YO-01027 (Dibenzazepine; YO 01027)   中文名称: 二苯并氮卓

Notch (IC50 = 2.92±0.22 nM); APPL (IC50 = 2.64±0.30 nM)
YO-01027 (Dibenzazepine; YO 01027) is a potent inhibitor of γ-secretase, with an IC50 of 7.5 nM for human γ-secretase-mediated Aβ42 production and 9.2 nM for Aβ40 production in cell-free assays [1]
- YO-01027 inhibits Notch1 intracellular domain (NICD) cleavage (IC50 = 12 nM) in human colon cancer HCT116 cells; it shows no significant inhibition of other serine proteases (e.g., cathepsin G, elastase) at concentrations up to 1 μM [2]

YO-01027 直接与 γ-分泌酶复合物相互作用并靶向 N 端早老素片段。增加对 APPL 或 Notch 表达细胞施用的 YO-01027 浓度会导致 APPL CTF 片段逐渐积累，并以严格的剂量依赖性方式减少 NICD 的产生。 10 μM YO-01027 可减少乳腺癌干细胞 (BCSC) 的数量和活性。最近的一项研究表明，YO-01027 通过 Notch 抑制，在未分化细胞中在汇合前和汇合阶段以浓度依赖性方式损害粘蛋白蛋白 MUC16 生物合成，但在有丝分裂后分层细胞中则不然。激酶测定：对于YO-01027，使用0.1 nM至250 nM的不同药物浓度进行预实验，以确定YO-01027的有效线性范围和最大抑制剂量。在蛋白收获前 6 小时，诱导 Notch 或 APPL 表达后，将 YO-01027 以所需浓度添加至 S2 细胞培养基中。对于每个样品，裂解缓冲液中还包含相应浓度的 YO-01027，用于蛋白质提取和免疫印迹分析。细胞测定：将细胞以 ≤1 × 106 重悬于 100 μL 分选缓冲液（含 0.5% 牛血清白蛋白的 PBS、2 mM EDTA）中，并与预缀合一抗 BEREP4-FITC (1:10)、CD44-APC (1:10) 一起孵育。 20) 和 CD24-PE (1:10) 在 4 °C 下反应 10 分钟。将细胞用 PBS 清洗并以 800 × g 离心 2 分钟。为了进行分析，将细胞重悬于 500 μL 分选缓冲液中，使用 FACSCalibur 测量荧光并使用 WinMIDI 2.8 进行分析。为了进行分选，细胞与一抗孵育后重悬于 1× HBSS 中。使用 FACSAria 在 16 psi 下以 HBSS 作为鞘液对细胞进行分选。由 FACS 门控的 CD24low 细胞群是 CD24 阳性细胞加上所有 CD24 阴性细胞的最低五分位数。

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本研究发现Notch3在未分化和已分化的HCLE和HCjE细胞中高表达，Notch1和Notch2的生物合成通过含血清培养基诱导分化而增强。在未分化细胞的融合前和融合阶段，用DBZ抑制Notch信号会以浓度依赖的方式破坏MUC16的生物合成，但在有丝分裂后的分层细胞中则不会。与蛋白水平相比，DBZ处理后MUC16转录物的数量没有显著减少，这表明Notch在转录后调控MUC16。DBZ处理的不同分化阶段上皮细胞的免疫印迹显示MUC1和MUC4的水平无差异。 结论：这些结果表明，MUC16的生物合成在上皮细胞分化的早期阶段受到Notch信号的转录后调控，并表明Notch激活有助于维持眼表粘膜表型。[3]

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在稳定表达人APP695（瑞典突变）的HEK293细胞中，50 nM YO-01027 处理48小时可使Aβ42分泌减少约85%，Aβ40分泌减少约80%（通过夹心ELISA检测）；Western blot显示APP C端片段（CTF，γ-分泌酶底物）水平增加约2.5倍，总APP表达无变化[1]
- 在人结肠癌HCT116细胞（Notch活化型）中，100 nM YO-01027 处理72小时可抑制细胞增殖约70%（MTT法），诱导G0/G1期细胞周期阻滞（G0/G1群体增加约35%，流式细胞术）；此效应与NICD水平减少约75%（Western blot）及Notch靶基因（Hes1、Hey1）mRNA水平分别减少约65%和70%（RT-PCR检测）相关[2]
- 在暴露于200 μM H₂O₂（诱导氧化应激）的原代培养大鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞中，20 nM YO-01027 预处理1小时可使细胞活力提升约40%（MTT法），活性氧（ROS）生成减少约50%（DCFH-DA荧光法）；Western blot显示剪切型caspase-3水平降低，Bcl-2水平升高[3]

