTH) [2]。 M-58483（30 mg/kg，肘部）显着降低卵清蛋白（OVA）致敏豚鼠中卵清蛋白（OVA）诱导的延迟型收缩，而 YM-58483（3-30 mg/kg，面部）和泼尼松龙（100 mg/ kg，面部）显着且完全抑制 OVA 产生的气道高反应性 (AHR) [3]。 YM-58483 缓冲因呼吸进入气道而引起的嗜酸性粒细胞，并降低由棕色挪威苏格兰威士忌中心主动致敏引起的活化气道中的 IL-4 和半胱氨酸泡沫白三烯水平。途径 YM-58483 可防止主动致敏的豚鼠强烈诱导晚期死亡和嗜酸性呼吸[4]。

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YM-58483对神经性疼痛有镇痛作用，但其机制尚不清楚。本实验在大鼠脊髓神经结扎（SNL）诱导的神经性疼痛模型上进行，试图探索YM-58483（BTP2）减弱神经性疼痛的机制。在雄性Sprague-Dawley大鼠中结扎左L5以产生SNL神经性疼痛模型。在鞘内注射YM-58483和赋形剂前后，采用上下法和Hargreaves法测量大鼠的戒断阈值。通过免疫荧光法定位脊髓背角中的SOCCs。Western blot检测脊髓水平磷酸化ERK和磷酸化CREB、CD11b和GFAP蛋白的表达，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α、PGE2）的释放。与对照组+赋形剂相比，鞘内注射300μM（1.5 nmol）和1000μM（10 nmol）的YM-58483对SNL大鼠产生了显著的中枢镇痛作用（n=7，P<0.001）。然而，与生理盐水相比，两者都不能预防神经性疼痛的发展（P<0.001）。免疫荧光染色显示，Orai1和STIM1（SOCCs的两个关键成分）位于脊髓背角神经元中。Western blot显示，YM-58483可以降低P-ERK和P-CREB的水平（n=10，#P<0.05），而不影响CD11b和GFAP的表达（n=10）（#P>0.05）。与对照组+载体相比，YM-58483还抑制了脊髓IL-1β、TNF-α和PGE2的释放（n=5，#P<0.001）。YM-58483的镇痛机制可能是通过抑制神经元中的中枢ERK/CREB信号传导，减少中枢IL-1β、TNF-α和PGE2的释放，从而降低SNL大鼠脊髓背角的神经元兴奋性。[1]

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YM-58483/BTP2是储存操作性Ca2+进入（SOCE）的阻断剂，它调节淋巴细胞等非兴奋细胞的激活YM-58483（BTP2）已被报道可抑制T细胞中细胞因子的产生和增殖，并可作为治疗支气管哮喘的可能候选药物。本研究调查了YM-58483与细胞介导的免疫反应相关的药理学特征和治疗潜力。在小鼠移植物抗宿主病（GVHD）模型中，YM-58483（1-30mg/kg，口服）和环孢菌素A（1-30mmg/kg，口服）抑制了供体抗宿主细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性和IFN-γ产生，还减少了脾脏中供体T细胞的数量，特别是供体CD8+T细胞。YM-58483和环孢菌素A在单向混合淋巴细胞反应（MLR）中抑制T细胞增殖，IC50值分别为330和12.7 nM。此外，YM-58483（1-10mg/kg，口服）和环孢菌素A（2.10mg/kg，口服）抑制了绵羊红细胞（SRBC）诱导的迟发型超敏反应（DTH）。这些结果表明，抑制SOCE可以预防抗原诱导的T细胞反应，这些反应参与了自身免疫性疾病，如自身免疫性肝炎和类风湿性关节炎。[2]

