YM-58483(BTP2)   中文名称: N-(4-(3,5-二(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯基)-4-甲基-1,2,3-噻二唑-5-甲酰胺

Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels; store-operated Ca2+ entry (SOCE)
YM-58483/BTP2 blocks store-operated Ca²⁺ entry (SOCE) channels, including the Ca²⁺ release‑activated Ca²⁺ (CRAC) channel, TRPC3, and TRPC5, and facilitates TRPM4 channel activity. It does not cross‑react with voltage‑operated Ca²⁺ entry, K⁺ channels, or Cl⁻ channels. [2]

YM-58483 可在不改变 CD11b 和 GFAP 表达的情况下降低 P-ERK 和 P-CREB 的水平。此外，YM-58483 还能抑制肠道 IL-1β、TNF-α 和 PGE2 的产生 [1]。在单向混合溶液反应 (mLR) 中，YM-58483 和环孢素 A 均能抑制 T 细胞生长，IC50 值分别为 330 nM 和 12.7 nM [2]。YM-58483 还能抑制 RBL-2H3 细胞（一种梯度碱稀释细胞系）中 IgE 刺激产生的白三烯 (LT) 和组胺的合成，IC50 值分别为 460 nM 和 310 nM。 YM-58483 的 IC50 值分别为 125 nM 和 148 nM，它还能抑制植物血凝素-P (PHA) 诱导的人外周血细胞中 IL-5 和 IL-13 的产生，其作用强度约为泼尼松龙的五分之一 [3]。在植物血凝素刺激的人全血细胞中，YM-58483 可降低亮氨酸刺激的小鼠 Th2 T 细胞克隆 (D10.G4) 中 IL-5 和 IL-4 的产生。 IC50 值与已发表的 CRAC 通道抑制值（约 100 nM）相似 [4]。

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YM-58483/BTP2 抑制 Jurkat T 细胞中抗 CD3 抗体诱导的持续性 Ca²⁺ 内流，IC₅₀ 为 150 nM（thapsigargin 诱导的 Ca²⁺ 内流）。[2]
它在 30–3000 nM 范围内抑制 pGLN(F-AT)3 转染细胞中的 NF-AT 报告基因活性。 [2]
在采用 C57BL/6 应答脾细胞和经辐照的 DBA2 刺激脾细胞进行的单向混合淋巴细胞反应 (MLR) 中，YM-58483/BTP2 抑制了同种异体抗原诱导的 T 细胞增殖，IC₅₀ 为 330 ± 90 nM。[2]
YM-58483/BTP2 在体外抑制了 T 细胞的细胞因子（IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ）产生和增殖。[2]

鞘内注射 300 μM (1.5 nmol) 和 1000 μM (10 nmol) 的 YM-58483 对 SNL 产生强烈的中枢镇痛作用 [1]。YM-58483 (1-30 mg/kg，口服) 和环孢素 A (1-30 mg/kg，口服) 可抑制供体抗细胞毒性 T 细胞 (CTL) 活性和 IFN-γ 产生，并减少脾脏中供体 T 细胞的数量，特别是供体 CD8+ T 细胞。YM-58483 (1-10 mg/kg，口服) 和环孢素 A (2, 10 mg/kg，口服) 可降低绵羊红细胞 (SRBC) 引起的迟发型超敏反应 (DTH) [2]。 M-58483（30 mg/kg，肘部）显著降低了卵清蛋白（OVA）致敏豚鼠中OVA诱导的迟发型收缩，而YM-58483（3-30 mg/kg，面部）和泼尼松龙（100 mg/kg，面部）则显著且完全抑制了OVA引起的呼吸道高反应性（AHR）[3]。YM-58483可缓冲吸入呼吸道引起的嗜酸性粒细胞浸润，并降低由棕色挪威苏格兰威士忌中心主动致敏激活的呼吸道中IL-4和半胱氨酸泡沫白三烯的水平。通路 YM-58483 可阻止主动致敏豚鼠晚期死亡和嗜酸性呼吸的强烈诱导[4]。

