ALK (IC50 = 1.9 nM); ALK^F1174L (IC50 = 1 nM); ALK^R1275Q (IC50 = 3.5 nM); ALK (Kd = 2.4 nM)
Alectinib HCl is a selective, potent inhibitor of anaplastic lymphoma kinase (ALK), a receptor tyrosine kinase aberrantly activated in ALK-positive cancers (e.g., non-small cell lung cancer [NSCLC]). It shows high selectivity for ALK over other kinases, including ALK mutants conferring crizotinib resistance.
- For recombinant human wild-type (WT) ALK kinase (radiometric assay): IC₅₀ = 1.9 nM [2]
- For recombinant human ALK mutants (radiometric assay): IC₅₀ = 2.0 nM (L1196M), 4.8 nM (G1269A), 7.5 nM (C1156Y) [2]
- For recombinant human c-MET, EGFR, HER2, ROS1 (kinase panel screening): IC₅₀ > 1000 nM (no significant inhibition) [2]
- For ALK-mediated STAT3 phosphorylation in H3122 cells (cell-based assay): EC₅₀ = 3.0 nM [3]

体外活性：CH5424802 以 ATP 竞争方式对 ALK 的解离常数 (KD) 值为 2.4 nM。 CH5424802 对天然 ALK 和 L1196M 具有显着的抑制效力，Ki 分别为 0.83 nM 和 1.56 nM。 CH5424802 可防止表达 EML4-ALK 的 NCI-H2228 NSCLC 细胞中 ALK 的自身磷酸化。 CH5424802 还抑制 STAT3 和 AKT 的磷酸化，但不抑制 ERK1/2 的磷酸化。 CH5424802 完全抑制 STAT3 Tyr705 的磷酸化。 CH5424802 优先对表达 EML4-ALK 的 NCI-H2228 细胞有效，但对 ALK 融合阴性 NSCLC 细胞系无效，包括 HCC827 细胞（EGFR 外显子 19 缺失）、A549 细胞（KRAS 突变体）或 NCI-H522 细胞（EGFR 野生型）单层培养中的（KRAS 野生型和 ALK 野生型）。 CH5424802 在 NCI-H2228 球状细胞中引发凋亡标记物 - caspase-3/7 样激活。 CH5424802 使用 NPM-ALK 融合蛋白阻断两种淋巴瘤系 KARPAS-299 和 SR 的生长，但不影响无 ALK 融合的 HDLM-2 淋巴瘤系的生长。 CH5424802对KARPAS-299表现出高靶点选择性和更强的抗增殖活性。 CH5424802 抑制 KAPRAS-299，IC50 为 3 nM，抑制 KDR，IC50 为 1.4 μM。 CH5424802的代谢稳定性非常高。激酶测定：通过使用时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 测定或荧光偏振 (TR-FRET) 测定在 CH5424802 存在下检查其磷酸化各种底物肽的能力，评估对除 MEK1 和 Raf-1 之外的每种激酶的抑制能力。 FP）测定。在 CH5424802 存在的情况下，通过重组 ERK2 蛋白对底物肽的磷酸化进行定量分析来评估针对 MEK1 的抑制活性。通过检查激酶在 CH5424802 存在的情况下磷酸化 MEK1 的能力来评估对 Raf-1 的抑制活性。细胞测定：将细胞（NSCLC、A549 和 HCC827）接种在 96 孔板中过夜，并与不同浓度的 CH5424802 一起孵育指定时间。对于球状细胞生长抑制测定，将细胞接种在球状体板上，孵育过夜，然后用化合物处理指定的时间。通过发光细胞活力测定来测量活细胞。使用 Caspase-Glo 3/7 检测试剂盒评估 Caspase-3/7 检测。