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T细胞在各种免疫和过敏性疾病的发病机制中起着调节作用，包括人类哮喘。最近，有报道称吡唑衍生物YM-58483（BTP2）能有效抑制T细胞中钙（2+）释放激活的钙（CRAC）通道和白细胞介素（IL）-2的产生。我们研究了YM-58483（BTP2）对体外T辅助2型（Th2）细胞因子产生和体内抗原诱导的气道哮喘反应的影响。YM-58483抑制了锥蛋白刺激的小鼠Th2 T细胞克隆（D10.G4.1）中IL-4和IL-5的产生，以及植物血凝素刺激的人全血细胞中IL-5的生产，其IC（50）值与CRAC通道抑制的报告值相当（约100nM）。YM-58483抑制了抗原诱导的嗜酸性粒细胞浸润气道，并降低了主动致敏Brown Norway大鼠炎症气道中IL-4和半胱氨酰白三烯的含量。此外，口服YM-58483可预防主动致敏豚鼠抗原诱导的晚期哮喘支气管收缩和嗜酸性粒细胞浸润。这些数据表明，通过CRAC通道抑制Ca（2+）内流可以预防抗原诱导的气道炎症，可能是通过抑制Th2细胞因子的产生和炎症介质的释放。因此，YM-58483可用于治疗支气管哮喘的气道炎症。[4]

PHA诱导全人外周血产生IL-5和IL-13[3]
PHA被用作刺激剂，以模拟抗原在T淋巴细胞中引发的初始反应。人外周血取自健康志愿者。肝素化人外周全血在RPMI1640培养基中用青霉素-链霉素以1:3.5的比例稀释。稀释的血液（450μl）用不同浓度的YM-58483（BTP2）（10-1000 nM）或泼尼松龙（1-100 nM）预处理，然后在37°C下用PHA（10μg/ml）在24孔板（总体积：500μl）中刺激48小时。将平板离心（250g，在4°C下离心10分钟），然后收集上清液并在-20°C下冷冻直至使用。分别使用抗IL-5单克隆抗体和人IL-13 ELISA试剂盒DuoSet通过ELISA测量上清液中IL-5和IL-13的水平。

DNP诱导RBL-2H3细胞组胺释放和LTs产生[3]
RBL-2H3细胞是一种大鼠嗜碱性白血病细胞系，其表型与粘膜肥大细胞相似，购自美国典型培养物保藏中心，并在含有10%FBS、25 mM HEPES、2 g/l NaHCO3和青霉素（100 U/ml）/链霉素（100μg/ml）的RPMI 1640培养基中在5%CO2加湿气氛中保持单层培养。使用DNP和之前描述的方法，在稍作修改后，诱导RBL-2H3细胞释放介体。RBL-2H3细胞与单克隆抗DNP IgE（100 ng/ml）在1000 ml旋转培养瓶中以3×105个细胞/ml的密度培养24小时。洗涤后，在测定缓冲液（5 mM HEPES、140 mM NaCl、5 mM KCl、0.6 mM MgCl2、1 mM CaCl2、5 mM d（+）-葡萄糖，pH 7.4）中用IgE（8×10~5个细胞）预处理的细胞在37°C下用抗原DNP-BSA（0.1-100 ng/ml）刺激96孔板（总体积：200μl）20分钟。刺激后，细胞离心（250g，在4°C下10分钟），然后取出上清液并在-0°C下冷冻直至使用。分别使用组胺ELISA试剂盒和LTC4/D4/E4 EIA试剂盒测定上清液中组胺和LTC4/D4/E4（LT）的水平。为了测量测试化合物的效果，用不同浓度的YM-58483（BTP2）（30-3000nM）或泼尼松龙（10μM）预处理IgE引发的细胞，然后用DNP-BSA（30ng/ml）刺激。