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在小鼠急性移植物抗宿主病 (GVHD) 模型（C57BL/6 供体 → BDF₁ 受体）中，口服 YM-58483/BTP2（1–30 mg/kg，每日一次，持续 10 天）以剂量依赖的方式抑制供体抗宿主细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 活性和 ConA 刺激的脾细胞中 IFN-γ 的产生，在 30 mg/kg 时显著降低。[2]
YM-58483/BTP2 以剂量依赖的方式减少 GVHD 小鼠脾脏中供体细胞总数、供体 T 细胞以及供体 CD4⁺ 和 CD8⁺ T 细胞的数量；在 30 mg/kg 剂量下，CD4⁺/CD8⁺ 比值从 0.75 增加到 1.31。[2]
在 Balb/c 小鼠的绵羊红细胞 (SRBC) 诱导的迟发型超敏反应 (DTH) 模型中，口服 YM-58483/BTP2（1–10 mg/kg，每日一次，连续 6 天）以剂量依赖的方式抑制足垫肿胀，在 10 mg/kg 剂量下抑制率达到 29%（具有统计学意义）。[2]
同一研究小组此前报道：YM-58483/BTP2 可抑制半抗原（三硝基氯苯）诱导的接触性超敏反应模型中的耳肿胀，并改善刀豆蛋白 A (ConA) 诱导的小鼠肝炎模型中的肝功能。[2]

PHA诱导人外周全血产生IL-5和IL-13[3]
PHA用作刺激剂，以模拟抗原在T淋巴细胞中诱发的初始反应。人外周血取自健康志愿者。将肝素化的人外周全血以1:3.5的比例稀释于含青霉素-链霉素的RPMI1640培养基中。将稀释后的血液（450 μl）预先用不同浓度的YM-58483(BTP2)（10–1000 nM）或泼尼松龙（1–100 nM）处理，然后在24孔板（总体积：500 μl）中用PHA（10 μg/ml）刺激，于37 °C孵育48小时。将培养板离心（250g，4℃，10分钟），收集上清液并于-20℃冷冻保存备用。分别使用抗IL-5单克隆抗体和人IL-13 ELISA试剂盒DuoSet，通过ELISA法测定上清液中IL-5和IL-13的水平。

DNP诱导RBL-2H3细胞释放组胺和产生白三烯[3]
RBL-2H3细胞系是一种大鼠嗜碱性白血病细胞系，其表型与黏膜肥大细胞相似。该细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），并在含10%胎牛血清（FBS）、25 mM HEPES、2 g/L碳酸氢钠（NaHCO3）和青霉素（100 U/mL）/链霉素（100 μg/mL）的RPMI 1640培养基中，于5% CO2湿润环境下进行单层培养。采用DNP和先前描述的方法（略有修改）诱导RBL-2H3细胞释放介质。将 RBL-2H3 细胞以 3×10⁵ 个细胞/ml 的密度接种于 1000 ml 旋转培养瓶中，并加入单克隆抗 DNP IgE (100 ng/ml) 培养 24 小时。洗涤后，将经 IgE 预处理的细胞（8×10⁵ 个细胞）接种于检测缓冲液（5 mM HEPES、140 mM NaCl、5 mM KCl、0.6 mM MgCl₂、1 mM CaCl₂、5 mM d(+)-葡萄糖，pH 7.4）中，然后在 96 孔板（总体积：200 μl）中，于 37 °C 下用抗原 DNP-BSA (0.1–100 ng/ml) 刺激 20 分钟。刺激后，将细胞离心（250g，4℃，10分钟），然后取上清液并于-0℃冷冻保存备用。分别使用组胺ELISA试剂盒和LTC4/D4/E4 EIA试剂盒测定上清液中组胺和LTC4/D4/E4（白三烯）的水平。为了测定测试化合物的作用，将IgE致敏的细胞用不同浓度的YM-58483(BTP2)（30–3000 nM）或泼尼松龙（10 μM）预处理，然后用DNP-BSA（30 ng/ml）刺激。

