Antithrombin III

体外活性：肝素因其能够加速凝血级联中抗凝血酶抑制丝氨酸蛋白酶的速率而被广泛用作抗凝血药物。肝素和结构相关的硫酸乙酰肝素是复杂的线性聚合物，由具有可变序列的不同长度的链的混合物组成。肝素与含有高正电荷密度互补结合位点的肽相互作用最紧密。肝素和硫酸乙酰肝素主要表现出线性螺旋二级结构，其中磺基和羧基沿着多糖主链以规定的间隔和规定的方向显示。肝素与 DNA 类似，因为两者都是高电荷线性聚合物，具有聚电解质的作用。据信，肝素主要通过与 AT III 相互作用，增强 AT-III 介导的凝血因子（包括凝血酶和因子 Xa）的抑制作用，发挥抗凝剂的作用。肝素与 AT III 和凝血酶结合形成三元复合物，使抑制凝血酶的双分子速率常数增加 2000 倍。肝素主要位于与免疫反应密切相关的组织肥大细胞颗粒中。肝素与 FGF-2 和 FGFR-1 进行大量接触，稳定 FGF-FGFR 结合。肝素还与相邻 FGF-FGFR 复合物的 FGFR-1 接触，因此似乎促进 FGFR 二聚化。

肝素是一种抗凝剂，已知对血管生成有多种作用，一些报道表明它可以诱导血管生成，而少数报道表明它具有抑制作用。用低分子肝素治疗静脉血栓栓塞症的癌症患者的存活率高于普通肝素（UFH）。已知肝素与各种血管生成生长因子相互作用，这是基于其在糖胺聚糖链内的硫酸化修饰。因此，研究不同分子量肝素的作用机制对于了解其血管生成特性非常重要。在这方面，我们使用晚期CAM试验研究了不同浓度的高分子量肝素（15kDa）的血管生成反应。测量血管的长度和大小，并计算CAM的厚度。观察到的CAM厚度增加表明在处理区域形成了毛细管状结构。对扩散模式的分析表明，肝素的内化作用会影响基因表达，导致内皮细胞增殖。血管生成是指现有血管形成新血管，治疗区域出现新血管强烈证实了分子量为15kDa的肝素能够以剂量依赖的方式诱导CAM血管床上的血管生成。结果表明，肝素具有诱导血管生成的亲和力，并提供了一种新的机制，肝素可用于治疗，如伤口愈合过程[3]。

肝素是一种属于糖胺聚糖家族的硫酸多糖，与多种蛋白质的相互作用有关，具有许多重要的生物活性。肝素因其能够加速抗凝血酶抑制凝血级联反应中丝氨酸蛋白酶的速率而被广泛用作抗凝血剂。肝素和结构相关的硫酸乙酰肝素是由具有可变序列的不同长度的链的混合物组成的复杂线性聚合物。硫酸乙酰肝素广泛分布于动物细胞表面和细胞外基质中，并参与多种生理和病理生理过程。评估肝素和硫酸乙酰肝素在体内的作用的困难可能部分归因于对这些多糖的详细结构和序列的无知。此外，对碳水化合物-蛋白质相互作用的理解落后于更深入研究的蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用。最近对肝素和硫酸乙酰肝素的蛋白质结合的结构、动力学和热力学方面的广泛研究提高了对肝素-蛋白质相互作用的理解。在许多这些相互作用中可以发现高度的特异性。在分子水平上理解这些相互作用对于设计新的高度特异性的治疗剂至关重要。这篇综述的重点是肝素的结构和构象，这对它与蛋白质的相互作用很重要。它还描述了肝素和硫酸乙酰肝素与选定的肝素结合蛋白家族的相互作用[1]。