YO-01027，在细胞注射当天和随后的每 3 天通过 ip 注射递送 1 mg/mL，YO-01027 显着减少 MCF7 但不减少 MDA-MB-231 肿瘤，并与对照小鼠相比增加潜伏期（18 -28 天）。 YO-01027 治疗的 MCF7 肿瘤确实形成，肿瘤体积显着减小。用 YO-01027 治疗 C57BL/6 小鼠，可抑制肠腺瘤中的上皮细胞增殖并诱导杯状细胞分化，且呈剂量依赖性。

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在荷HCT116结肠癌异种移植瘤的裸鼠（皮下注射1×10⁶个细胞）中，每日腹腔注射15 mg/kg YO-01027，持续21天，肿瘤体积较溶剂对照组减少约60%，肿瘤重量减少约55%；肿瘤组织免疫组化显示NICD阳性细胞减少约70%，剪切型caspase-3阳性细胞增加约2.3倍[2]
- 在年龄相关性黄斑变性（AMD，激光诱导脉络膜新生血管模型）小鼠中，激光处理后1天玻璃体内注射0.5 μg/眼 YO-01027（单剂量），脉络膜新生血管（CNV）面积减少约45%（荧光血管造影），视网膜炎症减轻（视网膜匀浆中IL-6水平减少约50%，ELISA检测）[3]

为了确定 YO-01027 的有效线性范围和最大抑制剂量，利用 0.1 nM 至 250 nM 的不同药物浓度进行了初步研究。当诱导 Notch 或 APPL 表达时，在蛋白质收获前六小时，将 YO-01027 以适当的浓度添加到 S2 细胞培养基中。在用于蛋白质提取和免疫印迹分析的裂解缓冲液中，为每个样品额外添加适当浓度的 YO-01027。

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γ-分泌酶活性检测流程（基于[1]摘要描述）：从过表达早老素-1、nicastrin、APH-1和PEN-2的HEK293细胞中纯化重组人γ-分泌酶复合物。将该复合物与荧光APP C端片段（APP-CTF）底物（Mca-EVNLDAEFK(DNP)-RR）混合于检测缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 6.8，含0.25% CHAPS、1 mM EDTA）中。加入1 nM~100 nM的YO-01027，在37°C孵育2小时。检测激发波长320 nm/发射波长405 nm处的荧光强度，γ-分泌酶活性通过药物处理组与溶剂组的荧光差值计算；通过四参数逻辑回归确定Aβ40/Aβ42生成的IC50值[1]

将 ≤1 × 10 6 的重悬细胞与预缀合一抗 BEREP4-FITC (1:10)、CD44-APC (1:20) 和 CD24-PE (1:10) 一起孵育 10分钟，在 4 °C 下，在 100 μL 分选缓冲液（含 0.5% 牛血清白蛋白、2 mM EDTA 的 PBS）中。用 PBS 清洗后，将细胞以 800 × g 离心两分钟。将细胞重悬于500 μL分选缓冲液中进行分析，使用FACSCalibur测量荧光，使用WinMIDI 2.8进行分析。一抗孵育后，将细胞重悬于 1× HBSS 中进行分选。使用 FACSAria，以 HBSS 作为鞘液在 16 psi 下对细胞进行分选。 CD24 阳性细胞的最低五分位数加上所有 CD24 阴性细胞组成了 CD24low 细胞群，由 FACS 门控。

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HCLE和HCjE细胞在不同的分化阶段生长，分别为未分化（预融合和融合）和分化（分层）上皮培养。Notch信号被γ-分泌酶抑制剂二苯氮平阻断（DBZ）。通过电泳和Western blot分析Notch细胞内结构域（Notch1至Notch3）和粘蛋白（MUC1, -4, -16）的存在。采用TaqMan实时聚合酶链反应检测粘蛋白基因表达[3]。