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对于单向混合淋巴细胞反应（MLR）：将C57BL/6小鼠的脾细胞（反应细胞，3×10⁵个细胞）与经照射（30 Gy）的DBA2小鼠的脾细胞（刺激细胞，1×10⁶个细胞）在含有10% FBS、青霉素和链霉素的RPMI1640培养基中培养，并加入YM-58483/BTP2（10–10,000 nM）或环孢素A。培养64小时后，在 37 °C、5% CO₂ 条件下，使用基于 BrdU 的细胞增殖 ELISA 法定量细胞增殖。抑制率由阴性对照（仅反应细胞）和刺激对照（不添加化合物）的值计算得出。[2]
抗宿主 CTL 活性：将 GVHD、阴性对照或正常小鼠的效应脾细胞制备于含 10% FBS、青霉素和链霉素的 RPMI1640 培养基中。将效应细胞与靶细胞 P815 (H-2ᵈ)（4×10⁴ 个细胞）在 96 孔 U 型底板中以 100:1、50:1、25:1 和 12.5:1 的效应细胞与靶细胞比例共培养，总体积为 200 μL，在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 18 小时。采用非放射性细胞毒性试验，通过测量乳酸脱氢酶释放量来量化细胞毒性。细胞毒性百分比计算公式为：[(样本 – 效应细胞自发释放量 – 靶细胞自发释放量) / (靶细胞最大释放量 – 靶细胞自发释放量)] × 100。[2]
细胞因子生成：将GVHD小鼠的脾细胞（1.5×10⁶个细胞）与ConA（3 μg/mL）在24孔板中培养，总体积为1 mL，于37 °C、5% CO₂条件下培养24小时。收集上清液，并通过ELISA法测定IFN-γ水平。[2]

诱导移植物抗宿主病 (GVHD)[3]
在体内实验中，将YM-58483(BTP2)悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，以10 ml/kg的剂量进行口服给药。
GVHD的诱导按照先前描述的方法进行[27]。从雌性C57BL/6小鼠（供体品系，H-2b）和雌性BDF1小鼠（受体品系，H-2b/d）的脾脏中制备HBSS单细胞悬液。将脾细胞悬液通过70 μm孔径的无菌尼龙网过滤，然后重悬于3 ml Tris-氯化铵缓冲液（0.26 M NH4Cl，0.017 M Tris，pH 7.6）中以裂解红细胞，室温振荡2分钟，再用HBSS缓冲液洗涤两次。为诱导GVHD，于第0天经尾静脉向雌性BDF1受体小鼠注射来自同性别、同年龄C57BL/6小鼠的脾细胞（5 × 10~7个细胞）。作为阴性对照，向雌性BDF1小鼠注射同性别、同年龄的同基因（BDF1）小鼠的脾细胞（5 × 10~7个细胞）。作为正常对照，向雌性BDF1小鼠注射200 μl HBSS缓冲液。从第0天到第9天（连续10天），每天口服一次YM-58483(BTP2)和环孢素A。在第10天，使用GVHD小鼠、阴性对照小鼠和正常小鼠的脾细胞检测抗宿主CTL活性和产生IFN-γ的能力。同时，在第10天鉴定细胞亚群。YM-58483对神经性疼痛具有镇痛作用，但其机制尚不清楚。本实验采用脊神经结扎（SNL）诱导的大鼠神经性疼痛模型，旨在探讨YM-58483(BTP2)缓解神经性疼痛的机制。在雄性Sprague-Dawley大鼠中，结扎左侧L5神经以建立SNL神经性疼痛模型。在鞘内注射YM-58483和溶剂前后，采用上下法和Hargreaves法测定大鼠的缩足阈值。通过免疫荧光法定位脊髓背角中的SOCCs。采用Western blot法检测脊髓水平磷酸化ERK、磷酸化CREB、CD11b和GFAP蛋白的表达，并采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α、PGE2）的释放。与对照组+溶剂组相比，鞘内注射浓度为300 μM（1.5 nmol）和1000 μM（10 nmol）的YM-58483对SNL大鼠产生了显著的中枢镇痛作用（n = 7，P < 0.001）。然而，与生理盐水组相比，两者均未能阻止神经性疼痛的发生（P < 0.001）。免疫荧光染色显示，Orai1和STIM1（SOCCs的两个关键成分）定位于脊髓背角神经元。Western blot结果显示，YM-58483可降低P-ERK和P-CREB的水平（n = 10，#P < 0.05），而不影响CD11b和GFAP的表达（n = 10，#P > 0.05）。与对照组+溶剂组相比，YM-58483还抑制了脊髓IL-1β、TNF-α和PGE2的释放（n = 5，#P < 0.001）。 YM-58483的镇痛机制可能是通过抑制神经元中枢ERK/CREB信号通路，减少中枢IL-1β、TNF-α和PGE2的释放，从而降低脊髓结扎（SNL）大鼠脊髓背角神经元的兴奋性。[1] YM-58483/BTP2是一种储存操纵性钙离子内流（SOCE）阻断剂，SOCE调节淋巴细胞等非兴奋性细胞的活化。据报道，YM-58483(BTP2)可抑制T细胞的细胞因子产生和增殖，并可能成为治疗支气管哮喘的候选药物。本研究探讨了YM-58483的药理学特性及其与细胞介导免疫反应相关的治疗潜力。在小鼠移植物抗宿主病（GVHD）模型中，YM-58483（1-30 mg/kg，口服）和环孢素A（1-30 mg/kg，口服）抑制了供体抗宿主细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性和IFN-γ产生，并减少了脾脏中供体T细胞的数量，尤其是供体CD8+ T细胞。YM-58483和环孢素A在单向混合淋巴细胞反应（MLR）中抑制T细胞增殖，IC50值分别为330 nM和12.7 nM。此外，YM-58483（1-10 mg/kg，口服）和环孢素A（2、10 mg/kg，口服）抑制了绵羊红细胞（SRBC）诱导的迟发型超敏反应（DTH）。这些结果表明，抑制SOCE可预防抗原诱导的T细胞反应，而T细胞反应参与自身免疫性疾病，例如自身免疫性肝炎和类风湿性关节炎。[2]