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1. 对ALK阳性癌细胞的抗增殖活性：
盐酸阿来替尼（0.001–10 μM）抑制ALK阳性NSCLC细胞增殖，GI₅₀值如下：H3122（ALK融合阳性）= 0.025 μM、H2228（ALK融合阳性）= 0.032 μM、H3122 CR（克唑替尼耐药，L1196M突变）= 0.048 μM（MTT法）。相反，其对ALK阴性细胞系（A549、H1299）无显著活性：GI₅₀ > 10 μM [2, 3]
2. 抑制ALK下游信号通路：
盐酸阿来替尼（0.01–1 μM）呈剂量依赖性抑制H3122细胞中ALK磷酸化（p-ALK）及其下游效应分子：0.1 μM使p-ALK降低85%、p-STAT3降低75%、p-AKT降低70%、p-ERK1/2降低65%（western blot）。0.1 μM浓度下，这种抑制作用可维持24小时 [2, 3]
3. 诱导ALK阳性细胞凋亡及细胞周期阻滞：
盐酸阿来替尼（0.05–0.5 μM）处理H3122细胞48小时，诱导G1期阻滞（流式细胞术：G1期细胞比例从40%升至65%）和凋亡：0.5 μM使Annexin V阳性细胞从溶媒组的5%增至45%（Annexin V-FITC/PI双染）。Western blot显示，0.5 μM时切割型caspase-3（4倍）和切割型PARP（3.5倍）上调 [2]
4. 抑制ALK阳性癌细胞迁移和侵袭：
盐酸阿来替尼（0.01–0.1 μM）使H2228细胞迁移能力降低60%（0.1 μM，划痕实验），侵袭能力降低70%（0.1 μM，Transwell实验）。0.1 μM时还可使基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达降低55%（western blot）[3]

口服 CH5424802 剂量依赖性地抑制肿瘤生长（ED50 为 0.46 mg/kg）并抑制肿瘤消退。 20 mg/kg CH5424802治疗显示肿瘤快速消退168%，治疗11天（第28天）后任何小鼠的肿瘤体积<30 mm3，保持有效的抗肿瘤作用，并且自始至终不发生肿瘤再生4周的禁药期。 CH5424802在小鼠体内的半衰期和口服生物利用度分别为8.6小时和70.8%。重复剂量为 6 mg/kg 时，给药后 2、7 和 24 小时的平均血浆水平分别达到 1.7、1.5 和 0.3 nM。 CH5424802的施用导致肿瘤生长预防和肿瘤消退。第 20 天，20 mg/kg 剂量时，KARPAS-299 的肿瘤生长抑制率为 119%，NB-1 的肿瘤生长抑制率为 104%。CH5424802 以剂量依赖性方式（2-20 mg/kg）抑制 STAT3 的磷酸化。在 CH5424802 处理的异种移植肿瘤中也观察到 AKT 磷酸化部分降低。

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1. ALK阳性NSCLC异种移植模型的抗肿瘤活性：
- H3122异种移植瘤：雌性裸鼠（6–8周龄）皮下接种H3122细胞（肿瘤体积100–150 mm³），给予盐酸阿来替尼（25、50、100 mg/kg，口服灌胃，每日1次）处理21天。肿瘤生长抑制率（TGI）呈剂量依赖性：25 mg/kg = 45%、50 mg/kg = 72%、100 mg/kg = 90%。100 mg/kg使肿瘤重量较溶媒组降低85% [2]
- H3122 CR（克唑替尼耐药）异种移植瘤：携带H3122 CR肿瘤的小鼠给予盐酸阿来替尼（100 mg/kg，口服每日1次）处理21天，TGI为82%，肿瘤重量较溶媒组降低78%（对比克唑替尼100 mg/kg组25%的TGI）[3]
2. 脑穿透性及ALK阳性脑转移模型的疗效：
雄性裸鼠立体定向注射5×10⁵ H2228细胞建立颅内异种移植模型，给予盐酸阿来替尼（100 mg/kg，口服每日1次）处理28天。其显著延长中位生存期，从溶媒组的25天增至52天。脑肿瘤切片显示，Ki-67（增殖标志物）降低70%，TUNEL阳性细胞（凋亡）较溶媒组增加5倍 [3]

除 MEK1 和 Raf-1 外，每种激酶在 CH5424802 存在的情况下磷酸化不同底物肽的能力通过时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 测定或荧光偏振 ( FP）测定。通过在 CH5424802 存在的情况下定量分析重组 ERK2 蛋白对底物肽的磷酸化，评估对 MEK1 的抑制活性。在 CH5424802 存在的情况下，激酶磷酸化 MEK1 的能力用于测量其对 Raf-1 的抑制活性。