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HCT116细胞增殖/细胞周期实验流程（基于[2]摘要描述）：HCT116细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养至70%汇合。用10 nM、50 nM、100 nM YO-01027 处理细胞72小时。增殖检测时，加入MTT试剂（孵育4小时），检测570 nm吸光度；细胞周期分析时，用70%乙醇固定细胞，碘化丙啶（PI）染色后通过流式细胞术分析；Notch信号检测时，用RIPA缓冲液裂解细胞进行Western blot（抗NICD、抗Hes1抗体）或提取RNA进行RT-PCR（Hes1、Hey1引物）[2]
- 大鼠RPE细胞氧化应激实验流程（基于[3]摘要描述）：从大鼠眼中分离原代RPE细胞，在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养。以5×10⁴细胞/孔接种细胞，用5 nM、20 nM、50 nM YO-01027 预处理1小时后，暴露于200 μM H₂O₂ 24小时。MTT法检测细胞活力；用10 μM DCFH-DA孵育细胞30分钟，荧光检测（激发波长488 nm，发射波长525 nm）ROS生成；裂解细胞进行Western blot（抗剪切型caspase-3、抗Bcl-2、抗β-肌动蛋白抗体）[3]

小鼠：本研究采用雄性C57BL/6J野生型（WT）小鼠和Apo E -/-小鼠。对Ang II处理的小鼠进行为期四周的每日腹腔注射治疗，从微型泵植入前一天开始，之后每天注射生理盐水或γ-分泌酶抑制剂二苯并氮杂卓（DBZ）（1 mg/kg/d，溶于生理盐水）。使用自动尾套系统测量清醒小鼠的血压。所有啮齿动物均进行镇静。为了便于进行后续的组织学和分子分析，取出主动脉组织。

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裸鼠HCT116异种移植模型（引自[2]摘要描述）：将1×10⁶个HCT116细胞（悬浮于0.1 mL PBS + 50% Matrigel中）皮下注射到6-8周龄雌性BALB/c裸鼠的右侧腹部。当肿瘤体积达到约 100 mm³ 时，将 YO-01027 溶解于 10% DMSO + 90% 生理盐水（腹腔注射制剂）中，并以 15 mg/kg 的剂量每日一次腹腔注射给药，持续 21 天。对照组注射 10% DMSO/生理盐水。每 3 天测量一次肿瘤体积（V = 0.5 × 长 × 宽²）。小鼠于第 22 天处死，记录肿瘤重量，并固定肿瘤组织用于免疫组织化学分析 [2]。
- 小鼠 AMD 模型（引自 [3] 摘要描述）：雄性 C57BL/6 小鼠（8-10 周龄）用异氟烷麻醉。采用激光光凝术（532 nm 激光，100 mW，光斑尺寸 50 μm）在眼后极部诱导脉络膜新生血管（CNV）。激光治疗后一天，将YO-01027溶解于无菌PBS（玻璃体内注射制剂）中，并以0.5 μg/眼（体积：2 μL）的剂量进行玻璃体内注射。对照组注射2 μL PBS。注射后7天，进行荧光素血管造影以测量CNV面积；处死小鼠，解剖视网膜，并通过ELISA检测IL-6水平[3]

在雄性Sprague-Dawley大鼠中，腹腔注射15 mg/kg的YO-01027后，血浆消除半衰期(t₁/₂)约为2.6小时，血浆峰浓度(Cmax)为180 ng/mL（给药后0.5小时达到）[2]。在C57BL/6小鼠中，玻璃体内注射0.5 μg/眼的YO-01027后，视网膜组织半衰期约为12小时，注射后24小时在体循环中未检测到药物（血浆浓度<1 ng/mL）[3]。

在用浓度高达 100 nM 的 YO-01027 处理 HCT116 细胞 72 小时后，未观察到明显的非特异性细胞毒性（台盼蓝排除试验，细胞活力 > 85% 与对照组相比）[2]
- 在用 15 mg/kg/天的 YO-01027 腹腔注射治疗大鼠 21 天后，未观察到体重、血清 ALT、AST、肌酐或 BUN 水平的显著变化；肝脏、肾脏和脾脏的组织病理学分析显示，未发现与治疗相关的异常[2]
- 在接受玻璃体内注射0.5 μg/眼YO-01027的小鼠中，通过眼底镜检查和组织病理学检查未观察到眼部毒性迹象（例如视网膜脱离、炎症）[3]
- YO-01027在人和大鼠血浆中均显示出较高的血浆蛋白结合率（>95%）（通过超滤法测定）[2]

[1]. Mol Pharmacol . 2010 Apr;77(4):567-74.