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T细胞在包括人类哮喘在内的多种免疫和过敏性疾病的发病机制中发挥调节作用。最近有报道称，吡唑衍生物YM-58483(BTP2)可有效抑制T细胞中Ca²⁺释放激活的Ca²⁺ (CRAC)通道和白细胞介素(IL)-2的产生。我们研究了YM-58483(BTP2)对体外T辅助细胞2型(Th2)细胞因子产生和体内抗原诱导的气道哮喘反应的影响。 YM-58483抑制了卵清蛋白刺激的小鼠Th2 T细胞克隆（D10.G4.1）中IL-4和IL-5的产生，以及植物血凝素刺激的人全血细胞中IL-5的产生，其IC50值与报道的CRAC通道抑制剂的IC50值（约100 nM）相当。YM-58483抑制了抗原诱导的嗜酸性粒细胞向气道的浸润，并降低了主动致敏的褐挪威大鼠炎症气道中IL-4和半胱氨酰白三烯的含量。此外，口服YM-58483可预防主动致敏豚鼠中抗原诱导的迟发性哮喘支气管收缩和嗜酸性粒细胞浸润。这些数据表明，抑制Ca(2+)通过CRAC通道的内流可预防抗原诱导的气道炎症，这可能是通过抑制Th2细胞因子的产生和炎症介质的释放实现的。因此，YM-58483可能有助于治疗支气管哮喘的气道炎症。[4]

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GVHD模型：第0天，将5×10⁷个来自雌性C57BL/6供体小鼠的脾细胞静脉注射到雌性BDF₁受体小鼠体内。阴性对照组注射同基因BDF₁脾细胞；正常对照组仅注射HBSS。YM-58483/BTP2和环孢素A悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，从第0天到第9天（连续10天），每天口服一次，剂量为10 mL/kg。 YM-58483/BTP2 的剂量分别为 1、3、10 和 30 mg/kg。第 10 天收集脾脏，用于分析抗宿主 CTL 活性、IFN-γ 产生和细胞亚群。[2] SRBC 诱导的迟发型超敏反应 (DTH) 模型：第 0 天，雄性 Balb/c 小鼠皮下注射 2×10⁷ 个 SRBC 进行免疫。第 5 天，免疫小鼠左后足垫注射 30 μL 1×10⁸ 个 SRBC 进行攻击；右后足垫注射 30 μL 0.9% 生理盐水。攻击后 24 小时，使用厚度计测量足垫肿胀程度，结果以左右足垫厚度之差表示。未免疫的对照组小鼠注射生理盐水代替 SRBC 免疫。 YM-58483/BTP2 和环孢素 A 悬浮于 0.5% 甲基纤维素溶液中，从第 0 天至第 5 天（连续 6 天）每日口服一次，每次剂量为 10 mL/kg。YM-58483/BTP2 的剂量分别为 1、3 和 10 mg/kg。[2]

在豚鼠中，口服 3 mg/kg 的 YM-58483/BTP-2 后，血浆最大浓度 (Cmax) 为 480 nM。[3]
YM-58483/BTP-2 在豚鼠体内的血浆半衰期 (t₁/₂) 为 13.3 小时。[3]

初步安全性评估显示，YM-58483/BTP2在小鼠口服剂量高达30 mg/kg时，未引起其一般活动能力的明显变化，且在浓度高达3 μM时，对Jurkat T细胞未显示出细胞毒性。[2]

[1]. The Central Analgesic Mechanism of YM-58483 in Attenuating Neuropathic Pain in Rats. Cell Mol Neurobiol. 2016 Oct;36(7):1035-43.