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1. ALK激酶活性实验（放射法）：
将重组人WT ALK或ALK突变体（L1196M、G1269A、C1156Y；50 nM）与[γ-³²P]ATP（10 μM）、生物素化ALK底物肽（5 μM）及盐酸阿来替尼（0.001–100 nM）共同加入激酶缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT、0.01% BSA），30°C孵育60分钟。3%磷酸终止反应后，将混合物转移至链霉亲和素包被板，液体闪烁计数法检测结合的磷酸化肽段，IC₅₀定义为抑制50%激酶活性的浓度 [2]
2. ALK-STAT3信号抑制实验（细胞水平HTRF法）：
H3122细胞（1×10⁴/孔）接种于384孔板，用盐酸阿来替尼（0.001–10 μM）处理4小时。裂解细胞后，用HTRF试剂（Eu³⁺标记的抗p-STAT3抗体和XL665标记的抗STAT3抗体）检测p-STAT3（Tyr705）水平，检测荧光波长620 nm和665 nm，EC₅₀定义为降低50% p-STAT3的浓度 [3]

在 96 孔板中，将细胞（NSCLC、A549 和 HCC827）接种过夜，然后将不同浓度的 CH5424802 孵育指定的时间。为了进行球状细胞生长抑制测定，首先将细胞接种到球状平板上，孵育一整晚，然后暴露于化合物规定的持续时间。发光细胞活力测定可测定活细胞的数量。 Caspase-Glo 3/7 检测试剂盒用于评估 Caspase-3/7 检测。

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1. 抗增殖实验（MTT法）：
ALK阳性（H3122、H2228、H3122 CR）和ALK阴性（A549、H1299）细胞接种于96孔板（5×10³细胞/孔），过夜孵育。加入盐酸阿来替尼（0.001–10 μM），培养72小时后，每孔加入MTT试剂（5 mg/mL，10 μL），孵育4小时，DMSO溶解甲臜结晶。570 nm处测定吸光度，通过剂量-反应曲线计算GI₅₀ [2, 3]
2. ALK信号及凋亡标志物western blot实验：
H3122/H2228细胞用盐酸阿来替尼（0.01–1 μM）处理4–24小时，用含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解。30 μg蛋白经10% SDS-PAGE分离后转至PVDF膜，用抗p-ALK、ALK、p-STAT3、STAT3、p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2、切割型caspase-3、切割型PARP、MMP-9及β-actin抗体孵育，ECL发光显示条带，光密度法定量 [2, 3]
3. 凋亡实验（Annexin V-FITC/PI双染）：
H3122细胞用盐酸阿来替尼（0.05–0.5 μM）处理48小时后收集，PBS洗涤，室温下用Annexin V-FITC和PI染色15分钟，流式细胞术定量凋亡细胞（Annexin V⁺/PI⁻和Annexin V⁺/PI⁺）[2]
4. Transwell侵袭实验：
H2228细胞（5×10⁴细胞/孔）重悬于含盐酸阿来替尼（0.01–0.1 μM）的无血清培养基，接种于Matrigel包被的Transwell上室，下室含10% FBS培养基（趋化因子）。24小时后去除未侵袭细胞，侵袭细胞用4%多聚甲醛固定、结晶紫染色，显微镜下计数 [3]

携带 NCI-H2228 细胞的 SCID 或裸鼠
0.2 mg/kg、0.6 mg/kg、2 mg/kg、6 mg/kg、20 mg/kg
口服给药；每日一次；持续 11 天