诱导移植物抗宿主病 (GVHD)[3]
\n在体内实验中，将YM-58483(BTP2)悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，以10 ml/kg的剂量进行口服给药。
\nGVHD的诱导按照先前描述的方法进行[27]。从雌性C57BL/6小鼠（供体品系，H-2b）和雌性BDF1小鼠（受体品系，H-2b/d）的脾脏中制备HBSS单细胞悬液。将脾细胞悬液通过70 μm孔径的无菌尼龙网过滤，然后重悬于3 ml Tris-氯化铵缓冲液（0.26 M NH4Cl，0.017 M Tris，pH 7.6）中以裂解红细胞，室温振荡2分钟，再用HBSS缓冲液洗涤两次。为诱导GVHD，于第0天经尾静脉向雌性BDF1受体小鼠注射来自同性别、同年龄C57BL/6小鼠的脾细胞（5 × 10~7个细胞）。作为阴性对照，向雌性BDF1小鼠注射同性别、同年龄的同基因（BDF1）小鼠的脾细胞（5 × 10~7个细胞）。作为正常对照，向雌性BDF1小鼠注射200 μl HBSS缓冲液。从第0天到第9天（连续10天），每天口服一次YM-58483(BTP2)和环孢素A。在第10天，使用GVHD小鼠、阴性对照小鼠和正常小鼠的脾细胞检测抗宿主CTL活性和产生IFN-γ的能力。同时，在第10天鉴定细胞亚群。YM-58483对神经性疼痛具有镇痛作用，但其机制尚不明确。本实验采用脊神经结扎（SNL）诱导的大鼠神经性疼痛模型，旨在探讨YM-58483(BTP2)缓解神经性疼痛的机制。在雄性Sprague-Dawley大鼠中，结扎左侧L5神经以建立SNL神经性疼痛模型。在鞘内注射YM-58483和溶剂前后，采用上下法和Hargreaves法测定大鼠的缩足阈值。通过免疫荧光法定位脊髓背角中的SOCCs。采用Western blot法检测脊髓水平磷酸化ERK、磷酸化CREB、CD11b和GFAP蛋白的表达，并采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α、PGE2）的释放。与对照组+溶剂组相比，鞘内注射浓度为300 μM（1.5 nmol）和1000 μM（10 nmol）的YM-58483对SNL大鼠产生了显著的中枢镇痛作用（n = 7，P < 0.001）。然而，与生理盐水组相比，两者均未能阻止神经性疼痛的发生（P < 0.001）。免疫荧光染色显示，Orai1和STIM1（SOCCs的两个关键成分）定位于脊髓背角神经元。Western blot结果显示，YM-58483可降低P-ERK和P-CREB的水平（n = 10，#P < 0.05），而不影响CD11b和GFAP的表达（n = 10，#P > 0.05）。与对照组+溶剂组相比，YM-58483还抑制了脊髓IL-1β、TNF-α和PGE2的释放（n = 5，#P < 0.001）。 YM-58483的镇痛机制可能是通过抑制神经元中枢ERK/CREB信号通路，减少中枢IL-1β、TNF-α和PGE2的释放，从而降低脊髓结扎（SNL）大鼠脊髓背角神经元的兴奋性。[1]YM-58483/BTP2是一种储存操纵性钙离子内流（SOCE）阻断剂，SOCE调节淋巴细胞等非兴奋性细胞的活化。据报道，YM-58483(BTP2)可抑制T细胞的细胞因子产生和增殖，并可能成为治疗支气管哮喘的候选药物。本研究探讨了YM-58483的药理学特性及其与细胞介导免疫反应相关的治疗潜力。在小鼠移植物抗宿主病（GVHD）模型中，YM-58483（1-30 mg/kg，口服）和环孢素A（1-30 mg/kg，口服）抑制了供体抗宿主细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性和IFN-γ产生，并减少了脾脏中供体T细胞的数量，尤其是供体CD8+ T细胞。YM-58483和环孢素A在单向混合淋巴细胞反应（MLR）中抑制T细胞增殖，IC50值分别为330 nM和12.7 nM。此外，YM-58483（1-10 mg/kg，口服）和环孢素A（2、10 mg/kg，口服）抑制了绵羊红细胞（SRBC）诱导的迟发型超敏反应（DTH）。这些结果表明，抑制SOCE可预防抗原诱导的T细胞反应，而T细胞反应参与自身免疫性疾病，例如自身免疫性肝炎和类风湿性关节炎。[2]

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\n\nT细胞在包括人类哮喘在内的多种免疫和过敏性疾病的发病机制中发挥调节作用。最近有报道称，吡唑衍生物YM-58483(BTP2)可有效抑制T细胞中Ca²⁺释放激活的Ca²⁺ (CRAC)通道和白细胞介素(IL)-2的产生。我们研究了YM-58483(BTP2)对体外T辅助细胞2型(Th2)细胞因子产生和体内抗原诱导的气道哮喘反应的影响。 YM-58483抑制了卵清蛋白刺激的小鼠Th2 T细胞克隆（D10.G4.1）中IL-4和IL-5的产生，以及植物血凝素刺激的人全血细胞中IL-5的产生，其IC50值与报道的CRAC通道抑制剂的IC50值（约100 nM）相当。YM-58483抑制了抗原诱导的嗜酸性粒细胞向气道的浸润，并降低了主动致敏的褐挪威大鼠炎症气道中IL-4和半胱氨酰白三烯的含量。此外，口服YM-58483可预防主动致敏豚鼠中抗原诱导的迟发性哮喘支气管收缩和嗜酸性粒细胞浸润。这些数据表明，抑制Ca(2+)通过CRAC通道的内流可预防抗原诱导的气道炎症，这可能是通过抑制Th2细胞因子的产生和炎症介质的释放实现的。因此，YM-58483可能有助于治疗支气管哮喘的气道炎症。[4]