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人磷酸激酶阵列[2]
根据制造商的说明，使用了一种基于膜的抗体阵列，该阵列确定了43种不同的人磷酸化蛋白激酶的相对水平。简而言之，将等量的人RPMI-8226细胞裂解液在没有或有100μg外泌体的情况下与磷酸激酶阵列膜一起孵育过夜。洗涤阵列以去除未结合的蛋白质，然后用生物素化检测抗体的混合物孵育。应用链霉抗生物素-HRP和化学发光检测试剂来可视化每个捕获点产生的与结合的磷酸化蛋白量相对应的信号。

结合珠粒的外泌体的流式细胞术分析[2]
将外泌体附着到抗CD63结合珠或肝素琼脂糖珠上后，进行流式细胞术分析以鉴定外泌体表面的分子。将100μg纯化的外泌体与抗CD63珠或肝素琼脂糖珠混合，并在4°C下在旋转架上孵育过夜。在使用位于UAB综合流式细胞术核心的Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪进行分析之前，将结合到珠粒上的外泌体悬浮在200μl的1%BSA PBS溶液中，并用针对纤维连接蛋白或syndecan-1的抗体染色。使用小鼠单克隆抗人纤维连接蛋白-PE偶联抗体对纤维连接蛋白进行染色。小鼠同种型匹配（IgG1）PE用作对照。为了检测syndecan-1，与抗CD63珠结合的外泌体在37°C下用细菌肝素酶处理2小时，然后进行大量洗涤。这种酶处理通过释放硫酸乙酰肝素和任何结合的配体（如纤维连接蛋白），使核心蛋白表位暴露于抗体。使用亲和纯化的多克隆山羊抗Syndecan-1 IgG和PE偶联的二抗检测Syndecan-1。正常山羊IgG用于对照。

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MS/MS分析外显子蛋白[2]
将碘克沙醇缓冲液排除的外泌体溶解在1×LDS样品缓冲液中，然后在超声波浴中破坏膜10分钟，并按照LDS缓冲液的制造商说明进行热变性。然后使用BCA蛋白测定试剂盒对蛋白质提取物进行定量。将含有20μg蛋白质的等分试样还原、变性，并装载到10%的Bis-Tris凝胶上，以短堆叠（约1 cm）的方式分离。凝胶用胶体蓝染色试剂盒染色，脱色并可视化。切下每个样品含有蛋白质的上部凝胶部分，用胰蛋白酶金消化，然后按照制造商的说明提取肽，并使用Savant SpinVac浓缩器减少体积。将1微克肽提取物（在0.1%甲酸中稀释至约1μg/10μl）装载到100μm×13 cm的毛细管柱上，内部填充C18 Monitor 100 a球形硅胶珠，并在90分钟的梯度上洗脱（0-30%乙腈在0.1%TFA中）。

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外体细胞相互作用分析[2]
将亚流RPMI-8226骨髓瘤细胞或HS-5骨髓基质细胞与CD63-RFP或PKH标记的骨髓瘤衍生外泌体（100μg/ml）一起孵育2小时。将细胞在PBS中洗涤，并在冰上用3%多聚甲醛固定15分钟。骨髓瘤细胞在悬浮液中生长，因此被细胞悬浮在载玻片上进行分析。所有样品均使用尼康A1共聚焦显微镜进行分析。使用FACSCalibur仪器通过流式细胞术定量与细胞结合的荧光外泌体。对于旨在阻断外泌体上纤连蛋白Hep II结构域的实验，将外泌体与单克隆抗体（A32）（25μg抗体/100μg外泌体）预孵育，该单克隆抗体特异性结合纤连蛋白的Hep II肝素结合结构域。对于旨在阻断靶细胞表面硫酸乙酰肝素的实验，将细胞与含有Hep II结合结构域（50μg/ml）的40kDa人纤维连接蛋白片段（从人血浆纤维连接蛋白的糜蛋白酶消化物中纯化）一起孵育。洗涤以去除未结合的纤维连接蛋白片段后，通过共聚焦显微镜或流式细胞术分析外泌体与靶细胞的相互作用。对于从细胞表面去除硫酸乙酰肝素的实验，在37°C下用5 millunits/ml细菌肝素酶处理细胞2小时，然后进行大量洗涤。为了从外泌体中去除硫酸乙酰肝素，将100μg外泌体在37°C下用1.5 millunits/ml肝素酶处理3小时；加入新的酶，并将外泌体孵育过夜。然后通过超速离心将外泌体造粒以去除酶。在一些阻断实验中，外源性肝素（10μg/ml）、罗那帕司特（10μg/ml）或合成十二烷基肝素（100μg/ml）与100μg外泌体/ml同时加入。罗那帕司特（以前称为SST0001）是瑞士Sigma Tau Research的专有药物，可抑制动物模型中骨髓瘤肿瘤的生长，目前正处于晚期多发性骨髓瘤患者的I期试验中（ClinicalTrials.gov标识符NCT01764880）。肝素十二糖是一种通过化学酶合成制备的完全硫酸化分子。