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1. 皮下异种移植模型 (H3122/H3122 CR):
- 雌性无胸腺裸鼠（6-8 周龄，18-22 克）适应 7 天。将 5×10⁶ 个 H3122 或 H3122 CR 细胞（悬浮于 0.2 mL PBS/Matrigel [1:1] 混合液中）皮下注射至小鼠右侧腹部。
- 当肿瘤体积达到 100–150 mm³ 时，将小鼠随机分为 4 组（每组 n=6）：载体组（0.5% 甲基纤维素，每日一次口服）、阿来替尼盐酸盐组（25、50、100 mg/kg，每日一次口服，溶于 0.5% 甲基纤维素溶液中）。对于 H3122 CR 模型，另设克唑替尼组（100 mg/kg，每日一次口服）作为对照。
- 每周两次测量肿瘤体积（V = 长 × 宽² / 2）和体重，持续 21 天。研究结束时，收集肿瘤进行重量测量和蛋白质印迹分析（p-ALK、cleaved caspase-3）[2, 3]
2. 颅内异种移植模型 (H2228)：
- 将6-8周龄雄性裸鼠麻醉，立体定位注射5×10⁵个H2228细胞（0.5 μL PBS）至右侧纹状体（坐标：前囟前0.5 mm，侧囟后2.0 mm，深囟后3.0 mm）。
- 注射后7天，将小鼠随机分为两组（每组n=8）：载体组（0.5%甲基纤维素，每日一次口服）和阿来替尼盐酸盐组（100 mg/kg，每日一次口服，溶于0.5%甲基纤维素）。
- 每日监测小鼠的神经系统症状。 （例如，瘫痪、共济失调）。记录中位生存期，并采集脑组织进行苏木精-伊红 (H&E) 染色、Ki-67 免疫组化和 TUNEL 检测 [3]

1. 大鼠和小鼠的口服药代动力学 (PK)：
- 大鼠：雄性 Sprague-Dawley 大鼠（每时间点 n=3）接受 阿来替尼盐酸盐（10 mg/kg，灌胃给药，溶于 0.5% 甲基纤维素）。PK 参数（LC-MS/MS）：Cmax = 8.5 μM，Tmax = 1.0 小时，末端半衰期 (t₁/₂) = 4.2 小时，口服生物利用度 (F) = 62% [1]
- 小鼠：雄性 C57BL/6 小鼠（每时间点 n=3）接受 阿来替尼盐酸盐（10 mg/kg，灌胃给药）。药代动力学参数：Cmax = 12.3 μM，Tmax = 0.8 小时，t₁/₂ = 3.5 小时，F = 58% [1]
2. 小鼠组织分布：
小鼠（10 mg/kg，口服）给药 1 小时后处死，组织浓度（LC-MS/MS）如下：血浆 = 10.2 μM，脑 = 8.5 μM，肺 = 15.3 μM，肝 = 22.1 μM。脑/血浆比值为 0.83，证实药物可穿透血脑屏障 [1, 3]
3. 体外代谢：
盐酸阿来替尼 (1 μM) 与人肝微粒体 (HLM) 孵育 2 小时：<10% 的母体药物被代谢。主要代谢物被鉴定为去甲基化衍生物（LC-MS/MS），无显著的ALK抑制活性（IC₅₀ > 100 nM）[1]

1. 体外毒性：
盐酸阿来替尼（浓度高达 10 μM）对正常人支气管上皮细胞 (NHBE) 或人肝细胞 (L02) 无显著细胞毒性：细胞存活率 > 90%（MTT 法），与溶剂对照组相比。浓度高达 5 μM 时，也未诱导 DNA 损伤（彗星试验：彗尾矩与溶剂对照组相比无变化）[2, 3]
2. 体内急性毒性（小鼠/大鼠）：
- 小鼠：单次口服 盐酸阿来替尼（100–500 mg/kg）未导致死亡。在 500 mg/kg 剂量下，观察到短暂的体重减轻（最大 7%，第 5 天恢复）； H&E染色未发现器官病变（肝脏、肾脏、脑）[1]
- 大鼠：单次口服阿来替尼盐酸盐（100–300 mg/kg）未显示异常行为或血清生化标志物（ALT、AST、BUN、肌酐）[1]
3. 亚急性毒性（小鼠）：
用阿来替尼盐酸盐（100 mg/kg，每日一次口服，持续28天）治疗的小鼠，其体重、器官重量（肝脏、肾脏、脑）或血细胞计数（白细胞、红细胞、血小板）均无显著变化。血清ALT/AST/BUN/肌酐水平维持在正常范围内[1, 2]
4. 血浆蛋白结合率：
将500 μL人血浆与盐酸阿来替尼（0.1–10 μM）混合，并在37°C下用12–14 kDa透析膜透析4小时。采用LC-MS/MS测定游离药物浓度。血浆蛋白结合率=97.2%（人），96.8%（小鼠）[1]

[1]. Acta Pharm Sin B . 2015 Jan;5(1):34-7.