[1]. The Central Analgesic Mechanism of YM-58483 in Attenuating Neuropathic Pain in Rats. Cell Mol Neurobiol. 2016 Oct;36(7):1035-43.

[2]. Characterization of YM-58483/BTP2, a novel store-operated Ca2+ entry blocker, on T cell-mediated immune responses in vivo. Int Immunopharmacol. 2008 Dec 20;8(13-14):1787-9.

[3]. The suppressive effects of YM-58483/BTP-2, a store-operated Ca2+ entry blocker, on inflammatory mediator release in vitro and airway responses in vivo. Pulm Pharmacol Ther. 2008;21(2):360-9.

[4]. YM-58483, a selective CRAC channel inhibitor, prevents antigen-induced airway eosinophilia and late phase asthmatic responses via Th2 cytokine inhibition in animal models. Eur J Pharmacol. 2007 Apr 10;560(2-3):225-33.

YM-58483/BTP-2，即4-甲基-4'-[3,5-双(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]-1,2,3-噻二唑-5-甲酰苯胺，可阻断介导非兴奋性细胞活化的胞内钙库操纵性钙离子内流（SOCE）。本研究探讨了YM-58483作为抗哮喘药物的药理学特性和治疗潜力。YM-58483可抑制IgE预处理的大鼠嗜碱性白血病细胞系RBL-2H3细胞中DNP抗原诱导的组胺释放和白三烯（LTs）生成，其IC50值分别为460 nM和310 nM。泼尼松龙对这两种反应均无抑制作用。 YM-58483还能抑制植物血凝素P (PHA) 刺激的人外周血细胞中IL-5和IL-13的产生，其IC50值分别为125 nM和148 nM，其效力约为泼尼松龙的五分之一。YM-58483（30 mg/kg，口服）能显著抑制卵清蛋白(OVA)致敏豚鼠的OVA诱导的支气管收缩，而泼尼松龙则无此作用。YM-58483（3-30 mg/kg，口服）和泼尼松龙（100 mg/kg，口服）均能显著且完全抑制OVA暴露引起的呼吸道高反应性(AHR)。由于 YM-58483 通过抑制炎症介质和细胞因子的产生来抑制支气管哮喘的两个主要特征症状，即支气管收缩和气道高反应性，因此 SOCE 抑制是一种潜在的治疗方法。[3]

C15H9F6N5OS

421.3214

421.043

C, 42.76; H, 2.15; F, 27.06; N, 16.62; O, 3.80; S, 7.61

223499-30-7

223499-30-7;

2455

White to off-white solid powder

1.6±0.1 g/cm3

1.608

3.77

100.94

1

11

3

28

568

0

XPRZIORDEVHURQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H9F6N5OS/c1-7-12(28-25-23-7)13(27)22-8-2-4-9(5-3-8)26-11(15(19,20)21)6-10(24-26)14(16,17)18/h2-6H,1H3,(H,22,27)

N-[4-[3,5-bis(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1-yl]phenyl]-4-methyl-1,2,3-thiadiazole-5-carboxamide

YM-58483; YM 58483; YM58483; BTP 2; 223499-30-7; YM-58483; btp2; CRAC Channel Inhibitor, BTP2; N-[4-[3,5-bis(trifluoromethyl)pyrazol-1-yl]phenyl]-4-methylthiadiazole-5-carboxamide; N-(4-(3,5-bis(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1-yl)phenyl)-4-methyl-1,2,3-thiadiazole-5-carboxamide; N-[4-[3,5-Bis(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1-yl]phenyl]-4-methyl-1,2,3-thiadiazole-5-carboxamide; CHEMBL262766; BTP-2; BTP2.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~125 mg/mL (~296.69 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.93 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.93 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。