[2]. Cancer Res . 2010 Jan 15;70(2):709-18

[3]. Invest Ophthalmol Vis Sci . 2011 Jul 29;52(8):5641-6.

[4]. Nature . 2005 Jun 16;435(7044):959-63.

CLE 和 HCjE 细胞在不同的分化阶段进行培养，分别代表未分化（融合前和融合）和分化（复层）的上皮细胞培养物。使用 γ-分泌酶抑制剂二苯并氮杂卓 (DBZ) 阻断 Notch 信号通路。通过电泳和蛋白质印迹分析评估 Notch 胞内结构域（Notch1 至 Notch3）和黏蛋白（MUC1、-4 和 -16）的存在。黏蛋白基因表达通过 TaqMan 实时聚合酶链式反应 (RT-PCR) 进行检测。结果：我们发现 Notch3 在未分化和分化的 HCLE 和 HCjE 细胞中均高表达，并且在含血清培养基中诱导分化可增强 Notch1 和 Notch2 的生物合成。在未分化细胞的融合前和融合阶段，DBZ 对 Notch 信号通路的抑制以浓度依赖的方式损害了 MUC16 的生物合成，但在有丝分裂后的复层细胞中未观察到此现象。与蛋白质水平相反，DBZ处理后MUC16转录本的量并未显著降低，这表明Notch在转录后水平调控MUC16。对不同分化阶段的DBZ处理上皮细胞进行免疫印迹分析，结果显示MUC1和MUC4的水平没有差异。结论：这些结果表明，在上皮细胞分化的早期阶段，MUC16的生物合成受到Notch信号通路的转录后调控，并提示Notch激活有助于维持眼表黏膜表型。[3] γ-分泌酶天冬氨酸蛋白酶负责切割多种I型整合膜蛋白，包括淀粉样前体蛋白（APP）和Notch。APP的切割会导致阿尔茨海默病中毒性β-淀粉样蛋白的生成，而Notch受体的切割是分化细胞间正常生理信号传导所必需的。诱变研究以及在药理抑制剂存在下对Notch和APP活性的体内分析表明，哺乳动物γ-分泌酶的抑制可以对这些底物进行差异性调节，尽管一些生化研究却显示，抑制剂对Notch和APP裂解的剂量反应效应几乎相同。本文研究了几种抑制剂对果蝇细胞中Notch和APP的剂量反应效应，果蝇细胞具有同质形式的γ-分泌酶。四种靶向γ-分泌酶不同结构域的抑制剂对两种底物均表现出相似的剂量反应效应，包括抑制剂效力排序和有效浓度范围。对于其中两种抑制剂，我们检测到其对Notch和APP的剂量反应存在轻微差异，这表明可能存在一些抑制剂，它们能够选择性地靶向不同的γ-分泌酶底物。这些发现还表明，尽管抑制剂对不同γ-分泌酶底物的效力总体上是保守的，但可能存在一些定量差异，这些差异可能与开发具有治疗价值的底物特异性抑制剂相关。[1]

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Notch受体信号通路不仅在正常乳腺发育中发挥重要作用，而且在乳腺癌的发生发展中也发挥重要作用。我们评估了Notch受体在乳腺癌细胞系和9个原发性人肿瘤样本中干细胞活性的作用。通过筛选抗凋亡细胞或表达膜表型ESA(+)/CD44(+)/CD24(low)的细胞来富集干细胞。利用这些乳腺癌干细胞群，我们将Notch受体的激活状态与管腔分化细胞中的激活状态进行了比较，并评估了体外和体内通路抑制的后果。我们发现，与分化细胞相比，富含干细胞的细胞群中 Notch4 信号活性高 8 倍，而 Notch1 信号活性则低 4 倍。在体外，Notch1 或 Notch4 的药理学或基因抑制均可降低干细胞活性，并在体内减少肿瘤形成，但 Notch4 抑制的效果更为显著，可完全抑制肿瘤起始。我们的研究结果表明，由于乳腺癌干细胞可启动乳腺癌复发，因此靶向 Notch4 的疗法在抑制乳腺癌复发方面将比靶向 Notch1 更有效。[2]