[2]. Characterization of YM-58483/BTP2, a novel store-operated Ca2+ entry blocker, on T cell-mediated immune responses in vivo. Int Immunopharmacol. 2008 Dec 20;8(13-14):1787-9.

[3]. The suppressive effects of YM-58483/BTP-2, a store-operated Ca2+ entry blocker, on inflammatory mediator release in vitro and airway responses in vivo. Pulm Pharmacol Ther. 2008;21(2):360-9.

[4]. YM-58483, a selective CRAC channel inhibitor, prevents antigen-induced airway eosinophilia and late phase asthmatic responses via Th2 cytokine inhibition in animal models. Eur J Pharmacol. 2007 Apr 10;560(2-3):225-33.

YM-58483/BTP-2，或称4-甲基-4'-[3,5-双(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]-1,2,3-噻二唑-5-甲苯胺，可阻断细胞内钙池操纵的钙离子内流（SOCE），从而抑制非兴奋性细胞的活化。本研究探讨了YM-58483作为抗哮喘药物的药理学特性和治疗潜力。YM-58483可抑制IgE预处理的大鼠嗜碱性白血病细胞系RBL-2H3中DNP抗原诱导的组胺释放和白三烯（LTs）生成，其IC50值分别为460 nM和310 nM。泼尼松龙对这两种反应均无抑制作用。 YM-58483还能抑制植物血凝素P (PHA)刺激的人外周血细胞中IL-5和IL-13的产生，其IC50值分别为125 nM和148 nM，约为泼尼松龙效力的五分之一。YM-58483（30 mg/kg，口服）显著抑制卵清蛋白(OVA)致敏豚鼠的OVA诱导的支气管收缩，而泼尼松龙则无此作用。YM-58483（3-30 mg/kg，口服）和泼尼松龙（100 mg/kg，口服）均能显著且完全抑制OVA暴露诱导的气道高反应性(AHR)。由于YM-58483通过抑制炎症介质和细胞因子的产生，从而抑制支气管哮喘的两大主要特征症状——支气管收缩和气道高反应性，因此抑制SOCE是一种潜在的治疗方法。[3]

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YM-58483/BTP2抑制储存操纵性Ca²⁺内流（SOCE），从而抑制NF-AT活化及其后续的细胞因子（IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ）产生和T细胞增殖。其对SOCE的抑制作用可预防参与自身免疫性疾病（如自身免疫性肝炎和类风湿性关节炎）的抗原诱导的T细胞反应。[2]
该化合物选择性地抑制持续的Ca²⁺内流，而不影响静息细胞。在GVHD模型中，它主要抑制供体CD8⁺ T细胞活化，降低抗宿主CTL活性和IFN-γ产生，并使CD4⁺/CD8⁺比值恢复正常。[2]
YM-58483/BTP2与环孢素A进行了比较，后者通过与亲环蛋白A结合抑制钙调磷酸酶；两种化合物在GVHD和迟发型超敏反应（DTH）模型中均显示出相似的疗效。[2]

C15H9F6N5OS

421.3214

421.043

C, 42.76; H, 2.15; F, 27.06; N, 16.62; O, 3.80; S, 7.61

223499-30-7

223499-30-7;

2455

White to off-white solid powder

1.6±0.1 g/cm3

1.608

3.77

100.94

1

11

3

28

568

0

XPRZIORDEVHURQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H9F6N5OS/c1-7-12(28-25-23-7)13(27)22-8-2-4-9(5-3-8)26-11(15(19,20)21)6-10(24-26)14(16,17)18/h2-6H,1H3,(H,22,27)

N-[4-[3,5-bis(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1-yl]phenyl]-4-methyl-1,2,3-thiadiazole-5-carboxamide

YM-58483; YM 58483; YM58483; BTP 2; 223499-30-7; YM-58483; btp2; CRAC Channel Inhibitor, BTP2; N-[4-[3,5-bis(trifluoromethyl)pyrazol-1-yl]phenyl]-4-methylthiadiazole-5-carboxamide; N-(4-(3,5-bis(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1-yl)phenyl)-4-methyl-1,2,3-thiadiazole-5-carboxamide; N-[4-[3,5-Bis(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1-yl]phenyl]-4-methyl-1,2,3-thiadiazole-5-carboxamide; CHEMBL262766; BTP-2; BTP2.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~125 mg/mL (~296.69 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.93 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.93 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。