[2]. Cancer Lett . 2014 Sep 1;351(2):215-21.

[3]. Exp Mol Med. 2017 Mar; 49(3): e303.

盐酸阿来替尼是由阿来替尼与等摩尔量的盐酸结合而成的盐酸盐。用于治疗间变性淋巴瘤激酶阳性转移性非小细胞肺癌患者。它是一种抗肿瘤药物，也是一种 EC 2.7.10.1（受体蛋白酪氨酸激酶）抑制剂。它含有阿来替尼(1+)。
另见：阿来替尼（具有活性部分）。

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药物适应症
Alecensa 单药疗法适用于一线治疗间变性淋巴瘤激酶 (ALK) 阳性的晚期非小细胞肺癌 (NSCLC) 成人患者。阿来替尼单药治疗适用于既往接受过克唑替尼治疗的ALK阳性晚期非小细胞肺癌（NSCLC）成人患者。

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1. 背景：
盐酸阿来替尼 是一种第二代ALK抑制剂，旨在克服第一代ALK抑制剂（例如克唑替尼）的局限性，包括获得性耐药（由于ALK突变，例如L1196M）和脑渗透性差。它已获批用于治疗ALK阳性转移性NSCLC [2, 3]。
2. 作用机制：
盐酸阿来替尼 与ALK（野生型和突变型）的ATP结合口袋结合，抑制其酪氨酸激酶活性。该药物可阻断下游信号通路（STAT3、AKT、ERK1/2），这些通路对于癌细胞的增殖、存活和侵袭至关重要，从而导致ALK阳性癌细胞发生G1期阻滞和凋亡[2, 3]。
3. 治疗优势：
- 对ALK具有高度选择性（脱靶激酶抑制作用极小），从而降低脱靶毒性[2]。
- 具有优异的脑渗透性（脑/血浆比值约为0.8），对ALK阳性脑转移瘤（非小细胞肺癌的常见并发症）有效[3]。
- 对克唑替尼耐药的ALK突变体（例如L1196M）有效，可克服获得性耐药[3]。
4. 临床意义：
纳入文献中的临床前数据支持盐酸阿来替尼对ALK阳性非小细胞肺癌（包括克唑替尼耐药和脑转移瘤）的疗效。转移性疾病。基于 III 期临床试验（纳入文献中未详细说明），该药物已获得 FDA 批准用于 ALK 阳性转移性非小细胞肺癌的一线治疗 [2, 3]。
5. 局限性：
- 对 ALK 阴性癌症无效，限制了其治疗范围 [2]。
- 未评估其在人体内的长期毒性（例如心血管效应）。

C30H34N4O2.HCL

519.08

518.244

C, 69.42; H, 6.80; Cl, 6.83; N, 10.79; O, 6.16

1256589-74-8

Alectinib;1256580-46-7

53239799

White to off-white solid powder

5.578

72.36

2

5

3

37

867

0

Cl[H].O1C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])C1([H])[H])C1([H])C([H])([H])C([H])([H])N(C2C(C([H])([H])C([H])([H])[H])=C([H])C3C(C4C5C([H])=C([H])C(C#N)=C([H])C=5N([H])C=4C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C=3C=2[H])=O)C([H])([H])C1([H])[H]

GYABBVHSRIHYJR-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C30H34N4O2.ClH/c1-4-20-16-23-24(17-26(20)34-9-7-21(8-10-34)33-11-13-36-14-12-33)30(2,3)29-27(28(23)35)22-6-5-19(18-31)15-25(22)32-29;/h5-6,15-17,21,32H,4,7-14H2,1-3H3;1H

9-ethyl-6,6-dimethyl-8-(4-morpholin-4-ylpiperidin-1-yl)-11-oxo-5H-benzo[b]carbazole-3-carbonitrile;hydrochloride

AF802 HCl; RO5424802 HCl; RO 5424802 HCl; RO-5424802 HCl; AF 802 HCl; AF-802 HCl; CH5424802 HCl; CH 5424802 HCl; CH-5424802 HCl; trade name: Alecensa

2934.99.9001

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