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纤维连接蛋白ELISA[2]
根据制造商的方案，使用市售的人纤维连接蛋白ELISA试剂盒定量纤维连接蛋白水平。该检测采用竞争抑制ELISA的形式。对于某些实验，将外泌体在37°C下在没有或有1.5 millunits/ml肝素酶的情况下处理3小时，然后加入新鲜酶并孵育过夜。然后洗涤外泌体，并通过超速离心或ExoQuick外泌体沉淀溶液造粒。通过BCA蛋白测定法测定各种样品的外泌体蛋白含量，并将每个样品中等量的外泌物蛋白（8μg）用于ELISA。

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蛋白质印迹[2]
基于BCA蛋白测定，将100μg外泌体在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中在冰上裂解10分钟，并在4-12%SDS-PAGE中通过电泳分离蛋白质。这些蛋白质被电印迹到硝化纤维膜上，并用识别纤维连接蛋白、网格蛋白或flotillin的一抗进行探测。在一些实验中，用细菌肝素酶处理外泌体并探测syndecan-1。使用HRP偶联的二抗检测一抗，并通过化学发光观察条带。在一些实验中，RPMI-8226细胞在37°C下用或不用肝素酶处理2小时，然后暴露于100μg/ml的对照或侵袭性外泌体20分钟。细胞被裂解并检测磷酸化p38或总p38。

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内皮细胞侵袭[2]
如上所述，使用Biocoat Matrigel侵袭室评估外泌体对人脐静脉内皮细胞侵袭的影响。为了研究纤维连接蛋白-硫酸肝素相互作用对外泌体功能活性的相关性，在将外泌体加入内皮细胞之前，将其在没有或有抗纤维连接蛋白抗体A32（25μg抗体/100μg外泌体蛋白）的情况下预温育。

The in ovo CAM model [3]
Fertilized chicken eggs weighing 50 ± 2gm were incubated at 37°C in a humidified atmosphere (>60% relative humidity) based on protocol for the Hen's Egg Test-Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) method. At day 3 of post incubation, 2 to3 ml of albumin was withdrawn, using a 21-gauge needle, through the large blunt edge of the egg in order to minimize adhesion of the shell membrane with CAM. A square window of 1 cm² was opened in the egg shell and sealed with paraffin film to prevent dehydration and the eggs were returned for incubation. On day 9th, gelatin sponges of size of 1 mm³ were placed on the top of growing CAM under sterile condition. The sponges were soaked with 10 μl of 50, 100 and 150 μM concentrations of Heparin. Control CAM was treated with 10 μl of 1X PBS. The window was closed with a transparent adhesive tape and the eggs were returned for further incubation till day 12 (72hours) at which vascularization potential of the CAM reaches its maximum. The experimental groups were divided into 4 with each containing 40 numbers. Group1 represents 1X PBS (control), group 2, 3 and 4 corresponds to 10 μl of 50 μM, 100 μM and 150 μM of Heparin. Treated CAM was photographed at 0, 24, 48 and 72hours using Cannon digital camera and the images were analyzed with Angioquant Toolbox, MATLAB 6.5 software to measure total length and size of blood vessels in micrometer at the area of treatment.