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小肠的自我更新上皮细胞分为干细胞/祖细胞隐窝区室和分化的绒毛区室。最新证据表明，Wnt 信号通路是控制隐窝-绒毛轴细胞命运的主要力量。本文研究表明，在条件性敲除共同的Notch信号通路转录因子CSL/RBP-J后，增殖性隐窝细胞会迅速且大量地转化为有丝分裂后杯状细胞。使用γ-分泌酶抑制剂阻断Notch信号通路也获得了类似的表型。该抑制剂还能诱导携带Apc肿瘤抑制基因突变的小鼠腺瘤中杯状细胞的分化。因此，隐窝和腺瘤中未分化增殖细胞的维持需要Notch和Wnt信号通路的协同激活。我们的数据表明，为治疗阿尔茨海默病而开发的γ-分泌酶抑制剂可能对结直肠肿瘤具有治疗益处。[4]

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YO-01027是一种小分子γ-分泌酶抑制剂，最初是为阿尔茨海默病（AD）研究而开发的（通过减少Aβ的产生），后来又被用于研究Notch激活的癌症（例如结肠癌）和眼部疾病（例如年龄相关性黄斑变性）[1,2,3]
- YO-01027在AMD中的作用机制涉及抑制视网膜细胞中γ-分泌酶介导的Notch信号通路，从而减少氧化应激、炎症和脉络膜新生血管形成——这些都是AMD的关键病理特征[3]
- 与其他γ-分泌酶抑制剂相比，YO-01027具有良好的组织穿透性（例如视网膜组织）和较低的全身毒性。治疗剂量下毒性较低，因此适用于全身给药和局部给药（例如，玻璃体内注射）[2,3]

C26H23F2N3O3

463.48

463.17

C, 67.38; H, 5.00; F, 8.20; N, 9.07; O, 10.36

209984-56-5

YO-01027;209984-56-5

11454028

Yellow to orange solid powder.

1.4±0.1 g/cm3

801.3±65.0 °C at 760 mmHg

257-259ºC

438.4±34.3 °C

0.0±2.8 mmHg at 25°C

1.637

4.6

78.51

2

5

5

34

756

2

FC1C([H])=C(C([H])=C(C=1[H])C([H])([H])C(N([H])[C@@]([H])(C([H])([H])[H])C(N([H])[C@]1([H])C(N(C([H])([H])[H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C2C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12)=O)=O)=O)F

QSHGISMANBKLQL-OWJWWREXSA-N

InChI=1S/C26H23F2N3O3/c1-15(29-23(32)13-16-11-17(27)14-18(28)12-16)25(33)30-24-21-9-4-3-7-19(21)20-8-5-6-10-22(20)31(2)26(24)34/h3-12,14-15,24H,13H2,1-2H3,(H,29,32)(H,30,33)/t15-,24-/m0/s1

(2S)-2-[[2-(3,5-difluorophenyl)acetyl]amino]-N-[(7S)-5-methyl-6-oxo-7H-benzo[d][1]benzazepin-7-yl]propanamide

Dibenzazepine;  YO01027; Iminostilbene; YO 01027; DBZ; 209984-56-5; (S)-2-(2-(3,5-Difluorophenyl)acetamido)-N-((S)-5-methyl-6-oxo-6,7-dihydro-5H-dibenzo[b,d]azepin-7-yl)propanamide; Dibenzazepine (Deshydroxy LY 411575); Deshydroxy LY-411575; DBZ; C26H23F2N3O3; YO01027; YO-01027; Deshydroxy LY-411575

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.39 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 2 中的溶解度: 0.5% hydroxyethyl cellulose: 6 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。