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Histology [3]
CAM treated with Heparin was flooded with Bouin's fixative solution and the treated area was removed, dehydrated and embedded in paraffin wax. Vertical cross sections of 7 μm in thickness were taken using Rotary Microtome. The histological sections were observed under Light Microscope at 40X magnification for qualitative assessment and images were taken using Nikon Camera attached with light microscope at 10X magnification.

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C57BL/6J mice
100, 500, or 2500 units/kg
i.p.

[1]. Heparin-protein interactions. Angew Chem Int Ed Engl. 2002 Feb 1;41(3):391-412.

[2]. Fibronectin on the Surface of Myeloma Cell-derived Exosomes Mediates Exosome-Cell Interactions. J Biol Chem. 2016 Jan 22;291(4):1652-63.

[3]. Angiogenic efficacy of Heparin on chick chorioallantoic membrane. Vascular Cell, [S.l.] v. 4, n. 1, p. 8, apr. 2012. ISSN 2045-824X.

Heparin, a sulfated polysaccharide belonging to the family of glycosaminoglycans, has numerous important biological activities, associated with its interaction with diverse proteins. Heparin is widely used as an anticoagulant drug based on its ability to accelerate the rate at which antithrombin inhibits serine proteases in the blood coagulation cascade. Heparin and the structurally related heparan sulfate are complex linear polymers comprised of a mixture of chains of different length, having variable sequences. Heparan sulfate is ubiquitously distributed on the surfaces of animal cells and in the extracellular matrix. It also mediates various physiologic and pathophysiologic processes. Difficulties in evaluating the role of heparin and heparan sulfate in vivo may be partly ascribed to ignorance of the detailed structure and sequence of these polysaccharides. In addition, the understanding of carbohydrate–protein interactions has lagged behind that of the more thoroughly studied protein–protein and protein–nucleic acid interactions. The recent extensive studies on the structural, kinetic, and thermodynamic aspects of the protein binding of heparin and heparan sulfate have led to an improved understanding of heparin–protein interactions. A high degree of specificity could be identified in many of these interactions. An understanding of these interactions at the molecular level is of fundamental importance in the design of new highly specific therapeutic agents. This review focuses on aspects of heparin structure and conformation, which are important for its interactions with proteins. It also describes the interaction of heparin and heparan sulfate with selected families of heparin-binding proteins. [1]

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The present study evaluates the effects of HMWH on formation of capillary-like tubular structures using CAM assay. UFH of 15 kDa enhances its formation in contrast to LMWH which is known to decrease the formation of tubular endothelial structures. Thus the present in ovo vivo study has demonstrated that heparin possesses the angiogenesis inducing affinity and is significant at 100 μM concentration. These data provide a novel mechanism by which higher molecular weight heparins can promote formation of capillary-like tubular structures and might be of therapeutic significance in inducing angiogenisis during wound healing process while the low molecular weight constituents can be employed to inhibit angiogenesis as in tumor progression.[3]

(C14H25NO20S3)N.XNA

6000-20000

241.14

9041-08-1

Heparin sodium salt;9041-08-1;Heparin Lithium salt;9045-22-1;Heparin;9005-49-6

118989588

White to off-white solid

>181°C (dec.)

0

73.2

2

6

6

16

162

0

O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O)[C@H](OC)[C@H](C(O)=O)O2)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H](OC)[C@@H]1NS(O)(=O)=O.[n].[.xNa]

YOMTXLQWRQUKAK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C9H20N3O3.Na/c13-4-1-10-7-11(2-5-14)9-12(8-10)3-6-15;/h13-14H,1-9H2;/q-1;+1

sodium;2-[3,5-bis(2-hydroxyethyl)-1,3,5-triazinan-1-yl]ethanolate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 25 mg/mL (Infinity mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。